2024年4月2日发(作者：段静枫)
ＬＥ Ｉ ＥＲ ・ ）ｌ２５Ｎ。．，Ｎｏｖ． ０・０ ｌ ＇￣ｏｖ Ｚ…ＵＩ４
，ＩｖＩ’
ＳＩＮＢ１０ＴＥＣＨＮ０Ｌ０ＧＹ Ｖ０１
．
技 术 通 讯…
８２１
ｄｏｉ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１４．０６．０１６
研究报告
肺炎支原体黏附蛋白Ｐ３０的高效表达及初步应用
王成红 ，于传亭 ，张奇舒 ，李鹏飞 ，王晓丹 ，修冰水 ，张贺秋
１．烟台市烟台山医院检验科，山东烟台２６４０００；２．军事医学科学院基础医学研究所，北京１００８５０
［摘要］ 目的：克隆表达肺炎支原体黏附蛋白Ｐ３０，为临床诊断试剂和疫苗研制打下基础。方法：采用大肠杆菌优势
密码子设计Ｐ３０蛋白优化基因序列，采用Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ软件评价设计基因的密码子适应指数（ＣＡＩ），并利用载体ｐＢＶＩＬ１
实现Ｐ３０优势表位基因在大肠杆菌中的表达，采用ＥＬＩＳＡ法对纯化的Ｐ３０抗原活性进行测定。结果：野生Ｐ３０基因的
ＣＡＩ为０．５９，优化Ｐ３０基因的ＣＡＩ为０．８４；在大肠杆菌中表达的ＩＬｌ—Ｐ３０融合蛋白的相对分子质量为４３．５ｘ１０３，纯化后
的重组抗原能与肺炎支原体感染者血清发生特异性免疫反应，灵敏度和特异性分别为８２．３５％和８９．３６％，ＲＯＣ曲线下
面积为０．９０８８。结论：采用密码子优化技术实现了肺炎支原体黏附蛋白Ｐ３０在大肠杆菌中的高效表达，获得的重组
Ｐ３０蛋白具有很好的抗原性，可用于肺炎支原体诊断试剂的研究。
［关键词］ 肺炎支原体；Ｐ３０黏附蛋白；优势密码子；原核表达
［中图分类号］Ｑ７８ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ １００９—０００２（２０１４）０６—０８２１—０３
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐ３０ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ—Ｈｏｎｇ ，ＹＵ Ｃｈｕａｎ—Ｔｉｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｑｉ—Ｓｈｕ。，
ＬＩ Ｐｅｎｇ—Ｆｅｉ。，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ—Ｄａｎ。，ＸＩＵ Ｂｉｎｇ—Ｓｈｕｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｈｅ—Ｑｉｕ
１．Ｙａｎｔａｉ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｙａｎｔａｉ ２６４０００；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ ００８５０；Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ．Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｂｓｓｂｘ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐ３０ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｍｙｃ＠ｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍｐ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
ｏｆ Ｍｐ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｐ３０ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｂｉｏｉｎ—
ｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｏｆ ｈｉｇｈ—ｕｓａｇｅ ｃｏｄｏｎｓ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ａｂｏｖｅ ｇｅｎｅ
ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＶＩＬ１，ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ
ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ（ＣＡＩ）ｏｆ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐ３０ ｇｅｎｅ ｗａｓ ０．８４．ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｗｉｌｄ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ＩＬｌ—Ｐ３０ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｗａｓ ４３．５ ｋＤ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ｂａｓｅｄ
ｏｎ Ｐ３０ ｗｅｒｅ ８２．３５％ａｎｄ ８９．３６％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ＡＵＣ ｏｆ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ０．９０８８ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｐ３０ ｏｆ Ｍｐ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｏｒ ｔｆｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｍｐ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｍｙｃｏｐｌ￣ｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｐ３０ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｐ）是儿 示Ｐ３０蛋白可以激起宿主的免疫反应 ，是除了黏附
童和青少年非典型肺炎的首要病原微生物－－ ，由其引 蛋白Ｐ１外的另一个重要的黏附素和免疫原。由于
起的临床症状同其他病原体相似，但临床用药并不
Ｍｐ采用的是偏性密码子，其野生基因不适合在大肠
相同口 ，因此，研制灵敏、特异、便捷的快速早期诊断 杆菌中进行表达。为此，我们利用生物信息学方法
试剂，对于Ｍｐ感染的诊断和治疗意义重大 。
年完成。Ｍ１２９基因组全长８１６ ｋｂ，编码超过４００个
功能蛋白 。其中Ｐ３０蛋白是锚定于Ｍｐ细胞膜上的
和密码子优化技术设计并获得优化的Ｍｐ黏附蛋白
肺炎支原体Ｍ１２９株的全基因测序工作于１９９６
Ｐ３０基因序列，实现了其在大肠杆菌中的高效表达。
１材料和方法
１．１材料
重要黏附蛋白，包含２７５个氨基酸残基，相对分子质
量约为２９．７×１０ ，其基因序列全长８２５ ｂｐ。研究显
收稿日期：２０１４—０６—２５
基金项目：国家重大科技专项（２０１３ＺＸ１０００４８０３）
作者简介：王成红（１９７６一）女，硕士研究生，主管技师
通信作者：修冰水，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｘｂｓｓｂｘ＠ｖｉｐ＿ｓｉｎａ．ｃｏｎ
Ｍｐ患者血清样本来自烟台山医院小儿科住院
病人，正常人血清样本来自烟台山医院体检中心。
Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶为北京百泰克生物技术有限
2024年4月2日发(作者：段静枫)
ＬＥ Ｉ ＥＲ ・ ）ｌ２５Ｎ。．，Ｎｏｖ． ０・０ ｌ ＇￣ｏｖ Ｚ…ＵＩ４
，ＩｖＩ’
ＳＩＮＢ１０ＴＥＣＨＮ０Ｌ０ＧＹ Ｖ０１
．
技 术 通 讯…
８２１
ｄｏｉ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１４．０６．０１６
研究报告
肺炎支原体黏附蛋白Ｐ３０的高效表达及初步应用
王成红 ，于传亭 ，张奇舒 ，李鹏飞 ，王晓丹 ，修冰水 ，张贺秋
１．烟台市烟台山医院检验科，山东烟台２６４０００；２．军事医学科学院基础医学研究所，北京１００８５０
［摘要］ 目的：克隆表达肺炎支原体黏附蛋白Ｐ３０，为临床诊断试剂和疫苗研制打下基础。方法：采用大肠杆菌优势
密码子设计Ｐ３０蛋白优化基因序列，采用Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ软件评价设计基因的密码子适应指数（ＣＡＩ），并利用载体ｐＢＶＩＬ１
实现Ｐ３０优势表位基因在大肠杆菌中的表达，采用ＥＬＩＳＡ法对纯化的Ｐ３０抗原活性进行测定。结果：野生Ｐ３０基因的
ＣＡＩ为０．５９，优化Ｐ３０基因的ＣＡＩ为０．８４；在大肠杆菌中表达的ＩＬｌ—Ｐ３０融合蛋白的相对分子质量为４３．５ｘ１０３，纯化后
的重组抗原能与肺炎支原体感染者血清发生特异性免疫反应，灵敏度和特异性分别为８２．３５％和８９．３６％，ＲＯＣ曲线下
面积为０．９０８８。结论：采用密码子优化技术实现了肺炎支原体黏附蛋白Ｐ３０在大肠杆菌中的高效表达，获得的重组
Ｐ３０蛋白具有很好的抗原性，可用于肺炎支原体诊断试剂的研究。
［关键词］ 肺炎支原体；Ｐ３０黏附蛋白；优势密码子；原核表达
［中图分类号］Ｑ７８ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ １００９—０００２（２０１４）０６—０８２１—０３
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐ３０ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ—Ｈｏｎｇ ，ＹＵ Ｃｈｕａｎ—Ｔｉｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｑｉ—Ｓｈｕ。，
ＬＩ Ｐｅｎｇ—Ｆｅｉ。，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ—Ｄａｎ。，ＸＩＵ Ｂｉｎｇ—Ｓｈｕｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｈｅ—Ｑｉｕ
１．Ｙａｎｔａｉ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｙａｎｔａｉ ２６４０００；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ ００８５０；Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ．Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｂｓｓｂｘ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐ３０ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｍｙｃ＠ｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍｐ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
ｏｆ Ｍｐ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｐ３０ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｂｉｏｉｎ—
ｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｏｆ ｈｉｇｈ—ｕｓａｇｅ ｃｏｄｏｎｓ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ａｂｏｖｅ ｇｅｎｅ
ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＶＩＬ１，ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ
ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ（ＣＡＩ）ｏｆ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐ３０ ｇｅｎｅ ｗａｓ ０．８４．ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｗｉｌｄ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ＩＬｌ—Ｐ３０ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｗａｓ ４３．５ ｋＤ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ｂａｓｅｄ
ｏｎ Ｐ３０ ｗｅｒｅ ８２．３５％ａｎｄ ８９．３６％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ＡＵＣ ｏｆ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ０．９０８８ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｐ３０ ｏｆ Ｍｐ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｏｒ ｔｆｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｍｐ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｍｙｃｏｐｌ￣ｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｐ３０ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｐ）是儿 示Ｐ３０蛋白可以激起宿主的免疫反应 ，是除了黏附
童和青少年非典型肺炎的首要病原微生物－－ ，由其引 蛋白Ｐ１外的另一个重要的黏附素和免疫原。由于
起的临床症状同其他病原体相似，但临床用药并不
Ｍｐ采用的是偏性密码子，其野生基因不适合在大肠
相同口 ，因此，研制灵敏、特异、便捷的快速早期诊断 杆菌中进行表达。为此，我们利用生物信息学方法
试剂，对于Ｍｐ感染的诊断和治疗意义重大 。
年完成。Ｍ１２９基因组全长８１６ ｋｂ，编码超过４００个
功能蛋白 。其中Ｐ３０蛋白是锚定于Ｍｐ细胞膜上的
和密码子优化技术设计并获得优化的Ｍｐ黏附蛋白
肺炎支原体Ｍ１２９株的全基因测序工作于１９９６
Ｐ３０基因序列，实现了其在大肠杆菌中的高效表达。
１材料和方法
１．１材料
重要黏附蛋白，包含２７５个氨基酸残基，相对分子质
量约为２９．７×１０ ，其基因序列全长８２５ ｂｐ。研究显
收稿日期：２０１４—０６—２５
基金项目：国家重大科技专项（２０１３ＺＸ１０００４８０３）
作者简介：王成红（１９７６一）女，硕士研究生，主管技师
通信作者：修冰水，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｘｂｓｓｂｘ＠ｖｉｐ＿ｓｉｎａ．ｃｏｎ
Ｍｐ患者血清样本来自烟台山医院小儿科住院
病人，正常人血清样本来自烟台山医院体检中心。
Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶为北京百泰克生物技术有限