2024年4月9日发(作者：戏雪晴)
植物组织抗氧化酶活的测定方法
（修订版2020年5月7日）
一、待测样品预处理
称取鲜样0.5g于预冷的研钵（提前放冰箱）中，加1mL预冷的磷酸缓冲液（0.05mol/L，
pH=7.8），冰浴研磨后再加1mL缓冲液，倒入离心管中，再用2mL缓冲液清洗研钵，倒入离
心管中，平衡，低温（0-4℃）离心20min（10500rpm），收集上清液，冷藏保存。
磷酸缓冲液配制：
A液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）的配制：称取Na
2
HPO
4
·2H
2
O 35.61g 或Na
2
HPO
4
·7H
2
O
53.65g 或Na
2
HPO
4
·12H
2
O 71.64g 用蒸馏水定容至1000mL。
B液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）的配制：称取NaH
2
PO
4
·H
2
O 27.6g 或NaH
2
PO4·2H
2
O
31.21g 用蒸馏水定容至1000mL。
磷酸缓冲液（0.05mol/L， pH=7.8）配制：45.75mL A + 4.25mL B定容至200mL。
磷酸缓冲液（0.1mol/L， pH=7.0）配制：61mL A + 39mL B定容至200mL。
磷酸缓冲液（100 mmol/L、pH 7.5）配制：84mL A + 16mL B定容至200mL。
磷酸缓冲液（50 mmol/L、pH7.5 ）配制：42mL A + 8mL B定容至200mL。
pH
x(mL)A
y(mL)B
5.8
8.0
92.0
6.0
12.3
87.7
6.5
31.5
68.5
6.8
49.0
51.0
7.0
61.0
39.0
7.5
84.0
16.0
7.6
87.0
13.0
7.7
89.5
10.5
7.8
91.5
8.5
7.9
93.0
7.0
8.0
94.7
53
二、SOD（超氧化物歧化酶）活力测定——氮蓝四唑（NBT）法
1.1 原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在于动､植物体内，是一种清除超氧阴
离子自由基的酶，它催化下列反应：
酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在
有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧
阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大
。本反应产物H
2
O
2
可由过氧化氢
吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是，光还原反应后，反
应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小｡
1.2 试剂配制
2.2.1 磷酸缓冲液配制
A：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（A液）的配制：称取Na
2
HPO
4
·2H
2
O 35.61g 或Na
2
HPO
4
·7H
2
O
53.65g 或Na
2
HPO
4
·12H
2
O 71.64g 用蒸馏水定容至1000mL。
B：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（B液）的配制：称取NaH
2
PO
4
·H
2
O 27.6g 或NaH
2
PO4·2H
2
O
31.21g 用蒸馏水定容至1000mL。
2.2.2 反应液的配制（测定前现配现用）
反应液——水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na
2
：FD（核黄素）=5:30:6:6:6:6；
49mL 反应液组成：水5mL，50mM磷酸缓冲液30mL，Met 6 mL， NBT 6 mL， EDTA-Na
2
6 mL，FD 6 mL。
其中：
① 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液的配制：称取1.9399g Met 用pH7.8 磷酸缓冲液定
容至100mL，摇匀备用。
② 750umol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液的配制：称取0.06133g NBT用pH7.8 磷酸缓冲液
定容至100mL，摇匀备用，避光保存。
③ 100µmol/L EDTA-Na
2
溶液的配制：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至
1000mL，摇匀备用｡
④ 20 µmol/L核黄素溶液： 称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL，摇匀，避光
保存｡
1.3 方法
取相同型号的试管，试管中加入50µL上清液 （空白对照加磷酸缓冲液50µL），分别加
3mL反应液，其中2支对照试管置于暗处，其余各管于4000lx 日光下反应20-30min（要求各
管受光情况一致，温度高时反应时间短，温度低时延长），反应结束后，以不照光的对照试管
作空白，于560nm下比色测定吸光度值。
计算公式： 以抑制NBT光化学还原50%所需酶量为1个酶活单位（U），按下式计算
SOD活性。
2024年4月9日发(作者：戏雪晴)
植物组织抗氧化酶活的测定方法
（修订版2020年5月7日）
一、待测样品预处理
称取鲜样0.5g于预冷的研钵（提前放冰箱）中，加1mL预冷的磷酸缓冲液（0.05mol/L，
pH=7.8），冰浴研磨后再加1mL缓冲液，倒入离心管中，再用2mL缓冲液清洗研钵，倒入离
心管中，平衡，低温（0-4℃）离心20min（10500rpm），收集上清液，冷藏保存。
磷酸缓冲液配制：
A液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）的配制：称取Na
2
HPO
4
·2H
2
O 35.61g 或Na
2
HPO
4
·7H
2
O
53.65g 或Na
2
HPO
4
·12H
2
O 71.64g 用蒸馏水定容至1000mL。
B液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）的配制：称取NaH
2
PO
4
·H
2
O 27.6g 或NaH
2
PO4·2H
2
O
31.21g 用蒸馏水定容至1000mL。
磷酸缓冲液（0.05mol/L， pH=7.8）配制：45.75mL A + 4.25mL B定容至200mL。
磷酸缓冲液（0.1mol/L， pH=7.0）配制：61mL A + 39mL B定容至200mL。
磷酸缓冲液（100 mmol/L、pH 7.5）配制：84mL A + 16mL B定容至200mL。
磷酸缓冲液（50 mmol/L、pH7.5 ）配制：42mL A + 8mL B定容至200mL。
pH
x(mL)A
y(mL)B
5.8
8.0
92.0
6.0
12.3
87.7
6.5
31.5
68.5
6.8
49.0
51.0
7.0
61.0
39.0
7.5
84.0
16.0
7.6
87.0
13.0
7.7
89.5
10.5
7.8
91.5
8.5
7.9
93.0
7.0
8.0
94.7
53
二、SOD（超氧化物歧化酶）活力测定——氮蓝四唑（NBT）法
1.1 原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在于动､植物体内，是一种清除超氧阴
离子自由基的酶，它催化下列反应：
酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在
有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧
阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大
。本反应产物H
2
O
2
可由过氧化氢
吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是，光还原反应后，反
应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小｡
1.2 试剂配制
2.2.1 磷酸缓冲液配制
A：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（A液）的配制：称取Na
2
HPO
4
·2H
2
O 35.61g 或Na
2
HPO
4
·7H
2
O
53.65g 或Na
2
HPO
4
·12H
2
O 71.64g 用蒸馏水定容至1000mL。
B：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（B液）的配制：称取NaH
2
PO
4
·H
2
O 27.6g 或NaH
2
PO4·2H
2
O
31.21g 用蒸馏水定容至1000mL。
2.2.2 反应液的配制（测定前现配现用）
反应液——水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na
2
：FD（核黄素）=5:30:6:6:6:6；
49mL 反应液组成：水5mL，50mM磷酸缓冲液30mL，Met 6 mL， NBT 6 mL， EDTA-Na
2
6 mL，FD 6 mL。
其中：
① 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液的配制：称取1.9399g Met 用pH7.8 磷酸缓冲液定
容至100mL，摇匀备用。
② 750umol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液的配制：称取0.06133g NBT用pH7.8 磷酸缓冲液
定容至100mL，摇匀备用，避光保存。
③ 100µmol/L EDTA-Na
2
溶液的配制：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至
1000mL，摇匀备用｡
④ 20 µmol/L核黄素溶液： 称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL，摇匀，避光
保存｡
1.3 方法
取相同型号的试管，试管中加入50µL上清液 （空白对照加磷酸缓冲液50µL），分别加
3mL反应液，其中2支对照试管置于暗处，其余各管于4000lx 日光下反应20-30min（要求各
管受光情况一致，温度高时反应时间短，温度低时延长），反应结束后，以不照光的对照试管
作空白，于560nm下比色测定吸光度值。
计算公式： 以抑制NBT光化学还原50%所需酶量为1个酶活单位（U），按下式计算
SOD活性。