2024年4月24日发(作者：逮锦欣)
中国真菌学杂志２００９年２月第４卷第１期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏｌ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９，Ｖｏｌ ４，Ｎｏ．１ ・１３・
・
论著・
新生隐球菌ＳＴＥ１ ２ｏＬ基因的克隆及表达载体的构建
朱红梅 娄永华 贾讳鹏 温海
（１．第二军医大学长征医院皮肤科，上海２００００３；２．复旦大学生命科学院，上海２００４３３）
【摘要】 目的从新生隐球菌的基因组中扩增出ＳＴＥ１２ａ基因，并构建相应的表达载体，以进一步研究ＳＴＥ１２ａ基因对隐
球菌的生长特性及致病性的影响。方法采用ＰＣＲ方法以及基因重组方法扩增并克隆新生隐球菌基因组中的ＳＴＥ１２ｏ￣基
从新生隐球菌的基因组获得ＳＴＥ１２ｃ￣全基因，建立重组子ｐＵＣｍ—
成功地克隆了新
因，建立具有表达野生型ＳＴＥ１２ｃ￣基因的表达载体。结果
ＳＴＥ１２ｗ／ＮｏｖａＢｌｕｅ以及重组表达载体质粒ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｃ￣，实现了ＳＴＥ１２ａ基因的转化并获得表达。结论
础。
生隐球菌ＳＴＥ１２ａ基因并构建了可表达野生型ＳＴＥ１２ｃ￣基因的表达载体，为进一步研究ＳＴＥ１２ｃ￣基因功能打下了良好的基
【关键词】新生隐球菌；ＳＴＥ１２ｃ￣基因；克隆；表达；质粒
【中图分类号】 Ｒ ３７９．５ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】 １６７３—３８２７（２００９）０１－００１３－０３
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ＳＴＥ１２ａ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
ＺＨＵ Ｈｏｎｇ—ｍｅｉ ，ＬＯＵ Ｙｏｎｇ—ｈｕａ ，ＪＩＡ Ｙｉ—ｐｅｎｇ ，ＷＥＮ Ｈａｉ
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｚｈｅｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００００３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３，Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ＳＴＥ１２￣ｇｅｎｅ ｉｎ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＰＣＲ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｅｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ＳＴＥ１２ａ ｇｅｎｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＳＴＥ１２ａ
ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＵＣｍ—Ｔ ｖｅｃｔｏｒ．ＥｃｏＲＩ—ＮｏｔＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ
ｐＵＣｍ—ＳＴＥ１２ａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＳＴＥ１２ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓａｍｅ ＥｃｏＲＩ—ＮｏｔＩ ｓｉｔｅ ｏｆ ｐＧＡＰＺａｌｐｈａ—Ａ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ ｙｉｅｌｄ
ｔｈｅ ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ．ＲＴ－ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＳＴＥ１２ｃ￣ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ—
ｎｔｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ＳＴＥ１２ｃ￣ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｌｄ ＳＴＥ１２ｏ￣ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｗｉｌｌ ｂｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ；ＳＴＥ１２ｏＬ ｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｌａｓｍｉｄ
［Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏｌ，２００９，４（１）：０１３－０１５］
新生隐球菌的感染好发于免疫缺陷人群，如
ＡＩＤＳ、器官移植患者，并引起致死性的中枢神经系
统病变。其致病机理及毒力已成为研究热点。
既往研究表明，在某些真菌中，ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏ—
１材料与方法
１．１ 材料
实验菌株有本室保存的新生隐球菌比利时标
准株７１（ＢＬＳ７１，血清Ａ型，ＭＡＴｏＬ型）和新生隐球
菌临床分离株（ＧＪＦ８３，血清Ｂ型，ＭＡＴｏＬ型）。大
肠菌株：ＮｏｖａＢｌｕｅ购自Ｎｏｖａｇｅｎ。
１．２主要试剂
ｇｅｎ．ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）信号传导通路重要成
员ＳＴＥ蛋白家族中的ＳＴＥ１２蛋白及其同源物与酵
母菌的毒力密切相关¨ 。本研究通过ＰＣＲ方法从
新生隐球菌的基因组中扩增出ＳＴＥ１２ｃ￣基因，并构
基因组ＤＮＡ提取试剂盒、胶回收试剂盒均购
建了相应的表达载体，以便后续进一步研究探讨
ＳＴＥ１２ｏ￣蛋白在新生隐球菌感染发病中的作用。
自上海华舜公司；ＲＴ．ＰＣＲ、ＰＣＲ试剂盒及各种限制
性内切酶、Ｔ４连接酶购自ＴＡＫＡＲＡ公司；ＰＣＲ引
物合成及基因克隆载体ｐＵＣｍ—Ｔ购自上海生工生
物工程公司；基因敲除载体ｐＧＡＰｚｃ￣－Ａ购自Ｉｎｖｉｔｒｏ—
ｇｅｎ公司。
１．３方法
基金项目：国家自然科学基金（３０５００４４１）．
作者简介：朱红梅，女（汉族），博士，主治医师．Ｅ．ｍａｉｌ：ｈｍｚｈｕ—ｃｎ＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
通讯作者：温海，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｅｎｈａｉ９８＠ｓｏｈｕ．ＣＯＢ
中国真菌学杂志２００９年２月第４卷第１期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏｌ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９，Ｖｏｌ ４，Ｎｏ．１
ＰＣＲ引物设计ＰＣＲ引物设计参考ＧｅｎｅＢａｎｋ
中Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ ３２６０９的ＳＴＥ一
１２ｅ基因信息。弓ｌ物１：５：ｇｃａｔａｇｔａｃａｇｔｃｃａｔｔｃａ一３’，弓Ｉ
物２：５ ｃａｇａｃｇａａａｔｔａｇｇａａａａｔｇ一３’，用于扩增ＳＴＥ１２ｅｔ
基因；引物３：５＂－ｔｔａｇａａｔｔｃ ａｔｇｇｇｇｔｃｔａｇｃｇｇａ一３’（引入
ＥｃｏＲＩ酶切位点），引物４：５＂－ａｔａｇｃｇｇｃｃｇｃ ｔｔａａｔｔｔｔｇｇｔａｔ－
ｔｃｔｇａ．３’（引人ＮｏｔＩ酶切位点），用于扩增ＳＴＥ１２ｅ
的全长ｃＤＮＡ。
新生隐球菌基因组的制备 实验菌株采用
ＹＰＤ于３０℃振荡培养４８ ｈ后收集菌体，按酵母基
因组抽提试剂盒的说明书进行基因组ＤＮＡ抽提，
并以１％琼脂糖电泳分析抽制备的ＤＮＡ。
ＳＴＥ１２ｃｘ基因的ＰＣＲ扩增及克隆按ＰＣＲ扩
增试剂盒的方法，用引物１、２先扩增出完整的
ＳＴＥ１２ｃｔ基因ＤＮＡ序列，然后再采用引物３、４扩增
出ＳＴＥ１２ｃ￣基因全长ｃＤＮＡ，ＰＣＲ产物经１％琼脂糖
电泳后进行胶回收目标基因片段，胶回收按试剂盒
进行，回收片段直接与ｐＵＣｍ—Ｔ载体相连，常规转
化ＮｏｖａＢｌｕｅ菌，经过培养，质粒抽提，电泳及酶切
分析等鉴定重组克隆。
ＳＴＥ１２ｅ基因的序列测定对获得的重组克隆
中的１个克隆送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ分析进行基因序列分
析，并对结果与ＧｅｎｅＢａｎｋ进行比对，以确定克隆的
基因是否准确。
ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｃＬ重组表达载体的构建将经
过序列鉴定的重组质粒以ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ双酶切，电
泳回收目标基因片段，并与ｐＧＡＰＺｅ．Ａ相同酶切位
点的载体相连，转化ＮｏｖａＢｌｕｅ菌，经培养，质粒抽
提，ＰＣＲ及酶切鉴定重组克隆。
ＳＴＥ１２ｏＬ基因表达 大量制备ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｅ
重组表达载体后，以ＳａｃＩ酶切以使ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｏｔ
线性化，以２０００微法高压脉冲方法电穿孔法转化
经过改良方法制备的新生隐球菌ＢＬＳ７１和ＧＪＦ８３
的ＳＴＥ１２ｅ基因缺陷株的感受态菌，转化菌培养于
含高浓度Ｚｅｏｃｉｎ的ＹＰＤ培养皿，于３０％培养７２ ｈ。
ＳＴＥ１２ｅ的表达分析 阳性转化菌落进行经
３０℃振荡培养４８ ｈ后，提取细胞总ＲＮＡ，以引物３、
４组合为逆转录反应的引物，扩增逆转录的ｃＤＮＡ。
ＲＴ．ＰＣＲ按试剂盒的要求的一步法进行，ＰＣＲ产物
经１％琼脂糖电泳，以检查分析ＳＴＥ１２ｃ￣的表达情
况
２结 果
２．１ ＳＴＥ１２ｏｔ基因的ＰＣＲ扩增及克隆
以引物１和２进行ＰＣＲ，分别扩增ＢＬＳ７１及
ＧＪＦ８３菌株的ＳＴＥ１２ｏ￣基因ＤＮＡ，均扩增出约３．５
ｋｂ为主带的目标基因片段（结果如图１ａ所示）。
以此ＰＣＲ产物作为模板，再以引物３和４扩增目
标基因的直接编码区域，并引入相应的酶切位点。
ＰＣＲ扩增出特异的目标基因，大小约３．０ ｋｂ（结果
如图１ｂ所示）。经胶回收与ｐＵＣｍ—Ｔ连接，转化
ＮｏｖａＢｌｕｅ后经筛选鉴定，获得重组子ｐＵＣｍ—
ＳＴＥ１２ ／Ｎ０ｖａＢｌｕｅ，以ＰＣＲ及酶切鉴定后证实。
ＳＴＥ１２ｅ基因的序列分析：对重组子的ＤＮＡ序
列分析以及与ＧｅｎｅＢａｎｋ比对表明，确定克隆的基
因ＤＮＡ序列确实系目标基因ＳＴＥ１２ｅ￣的全长ｃＤ—
ＮＡ。
２．２ ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｏｔ重组表达载体的构建
从ｐＵＣｍ．ＳＴＥ１２ｃ￣中以ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ双酶切回
收ＳＴＥ１２ｃ￣基因片段，与ｐＧＡＰＺｃ￣一Ａ相同酶切载体
相连，经过转化ＮｏｖａＢｌｕｅ，筛选重组子，酶切鉴定，
获得克隆有ＳＴＥ１２ｃ￣基因全长ｃＤＮＡ的ｐＧＡＰＺ．
ＳＴＥ１２ｅ重组表达载体（见图２）。
２．３ ＳＴＥ１２ａ基因表达分析
获得的重组载体ｐＧＡＰＺ．ＳＴＥ１２ｃ￣大量制备质
粒ＤＮＡ后，以ＳａｃＩ酶切线性化载体，经电穿孑Ｌ法转
化预先制备的新生隐球菌ＢＬＳ７１及ＧＪＦ８３的
ＳＴＥ１２ｏＬ基因缺陷株。以Ｚｅｏｃｉｎ加压筛选，得到整
合含有ＳＴＥ１２ｃ￣基因表达盒子的转化株，即
ＳＴＥ１２ｅ基因重建株。对重建株采用ＲＴ—ＰＣＲ方法
鉴定结果表明（见图３），转化株细胞中的总ＤＮＡ
能够被逆转录和扩增出ＳＴＥ１２ｃ￣的ｃＤＮＡ，说明转
化的基因在ＳＴＥ１２ｏｔ基因重建菌株中获得了表达
ＳＴＥ１２ｃ￣的活性。
３讨 论
致病真菌进入宿主体内后，周围环境温度、ｐＨ
值、渗透压等情况改变都威胁其生存，病原体必须
相应作出自身生长分化、繁殖方式的调整。既往研
究发现，丝裂原活化蛋白激酶信号级联放大系统
（ＭＡＰＫ信号传导通路）控制酿酒酵母
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等真菌的生长及分化
过程 。在致病酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ中，ＭＡＰＫ
通路成员ＳＴＥ蛋白家族中的ＳＴＥ１２蛋白为野生株
毒力所必需，对菌株交配、胞壁生物合成、菌丝形成
及在组织内的侵袭性生长起极为重要的作用 Ｊ。
在新生隐球菌中也存在类似的系统，故推测ＳＴＥ１２
中国真
菌
学杂志
2009
年
2
月
第
4
卷第
1
期
Ch
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J
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图
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2024年4月24日发(作者：逮锦欣)
中国真菌学杂志２００９年２月第４卷第１期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏｌ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９，Ｖｏｌ ４，Ｎｏ．１ ・１３・
・
论著・
新生隐球菌ＳＴＥ１ ２ｏＬ基因的克隆及表达载体的构建
朱红梅 娄永华 贾讳鹏 温海
（１．第二军医大学长征医院皮肤科，上海２００００３；２．复旦大学生命科学院，上海２００４３３）
【摘要】 目的从新生隐球菌的基因组中扩增出ＳＴＥ１２ａ基因，并构建相应的表达载体，以进一步研究ＳＴＥ１２ａ基因对隐
球菌的生长特性及致病性的影响。方法采用ＰＣＲ方法以及基因重组方法扩增并克隆新生隐球菌基因组中的ＳＴＥ１２ｏ￣基
从新生隐球菌的基因组获得ＳＴＥ１２ｃ￣全基因，建立重组子ｐＵＣｍ—
成功地克隆了新
因，建立具有表达野生型ＳＴＥ１２ｃ￣基因的表达载体。结果
ＳＴＥ１２ｗ／ＮｏｖａＢｌｕｅ以及重组表达载体质粒ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｃ￣，实现了ＳＴＥ１２ａ基因的转化并获得表达。结论
础。
生隐球菌ＳＴＥ１２ａ基因并构建了可表达野生型ＳＴＥ１２ｃ￣基因的表达载体，为进一步研究ＳＴＥ１２ｃ￣基因功能打下了良好的基
【关键词】新生隐球菌；ＳＴＥ１２ｃ￣基因；克隆；表达；质粒
【中图分类号】 Ｒ ３７９．５ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】 １６７３—３８２７（２００９）０１－００１３－０３
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ＳＴＥ１２ａ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
ＺＨＵ Ｈｏｎｇ—ｍｅｉ ，ＬＯＵ Ｙｏｎｇ—ｈｕａ ，ＪＩＡ Ｙｉ—ｐｅｎｇ ，ＷＥＮ Ｈａｉ
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｚｈｅｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００００３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３，Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ＳＴＥ１２￣ｇｅｎｅ ｉｎ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＰＣＲ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｅｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ＳＴＥ１２ａ ｇｅｎｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＳＴＥ１２ａ
ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＵＣｍ—Ｔ ｖｅｃｔｏｒ．ＥｃｏＲＩ—ＮｏｔＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ
ｐＵＣｍ—ＳＴＥ１２ａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＳＴＥ１２ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓａｍｅ ＥｃｏＲＩ—ＮｏｔＩ ｓｉｔｅ ｏｆ ｐＧＡＰＺａｌｐｈａ—Ａ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ ｙｉｅｌｄ
ｔｈｅ ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ．ＲＴ－ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＳＴＥ１２ｃ￣ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ—
ｎｔｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ＳＴＥ１２ｃ￣ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｌｄ ＳＴＥ１２ｏ￣ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｗｉｌｌ ｂｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ；ＳＴＥ１２ｏＬ ｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｌａｓｍｉｄ
［Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏｌ，２００９，４（１）：０１３－０１５］
新生隐球菌的感染好发于免疫缺陷人群，如
ＡＩＤＳ、器官移植患者，并引起致死性的中枢神经系
统病变。其致病机理及毒力已成为研究热点。
既往研究表明，在某些真菌中，ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏ—
１材料与方法
１．１ 材料
实验菌株有本室保存的新生隐球菌比利时标
准株７１（ＢＬＳ７１，血清Ａ型，ＭＡＴｏＬ型）和新生隐球
菌临床分离株（ＧＪＦ８３，血清Ｂ型，ＭＡＴｏＬ型）。大
肠菌株：ＮｏｖａＢｌｕｅ购自Ｎｏｖａｇｅｎ。
１．２主要试剂
ｇｅｎ．ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）信号传导通路重要成
员ＳＴＥ蛋白家族中的ＳＴＥ１２蛋白及其同源物与酵
母菌的毒力密切相关¨ 。本研究通过ＰＣＲ方法从
新生隐球菌的基因组中扩增出ＳＴＥ１２ｃ￣基因，并构
基因组ＤＮＡ提取试剂盒、胶回收试剂盒均购
建了相应的表达载体，以便后续进一步研究探讨
ＳＴＥ１２ｏ￣蛋白在新生隐球菌感染发病中的作用。
自上海华舜公司；ＲＴ．ＰＣＲ、ＰＣＲ试剂盒及各种限制
性内切酶、Ｔ４连接酶购自ＴＡＫＡＲＡ公司；ＰＣＲ引
物合成及基因克隆载体ｐＵＣｍ—Ｔ购自上海生工生
物工程公司；基因敲除载体ｐＧＡＰｚｃ￣－Ａ购自Ｉｎｖｉｔｒｏ—
ｇｅｎ公司。
１．３方法
基金项目：国家自然科学基金（３０５００４４１）．
作者简介：朱红梅，女（汉族），博士，主治医师．Ｅ．ｍａｉｌ：ｈｍｚｈｕ—ｃｎ＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
通讯作者：温海，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｅｎｈａｉ９８＠ｓｏｈｕ．ＣＯＢ
中国真菌学杂志２００９年２月第４卷第１期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏｌ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９，Ｖｏｌ ４，Ｎｏ．１
ＰＣＲ引物设计ＰＣＲ引物设计参考ＧｅｎｅＢａｎｋ
中Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ ３２６０９的ＳＴＥ一
１２ｅ基因信息。弓ｌ物１：５：ｇｃａｔａｇｔａｃａｇｔｃｃａｔｔｃａ一３’，弓Ｉ
物２：５ ｃａｇａｃｇａａａｔｔａｇｇａａａａｔｇ一３’，用于扩增ＳＴＥ１２ｅｔ
基因；引物３：５＂－ｔｔａｇａａｔｔｃ ａｔｇｇｇｇｔｃｔａｇｃｇｇａ一３’（引入
ＥｃｏＲＩ酶切位点），引物４：５＂－ａｔａｇｃｇｇｃｃｇｃ ｔｔａａｔｔｔｔｇｇｔａｔ－
ｔｃｔｇａ．３’（引人ＮｏｔＩ酶切位点），用于扩增ＳＴＥ１２ｅ
的全长ｃＤＮＡ。
新生隐球菌基因组的制备 实验菌株采用
ＹＰＤ于３０℃振荡培养４８ ｈ后收集菌体，按酵母基
因组抽提试剂盒的说明书进行基因组ＤＮＡ抽提，
并以１％琼脂糖电泳分析抽制备的ＤＮＡ。
ＳＴＥ１２ｃｘ基因的ＰＣＲ扩增及克隆按ＰＣＲ扩
增试剂盒的方法，用引物１、２先扩增出完整的
ＳＴＥ１２ｃｔ基因ＤＮＡ序列，然后再采用引物３、４扩增
出ＳＴＥ１２ｃ￣基因全长ｃＤＮＡ，ＰＣＲ产物经１％琼脂糖
电泳后进行胶回收目标基因片段，胶回收按试剂盒
进行，回收片段直接与ｐＵＣｍ—Ｔ载体相连，常规转
化ＮｏｖａＢｌｕｅ菌，经过培养，质粒抽提，电泳及酶切
分析等鉴定重组克隆。
ＳＴＥ１２ｅ基因的序列测定对获得的重组克隆
中的１个克隆送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ分析进行基因序列分
析，并对结果与ＧｅｎｅＢａｎｋ进行比对，以确定克隆的
基因是否准确。
ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｃＬ重组表达载体的构建将经
过序列鉴定的重组质粒以ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ双酶切，电
泳回收目标基因片段，并与ｐＧＡＰＺｅ．Ａ相同酶切位
点的载体相连，转化ＮｏｖａＢｌｕｅ菌，经培养，质粒抽
提，ＰＣＲ及酶切鉴定重组克隆。
ＳＴＥ１２ｏＬ基因表达 大量制备ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｅ
重组表达载体后，以ＳａｃＩ酶切以使ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｏｔ
线性化，以２０００微法高压脉冲方法电穿孔法转化
经过改良方法制备的新生隐球菌ＢＬＳ７１和ＧＪＦ８３
的ＳＴＥ１２ｅ基因缺陷株的感受态菌，转化菌培养于
含高浓度Ｚｅｏｃｉｎ的ＹＰＤ培养皿，于３０％培养７２ ｈ。
ＳＴＥ１２ｅ的表达分析 阳性转化菌落进行经
３０℃振荡培养４８ ｈ后，提取细胞总ＲＮＡ，以引物３、
４组合为逆转录反应的引物，扩增逆转录的ｃＤＮＡ。
ＲＴ．ＰＣＲ按试剂盒的要求的一步法进行，ＰＣＲ产物
经１％琼脂糖电泳，以检查分析ＳＴＥ１２ｃ￣的表达情
况
２结 果
２．１ ＳＴＥ１２ｏｔ基因的ＰＣＲ扩增及克隆
以引物１和２进行ＰＣＲ，分别扩增ＢＬＳ７１及
ＧＪＦ８３菌株的ＳＴＥ１２ｏ￣基因ＤＮＡ，均扩增出约３．５
ｋｂ为主带的目标基因片段（结果如图１ａ所示）。
以此ＰＣＲ产物作为模板，再以引物３和４扩增目
标基因的直接编码区域，并引入相应的酶切位点。
ＰＣＲ扩增出特异的目标基因，大小约３．０ ｋｂ（结果
如图１ｂ所示）。经胶回收与ｐＵＣｍ—Ｔ连接，转化
ＮｏｖａＢｌｕｅ后经筛选鉴定，获得重组子ｐＵＣｍ—
ＳＴＥ１２ ／Ｎ０ｖａＢｌｕｅ，以ＰＣＲ及酶切鉴定后证实。
ＳＴＥ１２ｅ基因的序列分析：对重组子的ＤＮＡ序
列分析以及与ＧｅｎｅＢａｎｋ比对表明，确定克隆的基
因ＤＮＡ序列确实系目标基因ＳＴＥ１２ｅ￣的全长ｃＤ—
ＮＡ。
２．２ ｐＧＡＰＺ—ＳＴＥ１２ｏｔ重组表达载体的构建
从ｐＵＣｍ．ＳＴＥ１２ｃ￣中以ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ双酶切回
收ＳＴＥ１２ｃ￣基因片段，与ｐＧＡＰＺｃ￣一Ａ相同酶切载体
相连，经过转化ＮｏｖａＢｌｕｅ，筛选重组子，酶切鉴定，
获得克隆有ＳＴＥ１２ｃ￣基因全长ｃＤＮＡ的ｐＧＡＰＺ．
ＳＴＥ１２ｅ重组表达载体（见图２）。
２．３ ＳＴＥ１２ａ基因表达分析
获得的重组载体ｐＧＡＰＺ．ＳＴＥ１２ｃ￣大量制备质
粒ＤＮＡ后，以ＳａｃＩ酶切线性化载体，经电穿孑Ｌ法转
化预先制备的新生隐球菌ＢＬＳ７１及ＧＪＦ８３的
ＳＴＥ１２ｏＬ基因缺陷株。以Ｚｅｏｃｉｎ加压筛选，得到整
合含有ＳＴＥ１２ｃ￣基因表达盒子的转化株，即
ＳＴＥ１２ｅ基因重建株。对重建株采用ＲＴ—ＰＣＲ方法
鉴定结果表明（见图３），转化株细胞中的总ＤＮＡ
能够被逆转录和扩增出ＳＴＥ１２ｃ￣的ｃＤＮＡ，说明转
化的基因在ＳＴＥ１２ｏｔ基因重建菌株中获得了表达
ＳＴＥ１２ｃ￣的活性。
３讨 论
致病真菌进入宿主体内后，周围环境温度、ｐＨ
值、渗透压等情况改变都威胁其生存，病原体必须
相应作出自身生长分化、繁殖方式的调整。既往研
究发现，丝裂原活化蛋白激酶信号级联放大系统
（ＭＡＰＫ信号传导通路）控制酿酒酵母
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等真菌的生长及分化
过程 。在致病酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ中，ＭＡＰＫ
通路成员ＳＴＥ蛋白家族中的ＳＴＥ１２蛋白为野生株
毒力所必需，对菌株交配、胞壁生物合成、菌丝形成
及在组织内的侵袭性生长起极为重要的作用 Ｊ。
在新生隐球菌中也存在类似的系统，故推测ＳＴＥ１２
中国真
菌
学杂志
2009
年
2
月
第
4
卷第
1
期
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