2024年4月10日发(作者：敬学真)
滚苏农整学缀（？妇垮狂王醪蔗舒＆ｉ》，∞０９。２５（２）：３１５～３１９
３１５
褪黑素在猪精液保存中的抗氧化作用
杜立银１∥，
曹少先１，
郭
炜３，
互海英４，
翅铁铮’
（１．江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京２１００１４；２．内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽０２８０００；３．内
蒙古通辽市动物疾病预防控制中心，内蒙古通辽０２８０００；４．内蒙古通辽市科尔沁医动物检疫站，内蒙古邋辽０２８０００）
摘要：
为探讨褪黑素（ＭＬＴ）在猪精液保存中的抗精子氧化损伤效应，采用分步筛选的方法，首先在１５℃保
ｘ
存耀释媾渡孛分别添按ｌ×ｌＯ。珏拍ｙＬ（醒１）、ｌ
ｌＯ。啪ｌ／Ｌ（醚２）、ｌ
ｘｌＯ一嘲ｙ联Ａ垂３）、ｌ×ｌＯ—ｍ彬Ｌ（§赫）穰ｌ×
ｌＯ～蝴ＶＬ（１垤５）ＭＬＴ，以不添棚ＭＬＴ为对照组（Ｍｏ），梭验并选择Ｍ班有效浓度用予１５气保存的离心精液，检验
并选择ＭＬＴ最佳浓度用于冷冻精液。结果表明：在保襻６
ｄ的稀释犄液中，Ｍｌ、Ｍ２和Ｍ３组精子活率（删Ｓ）、质膜
完整馕（Ｐ枷）和顼体完整性（ＮＡＲ）均高于猢，№最蹇，嫩、渺则驻著低于ＭＯ（尹＜ｏ。０５）；嚣二醛（Ｍ姒）浓度均
低于潲，并以Ｍ２为拐点先降瓣升；选择弑ｌ、§１２和甄３用于离心糟滚保存，６
ｄ后霸蟋帮ＮＡＲ均高予对照组，盛
Ｍ２与对照差异显蓉（Ｐ＜Ｏ．０５），ＭＤＡ浓度则逐渐降低凰与对照差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５）；选择Ｍ２用于精液冷冻保存，
解冻精液珊烙、Ｐｌ垤ｌ、ＮＡＲ和线粒体膜电位（Ｍｔ—ＭＰ）显著提高（ＪＰ＜Ｏ。０５），ＭＤＡ浓度显著降低（Ｐ＜Ｏ．０５）。可见，添
翻适宜浓度麓疆镌够｝牵裁稀释、离心及冷冻保存雍耪滚串的穗子氯化攒侥，显蔫提高糖滚绦存质量。
关键词：褪黑索；氧化攒伤；猪；精于
中图分类号：ｓ８２８．２１３＋．４文黻标识码：Ａ文章编号：ｌＯｏｏ—甜４０（２００９）０２ｍ３１５Ｊ０５
ＡｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＴⅥｅｌａｔｏｎｉｎ
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（１．加ｔ豇腑矿Ａｎｆｍ甜眦６蝴嘶，胁咿ⅡＡ咖矿Ａ∥础Ⅱ矧ｓｃ拥删，Ⅳ口，舛昭２ｌｏｏｌ４，蕊舰；２．Ｃｂ豇咿矿Ａ砌砝ｓ渤矬脚越融蝴，加ｌｅｒ
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敞０２８０００，ｃ矗玩；４．‰五斑ｍ矗铷椰晒掰删觚矿娜鼬施万玉ｍ秽删妊孙礤汹，殇嚼洳０２８０００，ｃ矗跳）
Ａｂｓｔ均ｃｔ：
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ＭＤＡ
ｇ蒯ｕａｕｙ
ＮＡＲ
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收甍日期：２００８－ｌＯ・１６
蕊金项目：江苏省农监科学院搏士后墓禽（０２６０ｌ贷１０６０２）；内蒙吉
民旅大学博士研究项目（Ｂｓ０２０）
作者简介：杜搬银（ｔ９７２．）。男，内蒙古通ｉ￡人，博士，副教授，主要研
ｃ陀ａｓｅｄ
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ｃｏｎｔｒｏｌ
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ｃ蚰ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆＭＤＡ
ｙａｈｏｏ．㈣．ｃｎ
通讯作者：刘铁铮，（１Ｗ）０２５ｉ８４３９０３４９
ｗ鹪ｌｏｗｅｒ
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ｔｈａｎ
ｃｏｒＩｔｒｏｌ
（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎ
ｃｏｎｅｌｕ８ｉｏｎ，ａｄｄｉｔｉ蝴ｏｆｏｐｔｉｍａｌ
ｃｏｎｃｅｎ吼一
万方数据
３１６
江苏农业学报２００９年第２５卷第２期
ｔｉｏｎｏｆＭＬＴ
ｐｒｅＶｅｎｔｅｄ
Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：
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ｂｏ缸ｓｅｒｎｅｎ．
ｍｅｌａｔｏｎｉｎ；ｏｘｉｄａｔｉＶｅ
ｄ肌ａｇｅ；ｂｏａｒ；
ｓｐｅ硼ａｔｏｚｏａ
猪精液体外保存效果与活性氧（Ｒｅａｃｔｉｖｅ
ｏｘｙｇｅｎ
ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）浓度密切相关…，ＲＯＳ通过氧化质膜、
干扰新陈代谢等途径诱发精子的过氧化损伤【２Ｊ，影
响猪精液保存效果。研究＂’４。表明，液态保存的猪
精液接触空气、温度变化，冷冻保存的离心、冷却、冷
冻及解冻过程均可导致精液中ＲＯＳ浓度升高，使精
子氧化损伤加剧。近年来，国外有人发现，添加抗氧
化剂可以提高猪精液保存效果，如还原型谷胱甘肽
（ＧＳＨ）在提高冷冻一解冻猪精液的精子活率（删ｓ）、
质膜完整性（Ｐｌａｓｍａ
ｍｅｍｂ啪ｅ
ｉｎｔｅ加ｔｙ，ＰＭＩ）和顶
体完整性（ＮｏⅢＩａｌ
ａｃｒｏｓｏｍａｌ
ｒｉｄｇｅ，ＮＡＲ）ｐ１等方面
具有显著效果。
褪黑素（Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ，ＭＬＴ）化学名为Ｎ一乙酰－５一甲
氧基．色胺，是松果腺分泌的一种重要激素，具有高
度亲脂性和部分亲水性，可弥散穿透各种生理屏障，
在细胞膜、细胞质和细胞核中发挥强大的抗氧化作
用，能够有效清除ＲＯＳ帕Ｊ。有研究＂１证实，ＭＬＴ对
仓鼠睾丸内自然氧化及诱导发生的脂质过氧化反
应、体外精子质膜过氧化反应均有显著抑制作用，并
使精子线粒体免受ＲＯｓ攻击。但不同报道的有效
ＭＬＴ添加浓度存在明显差异。目前，ＭＬＴ在猪精液
保存上的应用报道较少，特别是在精液冷冻保存方
面尚未见报道。为此本试验将探讨ＭＬＴ在１５℃液
态保存和冷冻保存猪精液中的精子保护作用及适宜
添加浓度。
１材料与方法
１．１试验动物与精液采集
选用江苏省宜兴ＴＯＰＩＧ国际（中国）种猪扩繁
场中２～３岁、健康３０系公猪３头，徒手把握法收集
射出精液中段浓稠部分（活力≥０．８、密度≥１
ｒＩｌｌ
３．０×１０８个）用于本试验。
１．２主要试剂与仪器
褪黑素（Ｓｉｇｍａ公司产品）、ＯＥＰ（ＮＯＶＡ
Ｃｈｅｍｉ－
ｃａｌ
ｓａｌｅｓ公司产品）、Ｊｃ一１线粒体膜电位检测试剂盒
（碧云天生物技术研究所产品）、丙二醛测定试剂盒
（南京建成生物工程研究所产品）、Ｏ．５ｌＴＩｌ细管及封
口粉（沈阳富士平公司产品），其他试剂均为ＡＲ级，
双蒸水配制溶液。仪器有荧光显微镜（ＯＬＹＭＰｕｓ—
万方数据
ｃｘ４１）、倒置相差显微镜（ＯＬＹＭＰｕｓ一１Ｕ４１）、紫外分
光光度仪（ＵＶ７５７型）。
１．３精液处理过程
稀释：将３份精液（采自３头公猪）混匀，２２℃
平衡ｌ
ｈ，用等温Ｂ佟稀释液【８１等体积稀释，充分混
匀，１ｈ内降温至１５℃并保存；离心：稀释精液经
１５℃平衡２ｈ后，ｌ
６００
ｇ离心５ｍｉｎ，弃掉上清，用
等体积Ｂ偈重悬，１５℃保存；冷冻：参考１＇ｌｌｕｒｓｔｏｎ等
报道的方法【９Ｊ，用乳糖一卵黄（ＬＥＹ）重悬离心沉淀
物，使精液终浓度为ｌ
ｍｌ
２．０×１０９个，０ＥＰ（Ｅｑｕｅｘ
ｓＴＭ
ｐａｓｔｅ）终浓度为１％，甘油终浓度为３％，快速
液氮冷冻（先在液氮上方３ｃｍ处熏蒸５
ｍｉｎ，再投入
液氮），３７℃水浴解冻３０８。按Ｒｏｃａ等的方法¨１配
制Ｂ，Ｉ．ｓ稀释液和ＬＥＹ保护液。
１．４
ＭＬＴ添加浓度与指标检验方法
取５组１５℃保存的稀释精液，分别添加ＭＬＴ，
使ＭＬＴ终浓度分别为１×ｌＯ—ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ１组）、
１×１０～ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ２组）、１×１０～ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ３组）、
ｌ×１０一ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ４组）和ｌ×１０～ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ５组），
对照组（Ｍ０）不添加ＭＬＴ。检验保存ｌ
ｄ、２ｄ、３ｄ、６
ｄ的精液ｍ缁、ＰＭＩ、ＮＡＲ百分率，测定３
ｄ、６
ｄ精液
的ＭＤＡ浓度；依据稀释精液试验结果，选择离心精
液的ＭＬＴ添加浓度，对照组为稀释精液（Ｃ１）和离
心精液（ｃ２），分别检验保存Ｏ
ｄ、ｌ
ｄ、３ｄ、６
ｄ精液
删Ｓ、ＮＡＲ百分率，测定３
ｄ、６
ｄ精液中ＭＤＡ浓度；
据上述结果优选最佳ＭＬＴ浓度用于精液冷冻保存，
检验解冻精液删ｓ、ＰＭＩ、ＮＡＲ及线粒体膜电位（Ｍｉ—
ｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
ｍｅｍｂｒ觚ｅ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｍｔ—ＭＰ），测定ＭＤＡ
浓度。
办仍测定：显微镜（４００×）镜检估计（至少计数
３００个精子，下同）；ＰＭｌ测定：ＨＯｓＴ低渗肿胀试
验【ｌ
０｜，计数尾部呈“ｇ”型肿胀精子；ＮＡＲ测定：考马
斯亮蓝Ｇ－２５０染色法，显微镜估计顶体呈蓝色且边
缘光滑的精子；Ｍｔ—ＭＰ测定：ＪＣ．１染色法（按ＪＣ－ｌ试
剂盒说明），荧光显微镜计数尾部呈橘红色荧光的
精子；丙二醛（ＭＤＡ）浓度测定：紫外分光光度法（丙
二醛测定试剂盒说明）。
１．５统计方法
试验数据应用ＳＰｓｓｌ３．Ｏ统计软件ＡＮＯＶＡ进
杜立银等：褪黑紊在猪精液保存中的抗氧化作用
３１７
行方差分析，ＤｕｎｃａＩｌ’ｓ法进行多重比较检验差异显
著性。表中数据均为５次重复平均值。
和Ｍ５显著低于Ｍ０（Ｐ＜Ｏ．０５）。这表明，添加１×
１０～ｍｏＬ／Ｌ
ＭＬＴ有利于提高稀释猪精液１５
ｃｃ保存
ｄ后稀释精液中ＭＤＡ浓
２结果
２．１
的效果。
由表２可见，保存３
ｄ、６
ＭＬＴ在稀释猪精液中的作用
由表１可见，在１５℃保存条件下，稀释猪精液
度以１Ⅵ２为拐点呈先降后升的变化；保存３
ｄ后，Ｍ１、
Ｍ２、№和附均低于Ｍｏ，舾则显著高于Ｍ０（Ｐ＜
０．晒）；保存６ｄ后，各组ＭＤＡ浓度均显著低于Ｍ０（Ｐ＜
的聊Ｓ、ＰＭＩ和ＮＡＲ随ＭＬＴ浓度升高呈先升后降
的变化。其中，Ｍ１、Ｍ２和Ｍ３高于Ｍ０，且Ｍ２最高，
保存６ｄ后Ｍ２与Ｍ０差异显著（ＪＰ＜Ｏ．０５）；而Ｍ４
表ｌ
０．晒）。这表明，ｌ×１０‘５删∥Ｌ￣ⅡＪ可以显著抑制１５
℃保存稀释猪精液中脂质过氧化反应。
ＭＬＴ对稀释猪精液１ＭＳ、ＰＭｌ和ＮＡＲ的影响
ｌ
Ｔ铀ｌｅ
Ｅｆｋｔｓ
ｏｆ
ＭＬＴ娜ｐｐＩｅｍ明协Ｈｏｎ伽ＴＭＳ。ＰＭＩ
ａｎｄＮＡＲ
ｏｆ衄ｕｔｅｄ
ｂ雌ｒ鸵ｍｅｎ
同行数据后不同字母者表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。
表２ＭＬＴ对稀释猪精液ＭＤＡ浓度的影响
Ｅｆ融啮ｏｆ
Ｔａｂｋ２
加Ａ
ｉｎ
ｍＩｕｔｅｄ
ＭＬＴ蛐ｐｐＩ伽哪诅６０ｎ伽恤ｅ∞唧ｔ甩６０ｎ
ｂ眦盯ｓ哪蚰
（Ｃ２）的删５和ＮＡＲ显著低于稀释精液（Ｃ１）（Ｐ＜
ｏｆ
０．０５）；Ｍｌ、Ｍ２和Ｍ３均高于ｃ２，特别是Ｍ２在保存
３
ｄ、６
ｄ时均与Ｃ２差异显著（Ｐ＜０．０５）。这表明，
离心猪精液中添加１×１０一ｍｏＬ／ＬＭＬＴ能够显著提
——ＭＤＡ浓度（ｎｍｏ】／Ｌ）——
Ｏ（啪。对照组）
ｌ×ｌＯ一６（Ｍ１）
ｌ×１０一５（Ｍ【２）
ｌ×ｌＯ。４（Ｍ３）
ｌ
高保存效果。
由表４可见，离心精液保存３
ｄ、６
ｄ后，ＭＤＡ浓
１７．３９±０．３５
ａ
７６．鹋±０．２ｌ
ａ
度随ＭＬＴ升高而逐渐降低，并显著低于ｃ２（Ｐ＜
０．０５）；Ｍｌ与Ｍ２差异不显著，但均显著高于Ｍ３
（Ｐ＜０．０５）。这表明，添加ｌ×１０一～１０—ＩｎｏＬ／Ｌ
ＭＬＴ显著抑制了１５℃保存离心猪精液中脂质过氧
化反应。
ＭＬＴ在冷冻精液中的作用
ｌＯ．１６４±０．２７
ｂ
７．９６±Ｏ．１８
４１．８Ｉ±０．３６ｂ
３９．０２±Ｏ．１５ｂ
４０．５６±Ｏ．２３ｂ
４９．２９±０．３４
ｃ
１１．２３±Ｏ．１ｌｂ
ｘ１０‘３（Ｍ４）
１５．８６±Ｏ．３２
ａ
ｃ
２．３
２４．７２±０．２５ｄ６５．６８±Ｏ．１８ｄ
ｌ×１０一２（Ｍ５）
解冻结果见表５。由表５可见，Ｍ２组删Ｓ、
ＰＭＩ、ＮＡＲ和Ｍ卜ＭＰ百分率显著高于对照组（Ｐ＜
０．０５），同时ＭＤＡ浓度显著降低（Ｐ＜０．０５）。这表
明，添加适宜浓度ＭＬＴ能够显著提高冷冻一解冻猪
精液质量，同时显著抑制脂质过氧化反应。
同列数据后不同字母者表示差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５）。
２．２
ＭＬＴ对１５℃保存离心猪精液删Ｓ、ＮＡＲ和
由表３可见，在保存时间相同条件下，离心精液
ＭＤＡ的影响
万方数据
３ｌｓ
江苏农照学报
２００９年第簦卷第２靛
两葑数擐Ｊ｜嚣不图字母考凌零差冥显著（Ｐ＜Ｏ．衢）。
表４ＭＬｌ｜对离心猪精液中ＭＤＡ浓廉的影响
Ｔａｈｌｅ４
Ｅ舶ｃｔｓ
龇趣辨Ｂ秘辩嘲泌ｂ强ｒ鞭霸熏冁
ｏｆ
ＭＬＴ娜ｐｐＩｅｍｅｎｔ趣咖ｎ
ｏｎ
ｎ＂∞ｎ咖ｔｒａ廿０ｎ
起刘抑制作用。因此，ＭＬＴ被认为是过氧化氢、羟
０ｆ
基自由基、一氧化氮自由基、过氧业硝基阴离子、过
氧纯巍由摹蠢超氧醺离子麴强力清除裁，其清除羟
基自由基的能力是ＧＳＨ的４倍、甘褥醇的１４倍，清
除过氧烷自由罐的活性是Ｖ。的２倍¨¨。
——挞Ｄ矗浓度（ｎ翻。扩Ｌ）——
Ｏ（ｃ２，对照组）
ｌ×１０—６（Ｍ１）
ｌ×ｌＯ一５（Ｍ２）
ｌ
已证实，麓疆具有离瘦亲脂性秘部分亲本性，
可通过弥散作用透过各种生理屏障，清除细胞膜、细
胞质及细胞核中ＲＯＳ。摄ＲＯｓ对人精子的氧化损
７．９５±ｏ．２８
ａ
９．６８土Ｏ．２４
ａ
４．４４±０．１２ｂ
４．２３±ｏ．０７
ｂ
３．１６±Ｏ。ｌｌ
ｅ
６．８ｌ土０．２７ｂ
６．Ｓ７士Ｏ。０９ｂ
５．５３±８．２３￡
ｘ｜Ｏ一４（馘３）
伤途径中，ＲＯＳ不仅终溺予碳水绝食物、脂类、ｐ筵矗
和蛋白质等生物大分子及其他生物小分子，诱发精
子膜结构与功能改变、线粒体及ＤＮＡ损伤，其脂质
同列数据聪不同字母者寝示差异显著（Ｐ＜０．０５）。
表５
霉ａｂ垂ｅ
ＭＬＴ对ｏ．５ｍｌ绷聱冷冻・解；客猿糖液质量的影嫡
５颡轴瞻缱鑫珏蔗靴ｐｐ薹嘲越￡联畦∞彻蛀豫ｑ黻轻姆０ｆｌ｝ｅ皑嘲・
ｔｈａｗｉ哩ｂｏ甜ｓ蝴哪ｉｎ
０．Ｓ棚ｓｔｒａ哪
Ｍ肼浓度（ｍＬ／Ｌ）
掺糍
过氧化代谢产物——嚣二醛（醚９Ａ）亦可遘一步通
过与蛋白质的交联作用而损伤细胞功能。
Ｌｕｂｏｓｈｉｔｚｋｙ等…１发现，正常人精浆的抗ＲＯＳ物质
中会０。６～５。Ｏ
ｐ∥ｍｌ醚瓣，同时精予上还存在艇疆
受体，Ｏ．２和Ｏ．４ｍｇ／ｋｇＭＬＴ即可显著抑制囱由基
对ＤＮＡ的损伤，减少ＤＮＡ加合物的产生，并悫接与
ＤＮＡ分子结合，防止核瞥酸懿氧化，麸焉保护精子
免予ＲＯｓ的氧化损伤。在本试验中，添加适宜浓度
ＭＬＴ显著提高了稀释猪精液的１５℃保存效果，添
Ｏ（猢，ｅＫ）
ｌ
ｘｌＯ一５《泣）
同行数据鼹不同字母者裘汞差异显著《尹＜Ｏ＋０５）。
热ｌ×ｌＯ～一ｌ×１０～礅∥毛鲢疆的穰释糖液保存６
ｄ詹，ｌ×１０。６
ｍｏＬ／Ｌ
ｍｏＬ／Ｌ、１×１０一５
３讨论
鸯甄ｎ等【ｌ”蓄次报道鹾疆具有抗氧纯活性以
来，人们发现Ｍ讲的抗氧化机制与Ｖ“Ｖ。和ＧｓＨ
等典型抗氧化物不同，具体表现在：ＭＬＴ分子中寓
ｍｏ∥Ｌ和ｌ×ｌＯ一４
ＭＬＴ提高了稀释猪精液的狮嬲、ＰＭＩ、ＮＡＲ百
分率、并搀制麓ＤＡ的产生，其孛ｌ×ｌＯ一耀ｏｙＬ
ＭＬＴ的效果最佳，继续提高ＭＬＴ添加浓度至
１×１０～ｍｏＬ／Ｌ、ｌ×１０～ｍｏＬ／Ｌ则诱发明显的负效
含电子，可与Ｒ礁诈用形成稳定产物，愚钱谢产物
亦能继续清除ＲＯＳ，这种连续清除ＲＯＳ的能力被称
为清除级联反应；ＭＬＴ能够协同Ｖ。、ＶＥ和ＧＳＨ发挥
作用，并增强抗氧化酶的活力及其基因表达，阁接发
应。鼯随着Ｍ搬浓度的提高，精子弱磊ｓ、ｐ麓ｌ稷
ＮＡＲ以ｌ×ｌＯ～啪沙Ｌ为拐点先升后降，而ＭＤＡ浓
度则先降后升。这可能是ＭＬＴ浓度绝对过高造成
的，也可能是精浆成分导致艇疆浓度檩对过离的结
果，因为精浆中含有一些对维持和保护精子缩构和
挥抗氧化作用¨副；此外，Ｍ珂通过增加线粒体Ｂｃｌ乏
蛋白水平并降低细胞内Ｂａｘ蛋白水平，对细胞凋亡
功能十分重要的固有成分，包括抗精子氧化损伤的
万方数据
杜立银等：褪黑素在猪精液保存中的抗氧化作用
３１９
酶或非酶类物质、维持精子运动和存活的必需离子、
维持膜稳定的蛋白质和脂类成分等¨４｜。进一步试
验结果表明，添加ｌ×１０一ｍｏＬ／Ｌ、１×１０～ｍｏＬ／Ｌ和
１×１０一ｍｏＬ／Ｌ
ＭＬＴ的离心精液１５℃保存后，孙舾
和ＮＡＲ百分率显著高于对照组，其变化趋势与稀释
精液相似，ＭＤＡ则依次降低，显著低于对照组。可
见，当ＭＬＴ添加浓度高于ｌ×１０～啪Ｌ／Ｌ时，其精子
保护作用降低甚至产生负效应是浓度绝对过高的结
果，离心去除精浆非但未对ＭＬＴ适宜添加浓度产生
显著影响，还显著降低了由精浆成分氧化产生的
ＭＤＡ浓度。因此，添加ｌ×１０ｑ
ｍｏＬ／Ｌ
ＭＬＴ有利于
提高猪精液的保存质量。
稀释与离心过程是猪精液冷冻保存的必需步
骤，有效抑制冷冻前精液中ＲＯＳ对精子结构和功能
的直接或潜在性损伤对于提高冷冻保存效果十分重
要，添加ＧＳＨ”’等多种抗氧化剂有利于提高猪精液
冷冻保存的效果。虽然鲜有ＭＬＴ的相关报道，但有
研究¨５１证实，ＭＬＴ在抑制仓鼠睾丸内自然氧化和被
诱导的脂质过氧化反应、体外精子质膜过氧化反应、
保护精子线粒体免受ＲＯｓ攻击上具有显著作用。
在本试验中，添加１×１０。ｍｏＬ／ＬＭＬＴ显著提高了
冷冻．解冻猪精液的ＴＭＳ、ＰＭＩ和ＮＡＲ百分率，同时
使ＭＤＡ浓度显著降低。此外，Ｊｃ．１染色法检验的
线粒体膜电位（Ｍｔ－ＭＰ）处于较高状态（尾部线粒体
鞘膜上呈橘红色荧光）精子的百分率亦显著高于对
照组，这与Ｐｅｎａ等¨刮的试验结果一致。在评价精
子功能的诸多指标中，线粒体膜活性（Ｍｔ．ＭＰ），即膜
电位的高低是衡量精子功能和精液质量的一项新的
关键指标，与精子的运动能力密切相关，比删Ｓ、
ＰＭＩ和ＮＡＲ等更能准确反映精子的功能状态。Ｍｔ—
ＭＰ越高表明线粒体的结构越完整，为精子运动提
供能量的潜力越大。在线粒体膜活性的荧光染色检
验方法中。ＪＣ．１染色被认为是一种理想的检验方
法，其特异性优于Ｒｈｌ２３、ＭＩＴＯ等染色方法，能准确
区分线粒体的活性状态。
４结论
添加１×１０－。ｍｏＬ／ＬＭＬＴ可以抑制ＲＯＳ诱发
的精子氧化损伤，降低精液中脂质过氧化产物——
ＭＤＡ浓度，提高精子活率、质膜完整性、顶体完整性
和线粒体膜活性，对提高猪精液的保存质量具有显
著作用。但仍有必要在本试验的基础上，进一步缩
小浓度水平的梯度，以确定ＭＬＴ在体外保存猪精液
中最适添加浓度。
万方数据
参考文献：
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2024年4月10日发(作者：敬学真)
滚苏农整学缀（？妇垮狂王醪蔗舒＆ｉ》，∞０９。２５（２）：３１５～３１９
３１５
褪黑素在猪精液保存中的抗氧化作用
杜立银１∥，
曹少先１，
郭
炜３，
互海英４，
翅铁铮’
（１．江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京２１００１４；２．内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽０２８０００；３．内
蒙古通辽市动物疾病预防控制中心，内蒙古通辽０２８０００；４．内蒙古通辽市科尔沁医动物检疫站，内蒙古邋辽０２８０００）
摘要：
为探讨褪黑素（ＭＬＴ）在猪精液保存中的抗精子氧化损伤效应，采用分步筛选的方法，首先在１５℃保
ｘ
存耀释媾渡孛分别添按ｌ×ｌＯ。珏拍ｙＬ（醒１）、ｌ
ｌＯ。啪ｌ／Ｌ（醚２）、ｌ
ｘｌＯ一嘲ｙ联Ａ垂３）、ｌ×ｌＯ—ｍ彬Ｌ（§赫）穰ｌ×
ｌＯ～蝴ＶＬ（１垤５）ＭＬＴ，以不添棚ＭＬＴ为对照组（Ｍｏ），梭验并选择Ｍ班有效浓度用予１５气保存的离心精液，检验
并选择ＭＬＴ最佳浓度用于冷冻精液。结果表明：在保襻６
ｄ的稀释犄液中，Ｍｌ、Ｍ２和Ｍ３组精子活率（删Ｓ）、质膜
完整馕（Ｐ枷）和顼体完整性（ＮＡＲ）均高于猢，№最蹇，嫩、渺则驻著低于ＭＯ（尹＜ｏ。０５）；嚣二醛（Ｍ姒）浓度均
低于潲，并以Ｍ２为拐点先降瓣升；选择弑ｌ、§１２和甄３用于离心糟滚保存，６
ｄ后霸蟋帮ＮＡＲ均高予对照组，盛
Ｍ２与对照差异显蓉（Ｐ＜Ｏ．０５），ＭＤＡ浓度则逐渐降低凰与对照差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５）；选择Ｍ２用于精液冷冻保存，
解冻精液珊烙、Ｐｌ垤ｌ、ＮＡＲ和线粒体膜电位（Ｍｔ—ＭＰ）显著提高（ＪＰ＜Ｏ。０５），ＭＤＡ浓度显著降低（Ｐ＜Ｏ．０５）。可见，添
翻适宜浓度麓疆镌够｝牵裁稀释、离心及冷冻保存雍耪滚串的穗子氯化攒侥，显蔫提高糖滚绦存质量。
关键词：褪黑索；氧化攒伤；猪；精于
中图分类号：ｓ８２８．２１３＋．４文黻标识码：Ａ文章编号：ｌＯｏｏ—甜４０（２００９）０２ｍ３１５Ｊ０５
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（１．加ｔ豇腑矿Ａｎｆｍ甜眦６蝴嘶，胁咿ⅡＡ咖矿Ａ∥础Ⅱ矧ｓｃ拥删，Ⅳ口，舛昭２ｌｏｏｌ４，蕊舰；２．Ｃｂ豇咿矿Ａ砌砝ｓ渤矬脚越融蝴，加ｌｅｒ
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敞０２８０００，ｃ矗玩；４．‰五斑ｍ矗铷椰晒掰删觚矿娜鼬施万玉ｍ秽删妊孙礤汹，殇嚼洳０２８０００，ｃ矗跳）
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收甍日期：２００８－ｌＯ・１６
蕊金项目：江苏省农监科学院搏士后墓禽（０２６０ｌ贷１０６０２）；内蒙吉
民旅大学博士研究项目（Ｂｓ０２０）
作者简介：杜搬银（ｔ９７２．）。男，内蒙古通ｉ￡人，博士，副教授，主要研
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ｃｏｎｔｒｏｌ
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ｃ蚰ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆＭＤＡ
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通讯作者：刘铁铮，（１Ｗ）０２５ｉ８４３９０３４９
ｗ鹪ｌｏｗｅｒ
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ｔｈａｎ
ｃｏｒＩｔｒｏｌ
（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎ
ｃｏｎｅｌｕ８ｉｏｎ，ａｄｄｉｔｉ蝴ｏｆｏｐｔｉｍａｌ
ｃｏｎｃｅｎ吼一
万方数据
３１６
江苏农业学报２００９年第２５卷第２期
ｔｉｏｎｏｆＭＬＴ
ｐｒｅＶｅｎｔｅｄ
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ｗｏｒｄｓ：
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ｄ踟ａｇｅ
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ＲＯＳ粕ｄ
ｉｍｐｒｏｖｅｄ
ｔＩｌｅ
ｑｕａｌｉｔｙ
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ｍｅｌａｔｏｎｉｎ；ｏｘｉｄａｔｉＶｅ
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猪精液体外保存效果与活性氧（Ｒｅａｃｔｉｖｅ
ｏｘｙｇｅｎ
ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）浓度密切相关…，ＲＯＳ通过氧化质膜、
干扰新陈代谢等途径诱发精子的过氧化损伤【２Ｊ，影
响猪精液保存效果。研究＂’４。表明，液态保存的猪
精液接触空气、温度变化，冷冻保存的离心、冷却、冷
冻及解冻过程均可导致精液中ＲＯＳ浓度升高，使精
子氧化损伤加剧。近年来，国外有人发现，添加抗氧
化剂可以提高猪精液保存效果，如还原型谷胱甘肽
（ＧＳＨ）在提高冷冻一解冻猪精液的精子活率（删ｓ）、
质膜完整性（Ｐｌａｓｍａ
ｍｅｍｂ啪ｅ
ｉｎｔｅ加ｔｙ，ＰＭＩ）和顶
体完整性（ＮｏⅢＩａｌ
ａｃｒｏｓｏｍａｌ
ｒｉｄｇｅ，ＮＡＲ）ｐ１等方面
具有显著效果。
褪黑素（Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ，ＭＬＴ）化学名为Ｎ一乙酰－５一甲
氧基．色胺，是松果腺分泌的一种重要激素，具有高
度亲脂性和部分亲水性，可弥散穿透各种生理屏障，
在细胞膜、细胞质和细胞核中发挥强大的抗氧化作
用，能够有效清除ＲＯＳ帕Ｊ。有研究＂１证实，ＭＬＴ对
仓鼠睾丸内自然氧化及诱导发生的脂质过氧化反
应、体外精子质膜过氧化反应均有显著抑制作用，并
使精子线粒体免受ＲＯｓ攻击。但不同报道的有效
ＭＬＴ添加浓度存在明显差异。目前，ＭＬＴ在猪精液
保存上的应用报道较少，特别是在精液冷冻保存方
面尚未见报道。为此本试验将探讨ＭＬＴ在１５℃液
态保存和冷冻保存猪精液中的精子保护作用及适宜
添加浓度。
１材料与方法
１．１试验动物与精液采集
选用江苏省宜兴ＴＯＰＩＧ国际（中国）种猪扩繁
场中２～３岁、健康３０系公猪３头，徒手把握法收集
射出精液中段浓稠部分（活力≥０．８、密度≥１
ｒＩｌｌ
３．０×１０８个）用于本试验。
１．２主要试剂与仪器
褪黑素（Ｓｉｇｍａ公司产品）、ＯＥＰ（ＮＯＶＡ
Ｃｈｅｍｉ－
ｃａｌ
ｓａｌｅｓ公司产品）、Ｊｃ一１线粒体膜电位检测试剂盒
（碧云天生物技术研究所产品）、丙二醛测定试剂盒
（南京建成生物工程研究所产品）、Ｏ．５ｌＴＩｌ细管及封
口粉（沈阳富士平公司产品），其他试剂均为ＡＲ级，
双蒸水配制溶液。仪器有荧光显微镜（ＯＬＹＭＰｕｓ—
万方数据
ｃｘ４１）、倒置相差显微镜（ＯＬＹＭＰｕｓ一１Ｕ４１）、紫外分
光光度仪（ＵＶ７５７型）。
１．３精液处理过程
稀释：将３份精液（采自３头公猪）混匀，２２℃
平衡ｌ
ｈ，用等温Ｂ佟稀释液【８１等体积稀释，充分混
匀，１ｈ内降温至１５℃并保存；离心：稀释精液经
１５℃平衡２ｈ后，ｌ
６００
ｇ离心５ｍｉｎ，弃掉上清，用
等体积Ｂ偈重悬，１５℃保存；冷冻：参考１＇ｌｌｕｒｓｔｏｎ等
报道的方法【９Ｊ，用乳糖一卵黄（ＬＥＹ）重悬离心沉淀
物，使精液终浓度为ｌ
ｍｌ
２．０×１０９个，０ＥＰ（Ｅｑｕｅｘ
ｓＴＭ
ｐａｓｔｅ）终浓度为１％，甘油终浓度为３％，快速
液氮冷冻（先在液氮上方３ｃｍ处熏蒸５
ｍｉｎ，再投入
液氮），３７℃水浴解冻３０８。按Ｒｏｃａ等的方法¨１配
制Ｂ，Ｉ．ｓ稀释液和ＬＥＹ保护液。
１．４
ＭＬＴ添加浓度与指标检验方法
取５组１５℃保存的稀释精液，分别添加ＭＬＴ，
使ＭＬＴ终浓度分别为１×ｌＯ—ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ１组）、
１×１０～ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ２组）、１×１０～ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ３组）、
ｌ×１０一ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ４组）和ｌ×１０～ｍｏＬ／Ｌ（Ｍ５组），
对照组（Ｍ０）不添加ＭＬＴ。检验保存ｌ
ｄ、２ｄ、３ｄ、６
ｄ的精液ｍ缁、ＰＭＩ、ＮＡＲ百分率，测定３
ｄ、６
ｄ精液
的ＭＤＡ浓度；依据稀释精液试验结果，选择离心精
液的ＭＬＴ添加浓度，对照组为稀释精液（Ｃ１）和离
心精液（ｃ２），分别检验保存Ｏ
ｄ、ｌ
ｄ、３ｄ、６
ｄ精液
删Ｓ、ＮＡＲ百分率，测定３
ｄ、６
ｄ精液中ＭＤＡ浓度；
据上述结果优选最佳ＭＬＴ浓度用于精液冷冻保存，
检验解冻精液删ｓ、ＰＭＩ、ＮＡＲ及线粒体膜电位（Ｍｉ—
ｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
ｍｅｍｂｒ觚ｅ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｍｔ—ＭＰ），测定ＭＤＡ
浓度。
办仍测定：显微镜（４００×）镜检估计（至少计数
３００个精子，下同）；ＰＭｌ测定：ＨＯｓＴ低渗肿胀试
验【ｌ
０｜，计数尾部呈“ｇ”型肿胀精子；ＮＡＲ测定：考马
斯亮蓝Ｇ－２５０染色法，显微镜估计顶体呈蓝色且边
缘光滑的精子；Ｍｔ—ＭＰ测定：ＪＣ．１染色法（按ＪＣ－ｌ试
剂盒说明），荧光显微镜计数尾部呈橘红色荧光的
精子；丙二醛（ＭＤＡ）浓度测定：紫外分光光度法（丙
二醛测定试剂盒说明）。
１．５统计方法
试验数据应用ＳＰｓｓｌ３．Ｏ统计软件ＡＮＯＶＡ进
杜立银等：褪黑紊在猪精液保存中的抗氧化作用
３１７
行方差分析，ＤｕｎｃａＩｌ’ｓ法进行多重比较检验差异显
著性。表中数据均为５次重复平均值。
和Ｍ５显著低于Ｍ０（Ｐ＜Ｏ．０５）。这表明，添加１×
１０～ｍｏＬ／Ｌ
ＭＬＴ有利于提高稀释猪精液１５
ｃｃ保存
ｄ后稀释精液中ＭＤＡ浓
２结果
２．１
的效果。
由表２可见，保存３
ｄ、６
ＭＬＴ在稀释猪精液中的作用
由表１可见，在１５℃保存条件下，稀释猪精液
度以１Ⅵ２为拐点呈先降后升的变化；保存３
ｄ后，Ｍ１、
Ｍ２、№和附均低于Ｍｏ，舾则显著高于Ｍ０（Ｐ＜
０．晒）；保存６ｄ后，各组ＭＤＡ浓度均显著低于Ｍ０（Ｐ＜
的聊Ｓ、ＰＭＩ和ＮＡＲ随ＭＬＴ浓度升高呈先升后降
的变化。其中，Ｍ１、Ｍ２和Ｍ３高于Ｍ０，且Ｍ２最高，
保存６ｄ后Ｍ２与Ｍ０差异显著（ＪＰ＜Ｏ．０５）；而Ｍ４
表ｌ
０．晒）。这表明，ｌ×１０‘５删∥Ｌ￣ⅡＪ可以显著抑制１５
℃保存稀释猪精液中脂质过氧化反应。
ＭＬＴ对稀释猪精液１ＭＳ、ＰＭｌ和ＮＡＲ的影响
ｌ
Ｔ铀ｌｅ
Ｅｆｋｔｓ
ｏｆ
ＭＬＴ娜ｐｐＩｅｍ明协Ｈｏｎ伽ＴＭＳ。ＰＭＩ
ａｎｄＮＡＲ
ｏｆ衄ｕｔｅｄ
ｂ雌ｒ鸵ｍｅｎ
同行数据后不同字母者表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。
表２ＭＬＴ对稀释猪精液ＭＤＡ浓度的影响
Ｅｆ融啮ｏｆ
Ｔａｂｋ２
加Ａ
ｉｎ
ｍＩｕｔｅｄ
ＭＬＴ蛐ｐｐＩ伽哪诅６０ｎ伽恤ｅ∞唧ｔ甩６０ｎ
ｂ眦盯ｓ哪蚰
（Ｃ２）的删５和ＮＡＲ显著低于稀释精液（Ｃ１）（Ｐ＜
ｏｆ
０．０５）；Ｍｌ、Ｍ２和Ｍ３均高于ｃ２，特别是Ｍ２在保存
３
ｄ、６
ｄ时均与Ｃ２差异显著（Ｐ＜０．０５）。这表明，
离心猪精液中添加１×１０一ｍｏＬ／ＬＭＬＴ能够显著提
——ＭＤＡ浓度（ｎｍｏ】／Ｌ）——
Ｏ（啪。对照组）
ｌ×ｌＯ一６（Ｍ１）
ｌ×１０一５（Ｍ【２）
ｌ×ｌＯ。４（Ｍ３）
ｌ
高保存效果。
由表４可见，离心精液保存３
ｄ、６
ｄ后，ＭＤＡ浓
１７．３９±０．３５
ａ
７６．鹋±０．２ｌ
ａ
度随ＭＬＴ升高而逐渐降低，并显著低于ｃ２（Ｐ＜
０．０５）；Ｍｌ与Ｍ２差异不显著，但均显著高于Ｍ３
（Ｐ＜０．０５）。这表明，添加ｌ×１０一～１０—ＩｎｏＬ／Ｌ
ＭＬＴ显著抑制了１５℃保存离心猪精液中脂质过氧
化反应。
ＭＬＴ在冷冻精液中的作用
ｌＯ．１６４±０．２７
ｂ
７．９６±Ｏ．１８
４１．８Ｉ±０．３６ｂ
３９．０２±Ｏ．１５ｂ
４０．５６±Ｏ．２３ｂ
４９．２９±０．３４
ｃ
１１．２３±Ｏ．１ｌｂ
ｘ１０‘３（Ｍ４）
１５．８６±Ｏ．３２
ａ
ｃ
２．３
２４．７２±０．２５ｄ６５．６８±Ｏ．１８ｄ
ｌ×１０一２（Ｍ５）
解冻结果见表５。由表５可见，Ｍ２组删Ｓ、
ＰＭＩ、ＮＡＲ和Ｍ卜ＭＰ百分率显著高于对照组（Ｐ＜
０．０５），同时ＭＤＡ浓度显著降低（Ｐ＜０．０５）。这表
明，添加适宜浓度ＭＬＴ能够显著提高冷冻一解冻猪
精液质量，同时显著抑制脂质过氧化反应。
同列数据后不同字母者表示差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５）。
２．２
ＭＬＴ对１５℃保存离心猪精液删Ｓ、ＮＡＲ和
由表３可见，在保存时间相同条件下，离心精液
ＭＤＡ的影响
万方数据
３ｌｓ
江苏农照学报
２００９年第簦卷第２靛
两葑数擐Ｊ｜嚣不图字母考凌零差冥显著（Ｐ＜Ｏ．衢）。
表４ＭＬｌ｜对离心猪精液中ＭＤＡ浓廉的影响
Ｔａｈｌｅ４
Ｅ舶ｃｔｓ
龇趣辨Ｂ秘辩嘲泌ｂ强ｒ鞭霸熏冁
ｏｆ
ＭＬＴ娜ｐｐＩｅｍｅｎｔ趣咖ｎ
ｏｎ
ｎ＂∞ｎ咖ｔｒａ廿０ｎ
起刘抑制作用。因此，ＭＬＴ被认为是过氧化氢、羟
０ｆ
基自由基、一氧化氮自由基、过氧业硝基阴离子、过
氧纯巍由摹蠢超氧醺离子麴强力清除裁，其清除羟
基自由基的能力是ＧＳＨ的４倍、甘褥醇的１４倍，清
除过氧烷自由罐的活性是Ｖ。的２倍¨¨。
——挞Ｄ矗浓度（ｎ翻。扩Ｌ）——
Ｏ（ｃ２，对照组）
ｌ×１０—６（Ｍ１）
ｌ×ｌＯ一５（Ｍ２）
ｌ
已证实，麓疆具有离瘦亲脂性秘部分亲本性，
可通过弥散作用透过各种生理屏障，清除细胞膜、细
胞质及细胞核中ＲＯＳ。摄ＲＯｓ对人精子的氧化损
７．９５±ｏ．２８
ａ
９．６８土Ｏ．２４
ａ
４．４４±０．１２ｂ
４．２３±ｏ．０７
ｂ
３．１６±Ｏ。ｌｌ
ｅ
６．８ｌ土０．２７ｂ
６．Ｓ７士Ｏ。０９ｂ
５．５３±８．２３￡
ｘ｜Ｏ一４（馘３）
伤途径中，ＲＯＳ不仅终溺予碳水绝食物、脂类、ｐ筵矗
和蛋白质等生物大分子及其他生物小分子，诱发精
子膜结构与功能改变、线粒体及ＤＮＡ损伤，其脂质
同列数据聪不同字母者寝示差异显著（Ｐ＜０．０５）。
表５
霉ａｂ垂ｅ
ＭＬＴ对ｏ．５ｍｌ绷聱冷冻・解；客猿糖液质量的影嫡
５颡轴瞻缱鑫珏蔗靴ｐｐ薹嘲越￡联畦∞彻蛀豫ｑ黻轻姆０ｆｌ｝ｅ皑嘲・
ｔｈａｗｉ哩ｂｏ甜ｓ蝴哪ｉｎ
０．Ｓ棚ｓｔｒａ哪
Ｍ肼浓度（ｍＬ／Ｌ）
掺糍
过氧化代谢产物——嚣二醛（醚９Ａ）亦可遘一步通
过与蛋白质的交联作用而损伤细胞功能。
Ｌｕｂｏｓｈｉｔｚｋｙ等…１发现，正常人精浆的抗ＲＯＳ物质
中会０。６～５。Ｏ
ｐ∥ｍｌ醚瓣，同时精予上还存在艇疆
受体，Ｏ．２和Ｏ．４ｍｇ／ｋｇＭＬＴ即可显著抑制囱由基
对ＤＮＡ的损伤，减少ＤＮＡ加合物的产生，并悫接与
ＤＮＡ分子结合，防止核瞥酸懿氧化，麸焉保护精子
免予ＲＯｓ的氧化损伤。在本试验中，添加适宜浓度
ＭＬＴ显著提高了稀释猪精液的１５℃保存效果，添
Ｏ（猢，ｅＫ）
ｌ
ｘｌＯ一５《泣）
同行数据鼹不同字母者裘汞差异显著《尹＜Ｏ＋０５）。
热ｌ×ｌＯ～一ｌ×１０～礅∥毛鲢疆的穰释糖液保存６
ｄ詹，ｌ×１０。６
ｍｏＬ／Ｌ
ｍｏＬ／Ｌ、１×１０一５
３讨论
鸯甄ｎ等【ｌ”蓄次报道鹾疆具有抗氧纯活性以
来，人们发现Ｍ讲的抗氧化机制与Ｖ“Ｖ。和ＧｓＨ
等典型抗氧化物不同，具体表现在：ＭＬＴ分子中寓
ｍｏ∥Ｌ和ｌ×ｌＯ一４
ＭＬＴ提高了稀释猪精液的狮嬲、ＰＭＩ、ＮＡＲ百
分率、并搀制麓ＤＡ的产生，其孛ｌ×ｌＯ一耀ｏｙＬ
ＭＬＴ的效果最佳，继续提高ＭＬＴ添加浓度至
１×１０～ｍｏＬ／Ｌ、ｌ×１０～ｍｏＬ／Ｌ则诱发明显的负效
含电子，可与Ｒ礁诈用形成稳定产物，愚钱谢产物
亦能继续清除ＲＯＳ，这种连续清除ＲＯＳ的能力被称
为清除级联反应；ＭＬＴ能够协同Ｖ。、ＶＥ和ＧＳＨ发挥
作用，并增强抗氧化酶的活力及其基因表达，阁接发
应。鼯随着Ｍ搬浓度的提高，精子弱磊ｓ、ｐ麓ｌ稷
ＮＡＲ以ｌ×ｌＯ～啪沙Ｌ为拐点先升后降，而ＭＤＡ浓
度则先降后升。这可能是ＭＬＴ浓度绝对过高造成
的，也可能是精浆成分导致艇疆浓度檩对过离的结
果，因为精浆中含有一些对维持和保护精子缩构和
挥抗氧化作用¨副；此外，Ｍ珂通过增加线粒体Ｂｃｌ乏
蛋白水平并降低细胞内Ｂａｘ蛋白水平，对细胞凋亡
功能十分重要的固有成分，包括抗精子氧化损伤的
万方数据
杜立银等：褪黑素在猪精液保存中的抗氧化作用
３１９
酶或非酶类物质、维持精子运动和存活的必需离子、
维持膜稳定的蛋白质和脂类成分等¨４｜。进一步试
验结果表明，添加ｌ×１０一ｍｏＬ／Ｌ、１×１０～ｍｏＬ／Ｌ和
１×１０一ｍｏＬ／Ｌ
ＭＬＴ的离心精液１５℃保存后，孙舾
和ＮＡＲ百分率显著高于对照组，其变化趋势与稀释
精液相似，ＭＤＡ则依次降低，显著低于对照组。可
见，当ＭＬＴ添加浓度高于ｌ×１０～啪Ｌ／Ｌ时，其精子
保护作用降低甚至产生负效应是浓度绝对过高的结
果，离心去除精浆非但未对ＭＬＴ适宜添加浓度产生
显著影响，还显著降低了由精浆成分氧化产生的
ＭＤＡ浓度。因此，添加ｌ×１０ｑ
ｍｏＬ／Ｌ
ＭＬＴ有利于
提高猪精液的保存质量。
稀释与离心过程是猪精液冷冻保存的必需步
骤，有效抑制冷冻前精液中ＲＯＳ对精子结构和功能
的直接或潜在性损伤对于提高冷冻保存效果十分重
要，添加ＧＳＨ”’等多种抗氧化剂有利于提高猪精液
冷冻保存的效果。虽然鲜有ＭＬＴ的相关报道，但有
研究¨５１证实，ＭＬＴ在抑制仓鼠睾丸内自然氧化和被
诱导的脂质过氧化反应、体外精子质膜过氧化反应、
保护精子线粒体免受ＲＯｓ攻击上具有显著作用。
在本试验中，添加１×１０。ｍｏＬ／ＬＭＬＴ显著提高了
冷冻．解冻猪精液的ＴＭＳ、ＰＭＩ和ＮＡＲ百分率，同时
使ＭＤＡ浓度显著降低。此外，Ｊｃ．１染色法检验的
线粒体膜电位（Ｍｔ－ＭＰ）处于较高状态（尾部线粒体
鞘膜上呈橘红色荧光）精子的百分率亦显著高于对
照组，这与Ｐｅｎａ等¨刮的试验结果一致。在评价精
子功能的诸多指标中，线粒体膜活性（Ｍｔ．ＭＰ），即膜
电位的高低是衡量精子功能和精液质量的一项新的
关键指标，与精子的运动能力密切相关，比删Ｓ、
ＰＭＩ和ＮＡＲ等更能准确反映精子的功能状态。Ｍｔ—
ＭＰ越高表明线粒体的结构越完整，为精子运动提
供能量的潜力越大。在线粒体膜活性的荧光染色检
验方法中。ＪＣ．１染色被认为是一种理想的检验方
法，其特异性优于Ｒｈｌ２３、ＭＩＴＯ等染色方法，能准确
区分线粒体的活性状态。
４结论
添加１×１０－。ｍｏＬ／ＬＭＬＴ可以抑制ＲＯＳ诱发
的精子氧化损伤，降低精液中脂质过氧化产物——
ＭＤＡ浓度，提高精子活率、质膜完整性、顶体完整性
和线粒体膜活性，对提高猪精液的保存质量具有显
著作用。但仍有必要在本试验的基础上，进一步缩
小浓度水平的梯度，以确定ＭＬＴ在体外保存猪精液
中最适添加浓度。
万方数据
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ＴＩａｌ．１９９３。ｌ：５７和．
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ａ１．ＲｅｇＩ山吐ｉ∞０ｆ锄一
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［１３］ＬＵＢｏｓＨｒｒＺＫＹ
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Ｐ．ｓｅｍｉＩｌａｌ
ｐｌａｓ眦
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能损伤中的保护作用［Ｊ］．中华男科学杂志，０００４，ＩＯ（８）：
郁１４—６０７．
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ＦＪ，ＪＯＨＡＮＮＩｓｓ０ＮＡ，ｗＡＬＬＧＲＥＮ
Ｍ，ｅｔ
８１．Ａｎ＾ｉｏ】【ｉ—
ｄａＩｌｔ
ｓｕＰｐｌｅｎｌｅｎｔａｔｉ伽讥ｔ心ｒｏｉｍｐｒｏｖ∞ｂｏ盯叩ｌｅｍｍｏｔｉｌｉｔｙ卸ｄ
ＩＩＩｉ—
ｔｏｃｈ∞幽ａｌｍＩＩＩｂｒ∞ｅ
ｐｏｔｅｆｍａｌ
ａｆｔｅｒ
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ｄｉ‰”咖ｔ
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