2024年4月10日发(作者：睦翰采)
N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移
沈秀莲;逯宜超;甲芝莲;吴强
【摘 要】在大脑皮层发育过程中,神经元迁移是一个动态的复杂过程,与细胞骨架构建
和重塑的调控息息相关.N-WASP 蛋白是 Wiskott-Aldrich 综合征蛋白家族(WASP-WAVE
family)的一个重要成员,又名 WAS-like 蛋白(WASL),直接参与细胞骨架中肌动蛋白丝状分
支的动态调控.本研究通过蛋白免疫印迹检测发现 N-WASP 表达于小鼠胚胎发育时期
(E12.5~E18.5)的大脑皮层中,并且其表达水平随着发育逐渐降低.利用在体子宫内胚胎电转
实验,结果发现过表达或者敲低 N-WASP 均会造成不同程度的大脑皮层神经元迁移障碍,
说明 N-WASP在大脑皮层神经元迁移中起到关键作用.N-WASP蛋白主要包含4个结构
域:WH1、GBD、polyPro和 VCA.为进一步研究N-WASP各结构域在神经元迁移中的调
控功能,设计了一系列的显性负性突变实验.通过过表达结构域删除的N-WASP蛋白,发现
△polyPro、△VCA和△WH1均能造成神经元迁移障碍.但是,过表达不能结合 Cdc42的 N-
WASP蛋白(H208D突变体)却不能造成明显的神经元迁移障碍.另外,单独过表达 N-
WASP的结构域polyPro或VCA能够造成神经元迁移障碍,而过表达WH1结构域却不能
影响迁移.最后,通过过表达polyPro和VCA结构域同时删除的N-WASP (WH1-GBD),发
现WH1-GBD结构域对神经元迁移没有明显影响.上述结果表明N-WASP蛋白主要是通
过polyPro和VCA两个结构域调控大脑皮层神经元的迁移过程.%Cortical neuron
migration in the developing mouse forebrain is a complex process, which
contains several steps related to cytoskeleton dynamics and remodeling. Neural
Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP), a member of the WASP-WAVE
family, regulates actin cytoskeleton reorganization through the binding of its VCA
domain to the Arp2/3 we report expression patterns of N-WA S P
gene in the mouse developing embryonic cortex(E12.5~E18.5) and find its
expression levels are decreased during embryonic development. By using in utero
electro-poration (IUE) method, we find that either N-WASP overexpression or
knockdown impairs cortical neuron migration, and the defects of cortical neuron
migration caused by N-WASP overexpression are much more severe than that by
its knock-down. N-WASP protein contains four domains: WH1, GBD, polyPro, and
VCA. We generated a series of dominant negative N-WASP mutants by modifying
these domains. Overexpression of N-WASP mutant lacking domain polyPro, VCA,
or WH1, impairs cortical neuron migration. However, overexpression of N-WASP
with the H208D point mutation, which abolishes the Cdc42 binding to N-WASP,
causes only a marginal defect of cortical neuron migration. Finally, overexpression
of the individual domain polyPro or VCA, but not WH1, can recapitulate the
defects by N-WASP overexpression. However, overexpression of WH1-GBD
fragment has no apparent effect on cortical neuron migration. In conclusion, our
data demon-strate that N-WASP regulates cortical neuron migration mainly
through its polyPro and VCA domains.
【期刊名称】《遗传》
【年(卷),期】2018(040)005
【总页数】12页(P390-401)
【关键词】大脑皮层神经元迁移;N-WASP;子宫内胚胎电转技术;肌动蛋白细胞骨架动
态
【作 者】沈秀莲;逯宜超;甲芝莲;吴强
【作者单位】上海交通大学系统生物医学研究院比较生物医学研究中心,系统生物医
学教育部重点实验室,上海 200240;上海交通大学系统生物医学研究院比较生物医学研究
中心,系统生物医学教育部重点实验室,上海 200240;上海交通大学系统生物医学研究院比
较生物医学研究中心,系统生物医学教育部重点实验室,上海 200240;上海交通大学系统生
物医学研究院比较生物医学研究中心,系统生物医学教育部重点实验室,上海 200240
【正文语种】中 文
人类大脑皮层是进化上最晚出现、结构上最为复杂的脑部结构[1]，其在脑的高级认
知或执行功能(cognition or executive function)中发挥着重要作用。大脑皮层的发育涉
及一系列复杂的过程，包括神经元的增殖(proliferation)、迁移(migration)和分化
(differentiation)等。大脑皮层是由出生于脑室区(ventricular zone, VZ)的兴奋性神经
元前体和出生于皮质下区(subpallium)的抑制性神经元前体，分别通过放射状(radial
migration)和切线状(tangential migration)并以先到内侧后到外侧(inside-out)模式迁移
形成的板层结构(laminar structure)[2~7]。其中，兴奋性神经元前体放射状迁移模式是
一个非常复杂的动态协同调控过程：首先，脑室区(ventricular zone, VZ)的神经祖细胞通
过不对称分裂产生中间祖细胞(transit amplifying intermediate neuronal progenitor
cells)；然后，这些祖细胞在脑室下区(subventricular zone, SVZ)继续分裂1~3次后，
再以多极状态在中间区(intermediate zone, IZ)中迁移；最后，祖细胞转变成双极状态
沿着神经胶质细胞纤维以放射状迁移的方式到达皮质区(cortical plate, CP)[8~10]。该过
程需要多种信号通路协同调控细胞骨架的动态平衡来完成[4]，其正常进行对于后续神经
元回路以及神经系统功能的正常发挥起着重要作用。而且，人们发现神经元迁移异常能够
导致多种神经精神疾病，因此研究其分子调控机制对于了解精神疾病的发生原因有着重要
意义[1]。
原钙粘蛋白介导的细胞粘连与神经元迁移和神经细胞多样性密切相关[11~14]。原钙
粘蛋白家族在神经元树突和轴突发育中也起到关键作用[15~20]。最近的研究发现原钙粘
蛋白可能与WASP-WAVE (Wiskott- Aldrich syndrome protein and WASP-family
verprolin- homologous protein)信号通路有关[13,21]。WASP是Wiskott-Aldrich综
合征(WAS)的致病基因[22]，该疾病是一种包括湿疹(eczema)在内的性染色体连锁的隐性
免疫缺陷疾病[23,24]。WASP蛋白家族共包含11个成员，该家族与肌动蛋白的动态调控
有关[25]，在各种生理和病理过程中对诸如胞吞(endocytosis)、胞吐(exocytosis)、丝状
伪足(filopodia)、板状伪足(lamellipodia)、侵袭伪足(invadopodia)等细胞形态的调控
起到关键作用[26]。细胞接收外界信息通过复杂的信号传递通路最终汇集到Arp2/3复合
体(actin-related protein 2/3 complex)上，然后调控肌动蛋白丝状分支的动态组装，此
动态组装对于神经元迁移以及神经细胞的形态发生也是非常重要的[27,28]。
N-WASP(neural-Wiskott-Aldrich syndrome protein)是WASP-WAVE家族成员之
一[25]，最初发现于牛(Bos taurus)的脑提取物中，因其与WASP氨基酸序列的高度相似
性，故命名为N-WASP(神经性WASP)[29]。它是一个广泛表达的蛋白，不仅在大脑中有
丰富的表达，而且在心脏、肺等其他组织中也有表达[29]。N-WASP蛋白主要含有4个
功能性结构域：WH1 (WASP homology 1)、GBD (GTPase-binding domain)、
polyPro (proline-rich SH3-adaptor-binding region)和VCA (verprolin and cofilin
homology regions and the acidic domain)[30]。研究已证实，WH1结构域与N-
WASP被招募到肌动蛋白组装的位点有关[31]，而GBD、polyPro和VCA这3个结构域
主要调控N-WASP蛋白的活性状态[25,30]。N-WASP主要通过构象转换
(conformational change)释放出VCA结构域激活Arp2/3复合体来调控肌动蛋白的组装
[32]。具体来讲，N-WASP有激活和未激活两种构象状态：在未激活构象状态下，N-
WASP的GBD结构域和VCA结构域相互作用而使VCA结构域被掩藏，不能与肌动蛋白
单体和Arp2/3复合体相互作用；在激活构象状态下，VCA结构域被暴露出来并与
Arp2/3复合体相互作用，verprolin结构域上结合的肌动蛋白单体输送到肌动蛋白丝状分
支，从而促进肌动蛋白的组装[30,33]。一些上游的信号分子可以激活N- WASP，使其释
放出VCA结构域。例如，Cdc42 (cell division cycle 42)通过结合GBD结构域而释放出
VCA结构域；Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2)，Nck(non-catalytic
region of tyrosine kinase adaptor protein)等含有SH3(Src homology 3)结构域的接
头蛋白(adaptor proteins)则通过与polyPro结构域相互作用，从而解除这种自抑制状态，
释放VCA结构域[34~38]。最后，N-WASP通过形成二聚体或寡聚体进一步激活
Arp2/3复合体，从而达到最大的活性[30,39]。
N-WASP敲除会导致小鼠(Mus musculus)胚胎致死并伴随神经管形成缺陷[40]，在
小鼠大脑中条件性敲除N-WASP会导致脑积水的症状[41]，说明N-WASP在小鼠大脑的
发育中起着重要作用。此外，之前有报道称mDab1 (mouse disabled homologue1)基
因突变会导致小鼠大脑皮层发育异常，造成皮层的异位，与摇晃蛋白Reelin基因敲除小
鼠表型一致[42]。而体外细胞实验显示mDab1可与N-WASP相互作用诱导丝状伪足
(filopodia)的生成[43]，说明N-WASP可能在神经元迁移中起重要作用，但至今未见有
直接的证据。
本研究利用蛋白免疫印迹(Western blot, WB)检测发现N-WASP在小鼠大脑皮层的
发育过程中持续表达并且呈现逐渐下降的模式，然后采用在体子宫内胚胎电转技术在
E14.5的小鼠大脑皮层神经元中过表达与敲低N-WASP，实验结果均表明会造成神经元迁
移障碍，而且过表达N-WASP所导致的神经元迁移障碍会比敲低N-WASP产生的影响
更严重。此外，通过在体子宫内胚胎电转技术过表达显性负性突变蛋白，发现过表达
DVCA，DpolyPro或者DWH1突变体，以及VCA或者polyPro结构域均会导致神经元
迁移障碍，而过表达WH1，WH1-GBD结构域以及H208D突变体却对神经元迁移没有
明显影响。这些实验结果表明N-WASP主要是通过polyPro和VCA结构域的协调作用
来调控大脑皮层的神经元迁移。
C57BL/6小鼠(南方模式动物中心)；HEK293T细胞(上海细胞库)；N-WASP抗体
(Abcam公司，英国)；b-actin抗体、抗鼠以及抗兔二抗(Proteintech公司，美国)；
DNA质粒中抽试剂盒Compactprep Plasmid Midi Kit(25)(Qiagen公司，德国)；固绿
FCF (Fast Green FCF)、戊巴比妥钠(Sigma公司，美国)；Stbl3大肠杆菌菌株、脂质体
LipofectamineTM3000以及ProlongTM Gold antifade reagent(Invitrogen公司，美
国)；逆转录试剂盒Reverse Transcription System (Promega公司，美国)；电转仪
(Bio-Rad，美国)；自动震荡切片机(Leica，德国)；共聚焦显微镜(Leica，德国)；
Western blot全套装置(Bio-Rad，美国)；荧光显微镜(Zeiss，德国)。
全长的N-WASP cDNA (GenBank 318416)是通过提取小鼠大脑总RNA再经
过逆转录PCR (RT-PCR)获得，并被克隆到pCAG-Myc载体中，其突变体WH1,
DWH1,WH1-GBD, H208D, DVCA, VCA, DpolyPro, polyPro通过设计突变引物由全长
N-WASP突变得到。用于敲低实验的短发夹环RNA (shRNA)编码序列是克隆到pLKO.1
载体(Sigma)上的。实验所用引物序列列于表1。
HEK293T细胞的培养基是DMEM(10% FBS, 100 mg/mL青霉素/链霉素双抗)，首
先使用不含抗生素的培养基培养HEK293T细胞，待细胞密度达到70%~90% (大约24 h)
即可使用LipofectamineTM 3000进行细胞转染，24 h后换液，48 h后裂解细胞收取蛋
白，进行Western blot实验。
配制10%分离胶(10 mL)：3.97 mL MilliQ水，3.33 mL 30%Arc-Bis，2.5 mL 1.5
mol/L Tris-HCl(pH = 8.8)，100 mL 10%SDS，100 mL 10%过硫酸铵，4 mL四甲基乙
二胺(TEMED)；4%浓缩胶(4 mL)：2.39 mL MilliQ水，0.53 mL 30%Arc-Bis，1 mL
0.5 mol/L Tris-HCl (pH = 6.8)，40 mL 10% SDS，40 mL 10%过硫酸铵，4 mL四甲基
乙二胺(TEMED)；将样品与SDS-PAGE上样缓冲液按比例混合好，95℃变性5 min后加
入上样孔中；电泳：80 V，30 min；110 V，120 min；电泳完毕后，根据蛋白Marker
大小，将包含目的蛋白的PAGE胶切下：110 V，105 min将蛋白转至NC膜上；转膜完
毕后，将膜放入适量的封闭液(5%的脱脂牛奶)中，室温孵育1 h；倒掉封闭液，加入一抗，
4℃孵育过夜；将膜加入1×TBST溶液中，室温下洗膜5 min，重复4次；加入二抗，室
温孵育1 h；将膜放入1×TBST溶液中，室温下洗膜5 min，重复4次；最后用
Odyssey双色红外激光成像系统扫膜成像。
C57BL/6J小鼠的饲养环境为23℃恒温，12 h (7：00~19：00)光照和12 h (19：
00~7：00)黑暗。所有的小鼠实验均符合Institutional Animal Care and Use
Committee的规定。取成年的雌性与雄性小鼠于下午16：00后进行合笼，第二天上午
12：00前检查雌鼠有没有阴道栓，如果有阴道栓就将时间记为胚胎期(embryonic day
0.5: E0.5)。
E14.5时，向怀孕的母鼠腹腔注射0.6%的戊巴比妥钠进行麻醉，期间配制注射的质
粒混合物[pCAG- Myc质粒(2.5 mg/mL)或者pLKO.1质粒(4 mg/mL)、eGFP质粒(0.5
mg/mL)以及0.3% Fast green]。
将母鼠放在加热板上，用剪刀将母鼠腹部的毛剃干净，再用酒精与碘酒进行消毒。将
母鼠腹部剪开一个口子，再将一块灭菌的纱布剪开一个口子并将其放于母鼠腹部开口处，
将子宫取出放在纱布上，并加0.9%的NaCl溶液于胚胎上。然后向胚胎脑室注射配制好
的质粒混合物，使用含有钳片电极的电转仪将质粒转到胚胎大脑皮层脑室区的神经祖细胞
中。电转使用的程序为电压37 V，持续时间50 ms，间隔900 ms，5次。
将子宫放回母鼠腹腔中并加1 mL 0.9%的NaCl溶液，缝合好伤口后将母鼠放在恒温
板上，待母鼠醒来后放回饲养笼盒，继续饲养。
E17.5时，将胎鼠的头部剪下，在显微镜下操作取出大脑，放入含有4% PFA的离心
管中，放于摇床上室温孵育24 h进行固定。
使用自动震荡切片机切出50 mm的脑片，用DAPI进行细胞核染色，再用1×PBS
清洗3次，然后将脑片放在载玻片上，用封片剂封好。
使用共聚焦显微镜获取处理好的脑片图像。
RNA-seq数据分析：数据下载于ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements)数据
库[44]，经Cufflinks 2.1.1处理计算分析得到基因表达水平数值。文中使用的数据Gene
Expression Omnibus (GEO)序列号：GEO:GSE82852，GEO:GSE78340，
GEO:GSE78323，GEO:GSE78374。
数据分析使用GraphPad Prism 5.0软件，各组间平均值差异程度的检验方法用
Student’s t test或者One-way ANOVA进行检验分析。
已有研究报道，N-WASP蛋白的表达在出生后的大鼠皮层中是逐渐增加的，并在出
生后16周维持稳定[45]，同时有文献报道其对于神经突起的延伸以及突触发生有重要作
用[46~48]，说明N-WASP在大脑发育中起着重要的作用，但N-WASP在小鼠胚胎期大
脑皮层发育过程中的具体表达情况却未见相关报道。本研究首先提取了不同时期(E12.5、
E14.5、E16.5、E18.5和P1)的小鼠大脑皮层组织进行免疫印迹实验检测蛋白表达水平，
发现N-WASP蛋白在胚胎期皮层有表达，并随着胚胎发育呈现下降的模式(图1A)。然后
从ENCODE数据库中下载了小鼠(C57BL/6)前脑(forebrain)在不同时期(E12.5、E14.5、
E16.5和P0)的RNA-seq数据[44]，使用Cufflinks 2.1.1对其进行分析，发现N-WASP
在mRNA水平上有表达并且随着发育过程呈现下降的模式(图1B)，该结果与蛋白免疫印
迹实验一致。
N-WASP蛋白在小鼠大脑皮层的表达从E12.5到P1呈现逐渐下降的模式，其表达量
高的时期与大脑皮层神经元迁移的时间段(E11~E16)吻合，预示其可能参与调控神经元的
迁移。由此，设计了2个不同的shRNA进行在体胚胎电转敲低实验。首先，通过WB检
验了shRNA的效率，发现它们能有效敲低N-WASP蛋白的表达水平(图2A)。然后，利
用子宫内胚胎电转技术，将shRNA表达质粒转入E14.5的胎鼠大脑皮层神经祖细胞中，
在E17.5时取脑并切片观察。与对照组相比，发现N-WASP敲低会造成小鼠大脑皮层神
经元的迁移缺陷(图2B)。
为进一步研究N-WASP调控神经元迁移的具体功能，构建了N-WASP真核过表达
质粒，然后通过子宫内胚胎电转技术将该质粒转入E14.5的胎鼠大脑皮层神经祖细胞中，
同样在E17.5时切片观察。与对照组相比，发现过表达N-WASP也会造成小鼠大脑皮层
神经元的迁移缺陷(图2C)。并且，过表达N-WASP造成的神经元迁移障碍比敲低N-
WASP所造成的神经元迁移障碍更加显著(图2：B，C)。
上述结果说明，N-WASP过表达或敲低均会造成神经元迁移障碍，表明其在神经元
迁移中起着重要作用。
N-WASP主要通过VCA结构域结合活化的肌动蛋白以及Arp2/3复合体引起肌动蛋
白组装[32]，其在未激活的情况下处于自抑制的状态(GBD与VCA相互作用)，需要上游
信号Cdc42激活并打开这种自抑制状态，进而引起肌动蛋白的组装[25,33]。N-WASP除
了通过上述经典的GTPase激活通路之外，还可以通过polyPro结构域与含有SH3结构
域的接头蛋白结合进行激活[25]，而它的WH1结构域主要与WIP (WASP-interacting
protein)家族相互作用，该作用与N-WASP招募到肌动蛋白组装的地点有关[31]。
为更加深入研究N-WASP调控神经元迁移的分子机制，首先构建了VCA结构域删除
(ΔVCA)、polyPro结构域删除(ΔpolyPro)、WH1结构域删除(ΔWH1)以及破坏了Cdc42
结合位点[34](H208D突变体)的N-WASP蛋白表达质粒(图3A)。然后通过子宫内胚胎电
转技术，将这些质粒分别转到E14.5的大脑皮层中，在E17.5时切片观察。结果发现单独
过表达ΔVCA、ΔpolyPro或者ΔWH1的N-WASP蛋白均会造成严重的神经元迁移障碍，
而过表达H208D突变的N-WASP蛋白却没有造成明显的神经元迁移障碍(图3B)。最后，
利用构建的VCA结构域过表达质粒(VCA)、polyPro结构域过表达质粒(polyPro)、WH1
结构域过表达质粒(WH1)、WH1-GBD结构域(同时删除polyPro和VCA结构域)过表达
质粒(WH1-GBD)(图3A)，进行了类似的子宫内胚胎电转实验。结果表明单独过表达VCA
蛋白或polyPro蛋白均会造成严重的神经元迁移障碍，但是过表达WH1蛋白或WH1-
GBD蛋白对神经元迁移没有明显影响(图3C)。
综上所述，N-WASP是通过VCA结构域激活下游信号通路来调控神经元迁移，并且
主要通过polyPro结构域接收上游信号调控神经元迁移，而Cdc42激活N-WASP进而
打开VCA的这条信号通路只是部分参与对神经元迁移的调控。此外，WH1结构域可能不
参与N-WASP对神经元迁移的调控。
大脑皮层的正常发育对于其执行记忆、学习和感觉的功能是非常重要的，其中神经元
迁移是大脑皮层发育中的一个重要过程。神经元迁移是一个高度动态化的协同调控过程，
通过细胞骨架中肌动蛋白的动态组装影响神经元前体的形态进而调控神经元迁移[28]。
WASP家族中的WAVE蛋白和其他4个蛋白可形成一个五聚体复合物(pentameric
WAVE regulatory complex, WRC)，然后被大约120种膜蛋白招募到细胞膜附近，进而
引起肌动蛋白的组装[21]。这些膜蛋白包括很多原钙粘蛋白(protocadherin, PCDH)、
Celsr3 (cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3)、Fat3 (FAT atypical
cadherin 3)等[18,21]。原钙粘蛋白通过抑制Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase 2)的活
性而激活Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)来调控神经元的树突与树
突棘的形态生成[16]。此外，N-WASP能够调节神经元突起(neurites)以及突起的生长锥
导向[49,50]，然而其在神经元迁移中的功能和机制依然是不清楚的。
本研究使用在体子宫内胚胎电转技术研究N-WASP蛋白在小鼠大脑皮层神经元迁移
中所起的作用，发现N-WASP调控神经元迁移主要依赖于polyPro和VCA结构域。通
过提取不同时期的胚胎大脑皮层组织(E12.5、E14.5、E16.5、E18.5和 P1) 进行蛋白免疫
印迹实验以及分析胚胎发育不同时期前脑(E12.5、E14.5、E16.5和P0)的RNA-seq数据，
发现在胚胎时期的大脑皮层发育过程中，N-WASP在mRNA和蛋白质水平上均有表达，
并且其表达随着大脑发育逐渐下降。然后通过在体子宫内胚胎电转技术过表达和敲低N-
WASP，发现过表达和敲低N-WASP均造成神经元迁移障碍，说明其在调控神经元迁移
中可能起到了重要作用。本研究观察到敲低N-WASP的表型没有过表达明显，这可能是
因为N-WASP没有被完全敲除。
先前研究表明，Lis1 (lissencephaly-1)过表达对神经元迁移没有明显影响，而Lis1
敲低会导致神经元迁移障碍[8,51]；双皮质素(doublecortin, DCX)过表达会促进神经元迁
移，而双皮质素敲低会阻止神经元迁移[8,52]。有趣的是，本研究发现过表达和敲低N-
WASP均会造成神经元迁移障碍。神经元迁移是一个高度动态的过程，需要肌动蛋白骨架
动态调控，所以N-WASP的表达量的平衡对这一过程显得非常重要。此外，有报道称在
患有癫痫的人脑组织中N-WASP的表达量高于正常水平[53]，预示N-WASP的表达量过
多产生的病理学效应可能参与了疾病的进程。
N-WASP在未激活时通过分子内的GBD与VCA相互作用保持自抑制状态。在激活
时，其通过接收上游信号刺激释放出VCA结构域，暴露出来的VCA结构域通过激活
Arp2/3复合体来引起肌动蛋白的动态化组装。本研究表明在正常的大脑皮层发育状态下，
N-WASP蛋白可能参与调控神经元迁移，而且其表达量的平衡对神经元的迁移也是至关
重要的。进一步的研究结果表明分别过表达VCA结构域和DpolyPro (含有VCA结构域)
突变体均会造成神经元迁移障碍，说明VCA结构域可能竞争性抑制内源的N-WASP蛋白
发挥作用。同理，分别过表达polyPro结构域和DVCA (含有polyPro结构域)突变体均
会造成神经元迁移障碍，说明polyPro结构域也可能竞争性抑制内源的N-WASP蛋白发
挥作用。推测这些突变体可能竞争性地结合了一些与内源N-WASP相互作用的蛋白(如含
有SH3功能域的接头蛋白)，从而抑制内源的N-WASP发挥作用。与此同时，过表达
WH1-GBD结构域(不含有polyPro和VCA结构域)却对神经元迁移没有明显影响。总之，
这些结果说明N-WASP的polyPro和VCA结构域参与调控神经元迁移，可能是通过
polyPro结构域接收上游信号释放出VCA结构域，再激活Arp2/3复合体影响肌动蛋白
的组装进而调控神经元迁移。
N-WASP的WH1结构域主要与WIP家族蛋白相互作用，其GBD结构域主要通过
与Cdc42 GTPase结合接收上游信号。本研究发现过表达WH1结构域对神经元迁移没有
明显影响，而过表达DWH1则会造成严重的神经元迁移障碍，说明过表达WH1结构域
不能竞争性抑制内源的N-WASP蛋白发挥作用，而DWH1(含有polyPro和VCA结构域)
依然能够竞争性抑制内源的N-WASP蛋白发挥作用，可能是因为N-WASP调控神经元
迁移不需要WH1结构域的参与。之前有报道称N-WASP通过WH1结构域参与调控上
皮细胞之间连接的肌动蛋白骨架，而经典的VCA结构域并不参与其中，这种调控作用主
要是通过WH1结构域维持肌动蛋白组装后的稳定性[54]。此结论与本文的研究结果相一
致，因为神经元迁移是一个时刻在变化的过程，其需要肌动蛋白组装的动态平衡来形成合
适的细胞骨架网络，而细胞骨架网络对于神经细胞的形态至关重要。N-WASP的WH1
结构域可能更侧重于影响肌动蛋白组装后的静态稳定性，而不是调控肌动蛋白的动态组装
[54]。此外，本研究还发现过表达H208D突变的N-WASP对神经元迁移有影响，但并
非像其他突变体产生明显的影响。由于H208D突变的N-WASP不能结合Cdc42，因此
推测Cdc42激活N-WASP引起肌动蛋白的动态调控可能参与了神经元迁移，但并不是主
要的信号通路。
N-WASP在参与信号通路发挥作用时，需要从未激活状态转变成激活状态。N-
WASP的高度激活需要两个步骤，首先通过接收上游信号分子(如Cdc42或含有SH3结
构域的接头蛋白)的激活进行变构调节，释放出VCA结构域结合Arp2/3复合体，然后通
过连接蛋白使得N-WASP进行二聚化或者寡聚化增加与Arp2/3复合体的亲和性来调控
肌动蛋白的组装[39]。结合最近的研究发现一个VCA结构域结合Arp2/3复合体的背面
而另一个VCA结构域结合该复合体的底面[55]，本文提出一个可能的N-WASP调控神经
元迁移的模型：Cdc42和含有SH3结构域的蛋白可能协同结合N-WASP蛋白使其进行
变构释放出VCA结构域，再通过多价的含有SH3结构域的蛋白结合polyPro结构域使得
N-WASP进行二聚化或者寡聚化，最终激活肌动蛋白的组装调控神经元的迁移(图4)。
综上所述，本研究发现N-WASP在大脑皮层神经元前体放射状迁移中起到重要作用，
并且其主要是通过polyPro和VCA结构域动态调控细胞骨架中肌动蛋白丝状分支的构建
影响神经元迁移。
【相关文献】
[1] Wang S, Xu ZH. Progress in the study of molecular mechanisms of
developmental cortex malformations. Chin J Cell Biol, 2011, 33(8): 837–846. 王硕,
许执恒. 大脑皮层发育畸形及分子遗传机理研究进展. 中国细胞生物学学报, 2011, 33(8):
837–846.
[2] Angevine JB Jr, Sidman RL. Autoradiographic study of cell migration
during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature, 1961, 192: 766–768.
[3] Marín O, Rubenstein JL. Cell migration in the forebrain. Annu Rev
Neurosci, 2003, 26: 441–483.
[4] Marín O, Valiente M, Ge XC, Tsai LH. Guiding neuronal cell migrations.
Cold Spring Harb Perspect Biol, 2010, 2(2): a001834.
[5] Ayala R, Shu TZ, Tsai LH. Trekking across the brain: the journey of
neuronal migration. Cell, 2007, 128(1): 29–43.
[6] Huang Z. Molecular regulation of neuronal migration during neocortical
development. Mol Cell Neurosci, 2009, 42(1): 11–22.
[7] Tissir F, Goffinet AM. Shaping the nervous system: role of the core
planar cell polarity genes. Nat Rev Neurosci, 2013, 14(8): 525–535.
[8] LoTurco JJ, Bai JL. The multipolar stage and disruptions in neuronal
migration. Trends Neurosci, 2006, 29(7): 407–413.
[9] Lui JH, Hansen DV, Kriegstein AR. Development and evolution of the
human neocortex. Cell, 2011, 146(1): 18– 36.
[10] Tabata H, Nakajima K. Multipolar migration: the third mode of radial
neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci, 2003, 23(31):
9996–10001.
[11] Li W, Wu Q. Protocadherin and the diversity of neurons. Sci Technol
Vision, 2013, (27): 14. 李伟, 吴强. 原钙粘蛋白分子与神经元的多样性. 科技视界, 2013,
(27): 14.
[12] Ying GX, Wu S, Hou RQ, Huang W, Capecchi MR, Wu Q. The
protocadherin gene Celsr3 is required for interneuron migration in the mouse
forebrain. Mol Cell Biol, 2009, 29(11): 3045–3061.
[13] Peek SL, Mah KM, Weiner JA. Regulation of neural circuit formation by
protocadherins. Cell Mol Life Sci, 2017, 74(22): 4133–4157.
[14] Wu Q, Li W. From human genome to the development of brain: the
regulation and function of protocadherin in the development of brain. In: Qiao ZD,
He L, ed. The Enlightment of the Frontier Life. Beijing: Science Press, 2016: 461–
477. 吴强, 李伟. 从人类基因组到大脑发育: 原钙粘蛋白在脑发育中的调控与功能研究. 见:
乔中东, 贺林. 前沿生命的启迪. 北京: 科学出版社, 2016: 461–477.
[15] Garrett AM, Schreiner D, Lobas MA, Weiner JA. γ-protocadherins
control cortical dendrite arborization by regulating the activity of a
FAK/PKC/MARCKS signaling pathway. Neuron, 2012, 74(2): 269–276.
[16] Suo L, Lu HN, Ying GX, Capecchi MR, Wu Q. Protocadherin clusters and
cell adhesion kinase regulate dendrite complexity through Rho GTPase. J Mol Cell
Biol, 2012, 4(6): 362–376.
[17] Lefebvre JL, Kostadinov D, Chen WV, Maniatis T, Sanes JR.
Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous
system. Nature, 2012, 488(7412): 517–521.
[18] Jia ZL, Guo Y, Tang YX, Xu Q, Li BJ, Wu Q. Regulation of the
protocadherin Celsr3 gene and its role in globus pallidus development and
connectivity. Mol Cell Biol, 2014, 34(20): 3895–3910.
[19] Yu Y, Suo L, Wu Q. Protocadherin α gene cluster is required for
myelination and oligodendrocyte development. Zool Res, 2012, 33(4): 362–366. 于
钰, 索伦, 吴强. PCDHα在髓鞘形成和少突胶质细胞发育中的作用. 动物学研究, 2012,
33(4): 362–366.
[20] Chen WV, Nwakeze CL, Denny CA, O'Keeffe S, Rieger MA, Mountoufaris
G, Kirner A, Dougherty JD, Hen R, Wu Q, Maniatis T. Pcdhαc2 is required for
axonal tiling and assembly of serotonergic circuitries in mice. Science, 2017,
356(6336): 406–411.
[21] Chen BY, Brinkmann K, Chen ZC, Pak CW, Liao YX, Shi SY, Henry L,
Grishin NV, Bogdan S, Rosen MK. The WAVE regulatory complex links diverse
receptors to the actin cytoskeleton. Cell, 2014, 156(1/2): 195–207.
[22] Derry JM, Ochs HD, Francke U. Isolation of a novel gene mutated in
Wiskott-Aldrich syndrome. Cell, 1994, 78(4): 635–644.
[23] Thrasher AJ. WASp in immune-system organization and function. Nat
Rev Immunol, 2002, 2(9): 635–646.
[24] Aldrich RA, Steinberg AG, Campbell DC. Pedigree demonstrating a sex-
linked recessive condition characterized by draining ears, eczematoid dermatitis
and bloody diarrhea. Pediatrics, 1954, 13(2): 133–139.
[25] Takenawa T, Suetsugu S. The WASP-WAVE protein network: connecting
the membrane to the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(1): 37–48.
[26] Alekhina O, Burstein E, Billadeau DD. Cellular functions of WASP family
proteins at a glance. J Cell Sci, 2017, 130(14): 2235–2241.
[27] Kessels MM, Schwintzer L, Schlobinski D, Qualmann B. Controlling actin
cytoskeletal organization and dynamics during neuronal morphogenesis. Eur J
Cell Biol, 2011, 90(11): 926–933.
[28] Kawauchi T, Hoshino M. Molecular pathways regulating cytoskeletal
organization and morphological changes in migrating neurons. Dev Neurosci,
2008, 30(1/3): 36–46.
[29] Miki H, Miura K, Takenawa T. N-WASP, a novel actin-depolymerizing
protein, regulates the cortical cytoskeletal rearrangement in a PIP2-dependent
manner downstream of tyrosine kinases. EMBO J, 1996, 15(19): 5326–5335.
[30] Padrick SB, Rosen MK. Physical mechanisms of signal integration by
WASP family proteins. Annu Rev Biochem, 2010, 79(1): 707–735.
[31] Moreau V, Frischknecht F, Reckmann I, Vincentelli R, Rabut G, Stewart D,
Way M. A complex of N-WASP and WIP integrates signalling cascades that lead
to actin polymerization. Nat Cell Biol, 2000, 2(7): 441–448.
[32] Carlier MF, Ducruix A, Pantaloni D. Signalling to actin: the Cdc42-N-
WASP-Arp2/3 connection. Chem Biol, 1999, 6(9): R235–R240.
[33] Kim AS, Kakalis LT, Abdul-Manan N, Liu GA, Rosen MK. Autoinhibition
and activation mechanisms of the Wiskott- Aldrich syndrome protein. Nature,
2000, 404(6774): 151– 158.
[34] Miki H, Sasaki T, Takai Y, Takenawa T. Induction of filopodium formation
by a WASP-related actin-depolymerizing protein N-WASP. Nature, 1998,
391(6662): 93–96.
[35] Rohatgi R, Ma L, Miki H, Lopez M, Kirchhausen T, Takenawa T, Kirschner
MW. The interaction between N-WASP and the Arp2/3 complex links Cdc42-
dependent signals to actin assembly. Cell, 1999, 97(2): 221–231.
[36] Carlier MF, Nioche P, Broutin-L'Hermite I, Boujemaa R, Le Clainche C,
Egile C, Garbay C, Ducruix A, Sansonetti P, Pantaloni D. GRB2 links signaling to
actin assembly by enhancing interaction of neural Wiskott-Aldrich syndrome
protein (N-WASp) with actin-related protein (ARP2/3) complex. J Biol Chem, 2000,
275(29): 21946–21952.
[37] Rohatgi R, Ho HY, Kirschner MW. Mechanism of N-WASP activation by
CDC42 and phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate. J Cell Biol, 2000, 150(6):
1299–1310.
[38] Okrut J, Prakash S, Wu Q, Kelly MJS, Taunton J. Allosteric N-WASP
activation by an inter- SH3 domain linker in Nck. Proc Natl Acad Sci USA, 2015,
112(47): E6436– E6445.
[39] Padrick SB, Cheng HC, Ismail AM, Panchal SC, Doolittle LK, Kim S,
Skehan BM, Umetani J, Brautigam CA, Leong JM, Rosen MK. Hierarchical
regulation of WASP/WAVE proteins. Mol Cell, 2008, 32(3): 426–438.
[40] Lommel S, Benesch S, Rottner K, Franz T, Wehland J, Kühn R. Actin
pedestal formation by enteropathogenic Escherichia coli and intracellular motility
of Shigella flexneri are abolished in N-WASP-defective cells. EMBO Rep, 2001,
2(9): 850–857.
[41] Jain N, Lim LW, Tan WT, George B, Makeyev E, Thanabalu T. Conditional
N-WASP knockout in mouse brain implicates actin cytoskeleton regulation in
hydrocephalus pathology. Exp Neurol, 2014, 254: 29–40.
[42] Sheldon M, Rice DS, D'Arcangelo G, Yoneshima H, Nakajima K,
Mikoshiba K, Howell BW, Cooper JA, Goldowitz D, Curran T. Scrambler and yotari
disrupt the disabled gene and produce a reeler-like phenotype in mice. Nature,
1997, 389(6652): 730–733.
[43] Suetsugu S, Tezuka T, Morimura T, Hattori M, Mikoshiba K, Yamamoto T,
Takenawa T. Regulation of actin cytoskeleton by mDab1 through N-WASP and
ubiquitination of mDab1. Biochem J, 2004, 384(Pt 1): 1–8.
[44] The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA
elements in the human genome. Nature, 2012, 489(7414): 57–74.
[45] Tsuchiya D, Kitamura Y, Takata K, Sugisaki T, Taniguchi T, Uemura K,
Miki H, Takenawa T, Shimohama S. Developmental expression of neural Wiskott-
Aldrich syndrome protein (N-WASP) and WASP family verprolin- homologous
protein (WAVE)-related proteins in postnatal rat cerebral cortex and hippocampus.
Neurosci Res, 2006, 56(4): 459–469.
[46] Abe T, Kato M, Miki H, Takenawa T, Endo T. Small GTPase Tc10 and its
homologue RhoT induce N-WASP- mediated long process formation and neurite
outgrowth. J Cell Sci, 2003, 116(Pt 1): 155–168.
[47] Pommereit D, Wouters FS. An NGF-induced Exo70-TC10 complex
locally antagonises Cdc42-mediated activation of N-WASP to modulate neurite
outgrowth. J Cell Sci, 2007, 120(Pt 15): 2694–2705.
[48] Wegner AM, Nebhan CA, Hu L, Majumdar D, Meier KM, Weaver AM,
Webb DJ. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the
development of dendritic spines and synapses. J Biol Chem, 2008, 283(23):
15912–15920.
[49] You JJ, Lin-Chao S. Gas7 functions with N-WASP to regulate the neurite
outgrowth of hippocampal neurons. J Biol Chem, 2010, 285(15): 11652–11666.
[50] Mohamed AM, Boudreau JR, Yu FPS, Liu J, Chin-Sang ID. The
Caenorhabditis elegans Eph receptor activates NCK and N-WASP, and inhibits
Ena/VASP to regulate growth cone dynamics during axon guidance. PLoS Genet,
2012, 8(2): e1002513.
[51] Tsai JW, Chen Y, Kriegstein AR, Vallee RB. LIS1 RNA interference blocks
neural stem cell division, morphogenesis, and motility at multiple stages. J Cell
Biol, 2005, 170(6): 935–945.
[52] Bai JJ, Ramos RL, Ackman JB, Thomas AM, Lee RV, LoTurco JJ. RNAi
reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat
Neurosci, 2003, 6(12): 1277–1283.
[53] Xiao F, Wang XF, Li JM, Xi ZQ, Lu Y, Wang L, Zeng Y, Guan LF, Yuan J.
Overexpression of N-WASP in the brain of human epilepsy. Brain Res, 2008, 1233:
168–175.
[54] Kovacs EM, Verma S, Ali RG, Ratheesh A, Hamilton NA, Akhmanova A,
Yap AS. N-WASP regulates the epithelial junctional actin cytoskeleton through a
non-canonical post-nucleation pathway. Nat Cell Biol, 2011, 13(8): 934– 943.
[55] Luan Q, Zelter A, MacCoss MJ, Davis TN, Nolen BJ. Identification of
Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP) binding sites on the branched actin
filament nucleator Arp2/3 complex. Proc Natl Acad Sci USA, 2018, 115(7): E1409–
E1418.
2024年4月10日发(作者：睦翰采)
N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移
沈秀莲;逯宜超;甲芝莲;吴强
【摘 要】在大脑皮层发育过程中,神经元迁移是一个动态的复杂过程,与细胞骨架构建
和重塑的调控息息相关.N-WASP 蛋白是 Wiskott-Aldrich 综合征蛋白家族(WASP-WAVE
family)的一个重要成员,又名 WAS-like 蛋白(WASL),直接参与细胞骨架中肌动蛋白丝状分
支的动态调控.本研究通过蛋白免疫印迹检测发现 N-WASP 表达于小鼠胚胎发育时期
(E12.5~E18.5)的大脑皮层中,并且其表达水平随着发育逐渐降低.利用在体子宫内胚胎电转
实验,结果发现过表达或者敲低 N-WASP 均会造成不同程度的大脑皮层神经元迁移障碍,
说明 N-WASP在大脑皮层神经元迁移中起到关键作用.N-WASP蛋白主要包含4个结构
域:WH1、GBD、polyPro和 VCA.为进一步研究N-WASP各结构域在神经元迁移中的调
控功能,设计了一系列的显性负性突变实验.通过过表达结构域删除的N-WASP蛋白,发现
△polyPro、△VCA和△WH1均能造成神经元迁移障碍.但是,过表达不能结合 Cdc42的 N-
WASP蛋白(H208D突变体)却不能造成明显的神经元迁移障碍.另外,单独过表达 N-
WASP的结构域polyPro或VCA能够造成神经元迁移障碍,而过表达WH1结构域却不能
影响迁移.最后,通过过表达polyPro和VCA结构域同时删除的N-WASP (WH1-GBD),发
现WH1-GBD结构域对神经元迁移没有明显影响.上述结果表明N-WASP蛋白主要是通
过polyPro和VCA两个结构域调控大脑皮层神经元的迁移过程.%Cortical neuron
migration in the developing mouse forebrain is a complex process, which
contains several steps related to cytoskeleton dynamics and remodeling. Neural
Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP), a member of the WASP-WAVE
family, regulates actin cytoskeleton reorganization through the binding of its VCA
domain to the Arp2/3 we report expression patterns of N-WA S P
gene in the mouse developing embryonic cortex(E12.5~E18.5) and find its
expression levels are decreased during embryonic development. By using in utero
electro-poration (IUE) method, we find that either N-WASP overexpression or
knockdown impairs cortical neuron migration, and the defects of cortical neuron
migration caused by N-WASP overexpression are much more severe than that by
its knock-down. N-WASP protein contains four domains: WH1, GBD, polyPro, and
VCA. We generated a series of dominant negative N-WASP mutants by modifying
these domains. Overexpression of N-WASP mutant lacking domain polyPro, VCA,
or WH1, impairs cortical neuron migration. However, overexpression of N-WASP
with the H208D point mutation, which abolishes the Cdc42 binding to N-WASP,
causes only a marginal defect of cortical neuron migration. Finally, overexpression
of the individual domain polyPro or VCA, but not WH1, can recapitulate the
defects by N-WASP overexpression. However, overexpression of WH1-GBD
fragment has no apparent effect on cortical neuron migration. In conclusion, our
data demon-strate that N-WASP regulates cortical neuron migration mainly
through its polyPro and VCA domains.
【期刊名称】《遗传》
【年(卷),期】2018(040)005
【总页数】12页(P390-401)
【关键词】大脑皮层神经元迁移;N-WASP;子宫内胚胎电转技术;肌动蛋白细胞骨架动
态
【作 者】沈秀莲;逯宜超;甲芝莲;吴强
【作者单位】上海交通大学系统生物医学研究院比较生物医学研究中心,系统生物医
学教育部重点实验室,上海 200240;上海交通大学系统生物医学研究院比较生物医学研究
中心,系统生物医学教育部重点实验室,上海 200240;上海交通大学系统生物医学研究院比
较生物医学研究中心,系统生物医学教育部重点实验室,上海 200240;上海交通大学系统生
物医学研究院比较生物医学研究中心,系统生物医学教育部重点实验室,上海 200240
【正文语种】中 文
人类大脑皮层是进化上最晚出现、结构上最为复杂的脑部结构[1]，其在脑的高级认
知或执行功能(cognition or executive function)中发挥着重要作用。大脑皮层的发育涉
及一系列复杂的过程，包括神经元的增殖(proliferation)、迁移(migration)和分化
(differentiation)等。大脑皮层是由出生于脑室区(ventricular zone, VZ)的兴奋性神经
元前体和出生于皮质下区(subpallium)的抑制性神经元前体，分别通过放射状(radial
migration)和切线状(tangential migration)并以先到内侧后到外侧(inside-out)模式迁移
形成的板层结构(laminar structure)[2~7]。其中，兴奋性神经元前体放射状迁移模式是
一个非常复杂的动态协同调控过程：首先，脑室区(ventricular zone, VZ)的神经祖细胞通
过不对称分裂产生中间祖细胞(transit amplifying intermediate neuronal progenitor
cells)；然后，这些祖细胞在脑室下区(subventricular zone, SVZ)继续分裂1~3次后，
再以多极状态在中间区(intermediate zone, IZ)中迁移；最后，祖细胞转变成双极状态
沿着神经胶质细胞纤维以放射状迁移的方式到达皮质区(cortical plate, CP)[8~10]。该过
程需要多种信号通路协同调控细胞骨架的动态平衡来完成[4]，其正常进行对于后续神经
元回路以及神经系统功能的正常发挥起着重要作用。而且，人们发现神经元迁移异常能够
导致多种神经精神疾病，因此研究其分子调控机制对于了解精神疾病的发生原因有着重要
意义[1]。
原钙粘蛋白介导的细胞粘连与神经元迁移和神经细胞多样性密切相关[11~14]。原钙
粘蛋白家族在神经元树突和轴突发育中也起到关键作用[15~20]。最近的研究发现原钙粘
蛋白可能与WASP-WAVE (Wiskott- Aldrich syndrome protein and WASP-family
verprolin- homologous protein)信号通路有关[13,21]。WASP是Wiskott-Aldrich综
合征(WAS)的致病基因[22]，该疾病是一种包括湿疹(eczema)在内的性染色体连锁的隐性
免疫缺陷疾病[23,24]。WASP蛋白家族共包含11个成员，该家族与肌动蛋白的动态调控
有关[25]，在各种生理和病理过程中对诸如胞吞(endocytosis)、胞吐(exocytosis)、丝状
伪足(filopodia)、板状伪足(lamellipodia)、侵袭伪足(invadopodia)等细胞形态的调控
起到关键作用[26]。细胞接收外界信息通过复杂的信号传递通路最终汇集到Arp2/3复合
体(actin-related protein 2/3 complex)上，然后调控肌动蛋白丝状分支的动态组装，此
动态组装对于神经元迁移以及神经细胞的形态发生也是非常重要的[27,28]。
N-WASP(neural-Wiskott-Aldrich syndrome protein)是WASP-WAVE家族成员之
一[25]，最初发现于牛(Bos taurus)的脑提取物中，因其与WASP氨基酸序列的高度相似
性，故命名为N-WASP(神经性WASP)[29]。它是一个广泛表达的蛋白，不仅在大脑中有
丰富的表达，而且在心脏、肺等其他组织中也有表达[29]。N-WASP蛋白主要含有4个
功能性结构域：WH1 (WASP homology 1)、GBD (GTPase-binding domain)、
polyPro (proline-rich SH3-adaptor-binding region)和VCA (verprolin and cofilin
homology regions and the acidic domain)[30]。研究已证实，WH1结构域与N-
WASP被招募到肌动蛋白组装的位点有关[31]，而GBD、polyPro和VCA这3个结构域
主要调控N-WASP蛋白的活性状态[25,30]。N-WASP主要通过构象转换
(conformational change)释放出VCA结构域激活Arp2/3复合体来调控肌动蛋白的组装
[32]。具体来讲，N-WASP有激活和未激活两种构象状态：在未激活构象状态下，N-
WASP的GBD结构域和VCA结构域相互作用而使VCA结构域被掩藏，不能与肌动蛋白
单体和Arp2/3复合体相互作用；在激活构象状态下，VCA结构域被暴露出来并与
Arp2/3复合体相互作用，verprolin结构域上结合的肌动蛋白单体输送到肌动蛋白丝状分
支，从而促进肌动蛋白的组装[30,33]。一些上游的信号分子可以激活N- WASP，使其释
放出VCA结构域。例如，Cdc42 (cell division cycle 42)通过结合GBD结构域而释放出
VCA结构域；Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2)，Nck(non-catalytic
region of tyrosine kinase adaptor protein)等含有SH3(Src homology 3)结构域的接
头蛋白(adaptor proteins)则通过与polyPro结构域相互作用，从而解除这种自抑制状态，
释放VCA结构域[34~38]。最后，N-WASP通过形成二聚体或寡聚体进一步激活
Arp2/3复合体，从而达到最大的活性[30,39]。
N-WASP敲除会导致小鼠(Mus musculus)胚胎致死并伴随神经管形成缺陷[40]，在
小鼠大脑中条件性敲除N-WASP会导致脑积水的症状[41]，说明N-WASP在小鼠大脑的
发育中起着重要作用。此外，之前有报道称mDab1 (mouse disabled homologue1)基
因突变会导致小鼠大脑皮层发育异常，造成皮层的异位，与摇晃蛋白Reelin基因敲除小
鼠表型一致[42]。而体外细胞实验显示mDab1可与N-WASP相互作用诱导丝状伪足
(filopodia)的生成[43]，说明N-WASP可能在神经元迁移中起重要作用，但至今未见有
直接的证据。
本研究利用蛋白免疫印迹(Western blot, WB)检测发现N-WASP在小鼠大脑皮层的
发育过程中持续表达并且呈现逐渐下降的模式，然后采用在体子宫内胚胎电转技术在
E14.5的小鼠大脑皮层神经元中过表达与敲低N-WASP，实验结果均表明会造成神经元迁
移障碍，而且过表达N-WASP所导致的神经元迁移障碍会比敲低N-WASP产生的影响
更严重。此外，通过在体子宫内胚胎电转技术过表达显性负性突变蛋白，发现过表达
DVCA，DpolyPro或者DWH1突变体，以及VCA或者polyPro结构域均会导致神经元
迁移障碍，而过表达WH1，WH1-GBD结构域以及H208D突变体却对神经元迁移没有
明显影响。这些实验结果表明N-WASP主要是通过polyPro和VCA结构域的协调作用
来调控大脑皮层的神经元迁移。
C57BL/6小鼠(南方模式动物中心)；HEK293T细胞(上海细胞库)；N-WASP抗体
(Abcam公司，英国)；b-actin抗体、抗鼠以及抗兔二抗(Proteintech公司，美国)；
DNA质粒中抽试剂盒Compactprep Plasmid Midi Kit(25)(Qiagen公司，德国)；固绿
FCF (Fast Green FCF)、戊巴比妥钠(Sigma公司，美国)；Stbl3大肠杆菌菌株、脂质体
LipofectamineTM3000以及ProlongTM Gold antifade reagent(Invitrogen公司，美
国)；逆转录试剂盒Reverse Transcription System (Promega公司，美国)；电转仪
(Bio-Rad，美国)；自动震荡切片机(Leica，德国)；共聚焦显微镜(Leica，德国)；
Western blot全套装置(Bio-Rad，美国)；荧光显微镜(Zeiss，德国)。
全长的N-WASP cDNA (GenBank 318416)是通过提取小鼠大脑总RNA再经
过逆转录PCR (RT-PCR)获得，并被克隆到pCAG-Myc载体中，其突变体WH1,
DWH1,WH1-GBD, H208D, DVCA, VCA, DpolyPro, polyPro通过设计突变引物由全长
N-WASP突变得到。用于敲低实验的短发夹环RNA (shRNA)编码序列是克隆到pLKO.1
载体(Sigma)上的。实验所用引物序列列于表1。
HEK293T细胞的培养基是DMEM(10% FBS, 100 mg/mL青霉素/链霉素双抗)，首
先使用不含抗生素的培养基培养HEK293T细胞，待细胞密度达到70%~90% (大约24 h)
即可使用LipofectamineTM 3000进行细胞转染，24 h后换液，48 h后裂解细胞收取蛋
白，进行Western blot实验。
配制10%分离胶(10 mL)：3.97 mL MilliQ水，3.33 mL 30%Arc-Bis，2.5 mL 1.5
mol/L Tris-HCl(pH = 8.8)，100 mL 10%SDS，100 mL 10%过硫酸铵，4 mL四甲基乙
二胺(TEMED)；4%浓缩胶(4 mL)：2.39 mL MilliQ水，0.53 mL 30%Arc-Bis，1 mL
0.5 mol/L Tris-HCl (pH = 6.8)，40 mL 10% SDS，40 mL 10%过硫酸铵，4 mL四甲基
乙二胺(TEMED)；将样品与SDS-PAGE上样缓冲液按比例混合好，95℃变性5 min后加
入上样孔中；电泳：80 V，30 min；110 V，120 min；电泳完毕后，根据蛋白Marker
大小，将包含目的蛋白的PAGE胶切下：110 V，105 min将蛋白转至NC膜上；转膜完
毕后，将膜放入适量的封闭液(5%的脱脂牛奶)中，室温孵育1 h；倒掉封闭液，加入一抗，
4℃孵育过夜；将膜加入1×TBST溶液中，室温下洗膜5 min，重复4次；加入二抗，室
温孵育1 h；将膜放入1×TBST溶液中，室温下洗膜5 min，重复4次；最后用
Odyssey双色红外激光成像系统扫膜成像。
C57BL/6J小鼠的饲养环境为23℃恒温，12 h (7：00~19：00)光照和12 h (19：
00~7：00)黑暗。所有的小鼠实验均符合Institutional Animal Care and Use
Committee的规定。取成年的雌性与雄性小鼠于下午16：00后进行合笼，第二天上午
12：00前检查雌鼠有没有阴道栓，如果有阴道栓就将时间记为胚胎期(embryonic day
0.5: E0.5)。
E14.5时，向怀孕的母鼠腹腔注射0.6%的戊巴比妥钠进行麻醉，期间配制注射的质
粒混合物[pCAG- Myc质粒(2.5 mg/mL)或者pLKO.1质粒(4 mg/mL)、eGFP质粒(0.5
mg/mL)以及0.3% Fast green]。
将母鼠放在加热板上，用剪刀将母鼠腹部的毛剃干净，再用酒精与碘酒进行消毒。将
母鼠腹部剪开一个口子，再将一块灭菌的纱布剪开一个口子并将其放于母鼠腹部开口处，
将子宫取出放在纱布上，并加0.9%的NaCl溶液于胚胎上。然后向胚胎脑室注射配制好
的质粒混合物，使用含有钳片电极的电转仪将质粒转到胚胎大脑皮层脑室区的神经祖细胞
中。电转使用的程序为电压37 V，持续时间50 ms，间隔900 ms，5次。
将子宫放回母鼠腹腔中并加1 mL 0.9%的NaCl溶液，缝合好伤口后将母鼠放在恒温
板上，待母鼠醒来后放回饲养笼盒，继续饲养。
E17.5时，将胎鼠的头部剪下，在显微镜下操作取出大脑，放入含有4% PFA的离心
管中，放于摇床上室温孵育24 h进行固定。
使用自动震荡切片机切出50 mm的脑片，用DAPI进行细胞核染色，再用1×PBS
清洗3次，然后将脑片放在载玻片上，用封片剂封好。
使用共聚焦显微镜获取处理好的脑片图像。
RNA-seq数据分析：数据下载于ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements)数据
库[44]，经Cufflinks 2.1.1处理计算分析得到基因表达水平数值。文中使用的数据Gene
Expression Omnibus (GEO)序列号：GEO:GSE82852，GEO:GSE78340，
GEO:GSE78323，GEO:GSE78374。
数据分析使用GraphPad Prism 5.0软件，各组间平均值差异程度的检验方法用
Student’s t test或者One-way ANOVA进行检验分析。
已有研究报道，N-WASP蛋白的表达在出生后的大鼠皮层中是逐渐增加的，并在出
生后16周维持稳定[45]，同时有文献报道其对于神经突起的延伸以及突触发生有重要作
用[46~48]，说明N-WASP在大脑发育中起着重要的作用，但N-WASP在小鼠胚胎期大
脑皮层发育过程中的具体表达情况却未见相关报道。本研究首先提取了不同时期(E12.5、
E14.5、E16.5、E18.5和P1)的小鼠大脑皮层组织进行免疫印迹实验检测蛋白表达水平，
发现N-WASP蛋白在胚胎期皮层有表达，并随着胚胎发育呈现下降的模式(图1A)。然后
从ENCODE数据库中下载了小鼠(C57BL/6)前脑(forebrain)在不同时期(E12.5、E14.5、
E16.5和P0)的RNA-seq数据[44]，使用Cufflinks 2.1.1对其进行分析，发现N-WASP
在mRNA水平上有表达并且随着发育过程呈现下降的模式(图1B)，该结果与蛋白免疫印
迹实验一致。
N-WASP蛋白在小鼠大脑皮层的表达从E12.5到P1呈现逐渐下降的模式，其表达量
高的时期与大脑皮层神经元迁移的时间段(E11~E16)吻合，预示其可能参与调控神经元的
迁移。由此，设计了2个不同的shRNA进行在体胚胎电转敲低实验。首先，通过WB检
验了shRNA的效率，发现它们能有效敲低N-WASP蛋白的表达水平(图2A)。然后，利
用子宫内胚胎电转技术，将shRNA表达质粒转入E14.5的胎鼠大脑皮层神经祖细胞中，
在E17.5时取脑并切片观察。与对照组相比，发现N-WASP敲低会造成小鼠大脑皮层神
经元的迁移缺陷(图2B)。
为进一步研究N-WASP调控神经元迁移的具体功能，构建了N-WASP真核过表达
质粒，然后通过子宫内胚胎电转技术将该质粒转入E14.5的胎鼠大脑皮层神经祖细胞中，
同样在E17.5时切片观察。与对照组相比，发现过表达N-WASP也会造成小鼠大脑皮层
神经元的迁移缺陷(图2C)。并且，过表达N-WASP造成的神经元迁移障碍比敲低N-
WASP所造成的神经元迁移障碍更加显著(图2：B，C)。
上述结果说明，N-WASP过表达或敲低均会造成神经元迁移障碍，表明其在神经元
迁移中起着重要作用。
N-WASP主要通过VCA结构域结合活化的肌动蛋白以及Arp2/3复合体引起肌动蛋
白组装[32]，其在未激活的情况下处于自抑制的状态(GBD与VCA相互作用)，需要上游
信号Cdc42激活并打开这种自抑制状态，进而引起肌动蛋白的组装[25,33]。N-WASP除
了通过上述经典的GTPase激活通路之外，还可以通过polyPro结构域与含有SH3结构
域的接头蛋白结合进行激活[25]，而它的WH1结构域主要与WIP (WASP-interacting
protein)家族相互作用，该作用与N-WASP招募到肌动蛋白组装的地点有关[31]。
为更加深入研究N-WASP调控神经元迁移的分子机制，首先构建了VCA结构域删除
(ΔVCA)、polyPro结构域删除(ΔpolyPro)、WH1结构域删除(ΔWH1)以及破坏了Cdc42
结合位点[34](H208D突变体)的N-WASP蛋白表达质粒(图3A)。然后通过子宫内胚胎电
转技术，将这些质粒分别转到E14.5的大脑皮层中，在E17.5时切片观察。结果发现单独
过表达ΔVCA、ΔpolyPro或者ΔWH1的N-WASP蛋白均会造成严重的神经元迁移障碍，
而过表达H208D突变的N-WASP蛋白却没有造成明显的神经元迁移障碍(图3B)。最后，
利用构建的VCA结构域过表达质粒(VCA)、polyPro结构域过表达质粒(polyPro)、WH1
结构域过表达质粒(WH1)、WH1-GBD结构域(同时删除polyPro和VCA结构域)过表达
质粒(WH1-GBD)(图3A)，进行了类似的子宫内胚胎电转实验。结果表明单独过表达VCA
蛋白或polyPro蛋白均会造成严重的神经元迁移障碍，但是过表达WH1蛋白或WH1-
GBD蛋白对神经元迁移没有明显影响(图3C)。
综上所述，N-WASP是通过VCA结构域激活下游信号通路来调控神经元迁移，并且
主要通过polyPro结构域接收上游信号调控神经元迁移，而Cdc42激活N-WASP进而
打开VCA的这条信号通路只是部分参与对神经元迁移的调控。此外，WH1结构域可能不
参与N-WASP对神经元迁移的调控。
大脑皮层的正常发育对于其执行记忆、学习和感觉的功能是非常重要的，其中神经元
迁移是大脑皮层发育中的一个重要过程。神经元迁移是一个高度动态化的协同调控过程，
通过细胞骨架中肌动蛋白的动态组装影响神经元前体的形态进而调控神经元迁移[28]。
WASP家族中的WAVE蛋白和其他4个蛋白可形成一个五聚体复合物(pentameric
WAVE regulatory complex, WRC)，然后被大约120种膜蛋白招募到细胞膜附近，进而
引起肌动蛋白的组装[21]。这些膜蛋白包括很多原钙粘蛋白(protocadherin, PCDH)、
Celsr3 (cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3)、Fat3 (FAT atypical
cadherin 3)等[18,21]。原钙粘蛋白通过抑制Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase 2)的活
性而激活Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)来调控神经元的树突与树
突棘的形态生成[16]。此外，N-WASP能够调节神经元突起(neurites)以及突起的生长锥
导向[49,50]，然而其在神经元迁移中的功能和机制依然是不清楚的。
本研究使用在体子宫内胚胎电转技术研究N-WASP蛋白在小鼠大脑皮层神经元迁移
中所起的作用，发现N-WASP调控神经元迁移主要依赖于polyPro和VCA结构域。通
过提取不同时期的胚胎大脑皮层组织(E12.5、E14.5、E16.5、E18.5和 P1) 进行蛋白免疫
印迹实验以及分析胚胎发育不同时期前脑(E12.5、E14.5、E16.5和P0)的RNA-seq数据，
发现在胚胎时期的大脑皮层发育过程中，N-WASP在mRNA和蛋白质水平上均有表达，
并且其表达随着大脑发育逐渐下降。然后通过在体子宫内胚胎电转技术过表达和敲低N-
WASP，发现过表达和敲低N-WASP均造成神经元迁移障碍，说明其在调控神经元迁移
中可能起到了重要作用。本研究观察到敲低N-WASP的表型没有过表达明显，这可能是
因为N-WASP没有被完全敲除。
先前研究表明，Lis1 (lissencephaly-1)过表达对神经元迁移没有明显影响，而Lis1
敲低会导致神经元迁移障碍[8,51]；双皮质素(doublecortin, DCX)过表达会促进神经元迁
移，而双皮质素敲低会阻止神经元迁移[8,52]。有趣的是，本研究发现过表达和敲低N-
WASP均会造成神经元迁移障碍。神经元迁移是一个高度动态的过程，需要肌动蛋白骨架
动态调控，所以N-WASP的表达量的平衡对这一过程显得非常重要。此外，有报道称在
患有癫痫的人脑组织中N-WASP的表达量高于正常水平[53]，预示N-WASP的表达量过
多产生的病理学效应可能参与了疾病的进程。
N-WASP在未激活时通过分子内的GBD与VCA相互作用保持自抑制状态。在激活
时，其通过接收上游信号刺激释放出VCA结构域，暴露出来的VCA结构域通过激活
Arp2/3复合体来引起肌动蛋白的动态化组装。本研究表明在正常的大脑皮层发育状态下，
N-WASP蛋白可能参与调控神经元迁移，而且其表达量的平衡对神经元的迁移也是至关
重要的。进一步的研究结果表明分别过表达VCA结构域和DpolyPro (含有VCA结构域)
突变体均会造成神经元迁移障碍，说明VCA结构域可能竞争性抑制内源的N-WASP蛋白
发挥作用。同理，分别过表达polyPro结构域和DVCA (含有polyPro结构域)突变体均
会造成神经元迁移障碍，说明polyPro结构域也可能竞争性抑制内源的N-WASP蛋白发
挥作用。推测这些突变体可能竞争性地结合了一些与内源N-WASP相互作用的蛋白(如含
有SH3功能域的接头蛋白)，从而抑制内源的N-WASP发挥作用。与此同时，过表达
WH1-GBD结构域(不含有polyPro和VCA结构域)却对神经元迁移没有明显影响。总之，
这些结果说明N-WASP的polyPro和VCA结构域参与调控神经元迁移，可能是通过
polyPro结构域接收上游信号释放出VCA结构域，再激活Arp2/3复合体影响肌动蛋白
的组装进而调控神经元迁移。
N-WASP的WH1结构域主要与WIP家族蛋白相互作用，其GBD结构域主要通过
与Cdc42 GTPase结合接收上游信号。本研究发现过表达WH1结构域对神经元迁移没有
明显影响，而过表达DWH1则会造成严重的神经元迁移障碍，说明过表达WH1结构域
不能竞争性抑制内源的N-WASP蛋白发挥作用，而DWH1(含有polyPro和VCA结构域)
依然能够竞争性抑制内源的N-WASP蛋白发挥作用，可能是因为N-WASP调控神经元
迁移不需要WH1结构域的参与。之前有报道称N-WASP通过WH1结构域参与调控上
皮细胞之间连接的肌动蛋白骨架，而经典的VCA结构域并不参与其中，这种调控作用主
要是通过WH1结构域维持肌动蛋白组装后的稳定性[54]。此结论与本文的研究结果相一
致，因为神经元迁移是一个时刻在变化的过程，其需要肌动蛋白组装的动态平衡来形成合
适的细胞骨架网络，而细胞骨架网络对于神经细胞的形态至关重要。N-WASP的WH1
结构域可能更侧重于影响肌动蛋白组装后的静态稳定性，而不是调控肌动蛋白的动态组装
[54]。此外，本研究还发现过表达H208D突变的N-WASP对神经元迁移有影响，但并
非像其他突变体产生明显的影响。由于H208D突变的N-WASP不能结合Cdc42，因此
推测Cdc42激活N-WASP引起肌动蛋白的动态调控可能参与了神经元迁移，但并不是主
要的信号通路。
N-WASP在参与信号通路发挥作用时，需要从未激活状态转变成激活状态。N-
WASP的高度激活需要两个步骤，首先通过接收上游信号分子(如Cdc42或含有SH3结
构域的接头蛋白)的激活进行变构调节，释放出VCA结构域结合Arp2/3复合体，然后通
过连接蛋白使得N-WASP进行二聚化或者寡聚化增加与Arp2/3复合体的亲和性来调控
肌动蛋白的组装[39]。结合最近的研究发现一个VCA结构域结合Arp2/3复合体的背面
而另一个VCA结构域结合该复合体的底面[55]，本文提出一个可能的N-WASP调控神经
元迁移的模型：Cdc42和含有SH3结构域的蛋白可能协同结合N-WASP蛋白使其进行
变构释放出VCA结构域，再通过多价的含有SH3结构域的蛋白结合polyPro结构域使得
N-WASP进行二聚化或者寡聚化，最终激活肌动蛋白的组装调控神经元的迁移(图4)。
综上所述，本研究发现N-WASP在大脑皮层神经元前体放射状迁移中起到重要作用，
并且其主要是通过polyPro和VCA结构域动态调控细胞骨架中肌动蛋白丝状分支的构建
影响神经元迁移。
【相关文献】
[1] Wang S, Xu ZH. Progress in the study of molecular mechanisms of
developmental cortex malformations. Chin J Cell Biol, 2011, 33(8): 837–846. 王硕,
许执恒. 大脑皮层发育畸形及分子遗传机理研究进展. 中国细胞生物学学报, 2011, 33(8):
837–846.
[2] Angevine JB Jr, Sidman RL. Autoradiographic study of cell migration
during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature, 1961, 192: 766–768.
[3] Marín O, Rubenstein JL. Cell migration in the forebrain. Annu Rev
Neurosci, 2003, 26: 441–483.
[4] Marín O, Valiente M, Ge XC, Tsai LH. Guiding neuronal cell migrations.
Cold Spring Harb Perspect Biol, 2010, 2(2): a001834.
[5] Ayala R, Shu TZ, Tsai LH. Trekking across the brain: the journey of
neuronal migration. Cell, 2007, 128(1): 29–43.
[6] Huang Z. Molecular regulation of neuronal migration during neocortical
development. Mol Cell Neurosci, 2009, 42(1): 11–22.
[7] Tissir F, Goffinet AM. Shaping the nervous system: role of the core
planar cell polarity genes. Nat Rev Neurosci, 2013, 14(8): 525–535.
[8] LoTurco JJ, Bai JL. The multipolar stage and disruptions in neuronal
migration. Trends Neurosci, 2006, 29(7): 407–413.
[9] Lui JH, Hansen DV, Kriegstein AR. Development and evolution of the
human neocortex. Cell, 2011, 146(1): 18– 36.
[10] Tabata H, Nakajima K. Multipolar migration: the third mode of radial
neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci, 2003, 23(31):
9996–10001.
[11] Li W, Wu Q. Protocadherin and the diversity of neurons. Sci Technol
Vision, 2013, (27): 14. 李伟, 吴强. 原钙粘蛋白分子与神经元的多样性. 科技视界, 2013,
(27): 14.
[12] Ying GX, Wu S, Hou RQ, Huang W, Capecchi MR, Wu Q. The
protocadherin gene Celsr3 is required for interneuron migration in the mouse
forebrain. Mol Cell Biol, 2009, 29(11): 3045–3061.
[13] Peek SL, Mah KM, Weiner JA. Regulation of neural circuit formation by
protocadherins. Cell Mol Life Sci, 2017, 74(22): 4133–4157.
[14] Wu Q, Li W. From human genome to the development of brain: the
regulation and function of protocadherin in the development of brain. In: Qiao ZD,
He L, ed. The Enlightment of the Frontier Life. Beijing: Science Press, 2016: 461–
477. 吴强, 李伟. 从人类基因组到大脑发育: 原钙粘蛋白在脑发育中的调控与功能研究. 见:
乔中东, 贺林. 前沿生命的启迪. 北京: 科学出版社, 2016: 461–477.
[15] Garrett AM, Schreiner D, Lobas MA, Weiner JA. γ-protocadherins
control cortical dendrite arborization by regulating the activity of a
FAK/PKC/MARCKS signaling pathway. Neuron, 2012, 74(2): 269–276.
[16] Suo L, Lu HN, Ying GX, Capecchi MR, Wu Q. Protocadherin clusters and
cell adhesion kinase regulate dendrite complexity through Rho GTPase. J Mol Cell
Biol, 2012, 4(6): 362–376.
[17] Lefebvre JL, Kostadinov D, Chen WV, Maniatis T, Sanes JR.
Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous
system. Nature, 2012, 488(7412): 517–521.
[18] Jia ZL, Guo Y, Tang YX, Xu Q, Li BJ, Wu Q. Regulation of the
protocadherin Celsr3 gene and its role in globus pallidus development and
connectivity. Mol Cell Biol, 2014, 34(20): 3895–3910.
[19] Yu Y, Suo L, Wu Q. Protocadherin α gene cluster is required for
myelination and oligodendrocyte development. Zool Res, 2012, 33(4): 362–366. 于
钰, 索伦, 吴强. PCDHα在髓鞘形成和少突胶质细胞发育中的作用. 动物学研究, 2012,
33(4): 362–366.
[20] Chen WV, Nwakeze CL, Denny CA, O'Keeffe S, Rieger MA, Mountoufaris
G, Kirner A, Dougherty JD, Hen R, Wu Q, Maniatis T. Pcdhαc2 is required for
axonal tiling and assembly of serotonergic circuitries in mice. Science, 2017,
356(6336): 406–411.
[21] Chen BY, Brinkmann K, Chen ZC, Pak CW, Liao YX, Shi SY, Henry L,
Grishin NV, Bogdan S, Rosen MK. The WAVE regulatory complex links diverse
receptors to the actin cytoskeleton. Cell, 2014, 156(1/2): 195–207.
[22] Derry JM, Ochs HD, Francke U. Isolation of a novel gene mutated in
Wiskott-Aldrich syndrome. Cell, 1994, 78(4): 635–644.
[23] Thrasher AJ. WASp in immune-system organization and function. Nat
Rev Immunol, 2002, 2(9): 635–646.
[24] Aldrich RA, Steinberg AG, Campbell DC. Pedigree demonstrating a sex-
linked recessive condition characterized by draining ears, eczematoid dermatitis
and bloody diarrhea. Pediatrics, 1954, 13(2): 133–139.
[25] Takenawa T, Suetsugu S. The WASP-WAVE protein network: connecting
the membrane to the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(1): 37–48.
[26] Alekhina O, Burstein E, Billadeau DD. Cellular functions of WASP family
proteins at a glance. J Cell Sci, 2017, 130(14): 2235–2241.
[27] Kessels MM, Schwintzer L, Schlobinski D, Qualmann B. Controlling actin
cytoskeletal organization and dynamics during neuronal morphogenesis. Eur J
Cell Biol, 2011, 90(11): 926–933.
[28] Kawauchi T, Hoshino M. Molecular pathways regulating cytoskeletal
organization and morphological changes in migrating neurons. Dev Neurosci,
2008, 30(1/3): 36–46.
[29] Miki H, Miura K, Takenawa T. N-WASP, a novel actin-depolymerizing
protein, regulates the cortical cytoskeletal rearrangement in a PIP2-dependent
manner downstream of tyrosine kinases. EMBO J, 1996, 15(19): 5326–5335.
[30] Padrick SB, Rosen MK. Physical mechanisms of signal integration by
WASP family proteins. Annu Rev Biochem, 2010, 79(1): 707–735.
[31] Moreau V, Frischknecht F, Reckmann I, Vincentelli R, Rabut G, Stewart D,
Way M. A complex of N-WASP and WIP integrates signalling cascades that lead
to actin polymerization. Nat Cell Biol, 2000, 2(7): 441–448.
[32] Carlier MF, Ducruix A, Pantaloni D. Signalling to actin: the Cdc42-N-
WASP-Arp2/3 connection. Chem Biol, 1999, 6(9): R235–R240.
[33] Kim AS, Kakalis LT, Abdul-Manan N, Liu GA, Rosen MK. Autoinhibition
and activation mechanisms of the Wiskott- Aldrich syndrome protein. Nature,
2000, 404(6774): 151– 158.
[34] Miki H, Sasaki T, Takai Y, Takenawa T. Induction of filopodium formation
by a WASP-related actin-depolymerizing protein N-WASP. Nature, 1998,
391(6662): 93–96.
[35] Rohatgi R, Ma L, Miki H, Lopez M, Kirchhausen T, Takenawa T, Kirschner
MW. The interaction between N-WASP and the Arp2/3 complex links Cdc42-
dependent signals to actin assembly. Cell, 1999, 97(2): 221–231.
[36] Carlier MF, Nioche P, Broutin-L'Hermite I, Boujemaa R, Le Clainche C,
Egile C, Garbay C, Ducruix A, Sansonetti P, Pantaloni D. GRB2 links signaling to
actin assembly by enhancing interaction of neural Wiskott-Aldrich syndrome
protein (N-WASp) with actin-related protein (ARP2/3) complex. J Biol Chem, 2000,
275(29): 21946–21952.
[37] Rohatgi R, Ho HY, Kirschner MW. Mechanism of N-WASP activation by
CDC42 and phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate. J Cell Biol, 2000, 150(6):
1299–1310.
[38] Okrut J, Prakash S, Wu Q, Kelly MJS, Taunton J. Allosteric N-WASP
activation by an inter- SH3 domain linker in Nck. Proc Natl Acad Sci USA, 2015,
112(47): E6436– E6445.
[39] Padrick SB, Cheng HC, Ismail AM, Panchal SC, Doolittle LK, Kim S,
Skehan BM, Umetani J, Brautigam CA, Leong JM, Rosen MK. Hierarchical
regulation of WASP/WAVE proteins. Mol Cell, 2008, 32(3): 426–438.
[40] Lommel S, Benesch S, Rottner K, Franz T, Wehland J, Kühn R. Actin
pedestal formation by enteropathogenic Escherichia coli and intracellular motility
of Shigella flexneri are abolished in N-WASP-defective cells. EMBO Rep, 2001,
2(9): 850–857.
[41] Jain N, Lim LW, Tan WT, George B, Makeyev E, Thanabalu T. Conditional
N-WASP knockout in mouse brain implicates actin cytoskeleton regulation in
hydrocephalus pathology. Exp Neurol, 2014, 254: 29–40.
[42] Sheldon M, Rice DS, D'Arcangelo G, Yoneshima H, Nakajima K,
Mikoshiba K, Howell BW, Cooper JA, Goldowitz D, Curran T. Scrambler and yotari
disrupt the disabled gene and produce a reeler-like phenotype in mice. Nature,
1997, 389(6652): 730–733.
[43] Suetsugu S, Tezuka T, Morimura T, Hattori M, Mikoshiba K, Yamamoto T,
Takenawa T. Regulation of actin cytoskeleton by mDab1 through N-WASP and
ubiquitination of mDab1. Biochem J, 2004, 384(Pt 1): 1–8.
[44] The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA
elements in the human genome. Nature, 2012, 489(7414): 57–74.
[45] Tsuchiya D, Kitamura Y, Takata K, Sugisaki T, Taniguchi T, Uemura K,
Miki H, Takenawa T, Shimohama S. Developmental expression of neural Wiskott-
Aldrich syndrome protein (N-WASP) and WASP family verprolin- homologous
protein (WAVE)-related proteins in postnatal rat cerebral cortex and hippocampus.
Neurosci Res, 2006, 56(4): 459–469.
[46] Abe T, Kato M, Miki H, Takenawa T, Endo T. Small GTPase Tc10 and its
homologue RhoT induce N-WASP- mediated long process formation and neurite
outgrowth. J Cell Sci, 2003, 116(Pt 1): 155–168.
[47] Pommereit D, Wouters FS. An NGF-induced Exo70-TC10 complex
locally antagonises Cdc42-mediated activation of N-WASP to modulate neurite
outgrowth. J Cell Sci, 2007, 120(Pt 15): 2694–2705.
[48] Wegner AM, Nebhan CA, Hu L, Majumdar D, Meier KM, Weaver AM,
Webb DJ. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the
development of dendritic spines and synapses. J Biol Chem, 2008, 283(23):
15912–15920.
[49] You JJ, Lin-Chao S. Gas7 functions with N-WASP to regulate the neurite
outgrowth of hippocampal neurons. J Biol Chem, 2010, 285(15): 11652–11666.
[50] Mohamed AM, Boudreau JR, Yu FPS, Liu J, Chin-Sang ID. The
Caenorhabditis elegans Eph receptor activates NCK and N-WASP, and inhibits
Ena/VASP to regulate growth cone dynamics during axon guidance. PLoS Genet,
2012, 8(2): e1002513.
[51] Tsai JW, Chen Y, Kriegstein AR, Vallee RB. LIS1 RNA interference blocks
neural stem cell division, morphogenesis, and motility at multiple stages. J Cell
Biol, 2005, 170(6): 935–945.
[52] Bai JJ, Ramos RL, Ackman JB, Thomas AM, Lee RV, LoTurco JJ. RNAi
reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat
Neurosci, 2003, 6(12): 1277–1283.
[53] Xiao F, Wang XF, Li JM, Xi ZQ, Lu Y, Wang L, Zeng Y, Guan LF, Yuan J.
Overexpression of N-WASP in the brain of human epilepsy. Brain Res, 2008, 1233:
168–175.
[54] Kovacs EM, Verma S, Ali RG, Ratheesh A, Hamilton NA, Akhmanova A,
Yap AS. N-WASP regulates the epithelial junctional actin cytoskeleton through a
non-canonical post-nucleation pathway. Nat Cell Biol, 2011, 13(8): 934– 943.
[55] Luan Q, Zelter A, MacCoss MJ, Davis TN, Nolen BJ. Identification of
Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP) binding sites on the branched actin
filament nucleator Arp2/3 complex. Proc Natl Acad Sci USA, 2018, 115(7): E1409–
E1418.