2024年4月25日发(作者：祭姣妍)
第4代大鼠脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定
李东飞;杨春;李桢;戴景兴;原林
【摘 要】背景:有文献证实以酶消化法可获得在脂肪组织间充质干细胞,传至第10
代时细胞生长仍良好,但表面标志物表达下降. 目的:分离培养大鼠脂肪组织间充质
干细胞,传代至第4代,检测免疫表型. 方法:从6只SD大鼠腹股沟脂肪垫中分离培
养脂肪组织间充质干细胞,以贴壁细胞扩增传代至第4代.相差显微镜下观察脂肪组
织间充质干细胞的形态,并用流式细胞术鉴定脂肪组织间充质干细胞的表面标志物
CD11b,CD29,CD45,CD49d,CD90 和 CD106的表达率.结果与结论:大鼠脂肪组织
间充质干细胞呈现类似成纤维细胞样形态学特征,免疫表型分析显示CD29和
CD90 呈阳性,而CD11b、CD45、CD49d和CD106呈阴性反应.结果提示通过这
种酶消化法获得的SD大鼠的脂肪组织间充质干细胞,免疫表型分析显示符合间充
质干细胞的特征.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2010(014)023
【总页数】4页(P4207-4210)
【关键词】脂肪组织;脂肪间充质干细胞;免疫表型;大鼠;细胞鉴定
【作 者】李东飞;杨春;李桢;戴景兴;原林
【作者单位】南方医科大学人体解剖学教研室,广东省广州市,510515;南方医科大
学人体解剖学教研室,广东省广州市,510515;南方医科大学人体解剖学教研室,广东
省广州市,510515;南方医科大学人体解剖学教研室,广东省广州市,510515;南方医
科大学人体解剖学教研室,广东省广州市,510515
【正文语种】中 文
【中图分类】R394.2
0 引言
目前已经从多种组织中分离出间充质干细胞，包括骨髓、脂肪、脐带血等[1-5]。
近年来对脂肪间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells,
ADMSCs)的研究证实，在特定的诱导条件下ADMSCs能够分化为肌细胞、成骨
细胞、神经细胞等各种细胞[5-7]，在细胞移植治疗中具有重要价值。作为细胞移
植的种子细胞之一，ADMSCs具有取材手术痛苦小、可重复进行、酶消化分离程
序简单等优点，吸引了众多研究者的兴趣[8-10]。在ADMSCs进行人体实验之前，
进行详细的动物试验来验证其安全性和有效性是必须的。目前国内外对人类和几个
种属实验动物的ADMSCs进行了研究，并鉴定了部分表面标志[11-12]。实验从
SD大鼠的腹股沟脂肪垫分离培养ADMSCs，并对这种间充质干细胞的表面标志
CD11b，CD29，CD45，CD49d，CD90和CD106的表达率进行分析，得到了
SD大鼠来源的ADMSCs的部分免疫表型。
1 材料和方法
设计：细胞学体外观察实验。
时间及地点：于2008-12/2009-05在南方医科大学人体解剖学实验室完成。
材料：2月龄SPF级SD大鼠6只，体质量200～220 g，雌雄不拘，由南方医科
大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK粤2006-0015。实验过程中对动物处
置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[13]。
主要试剂及仪器：
主要试剂及仪器 来源H-DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶 Gibco，美国Ⅰ型胶原酶
Sigma，美国小鼠单克隆抗大鼠CD11b, CD29、CD45、CD49d、CD90和
CD106 Biolegend，美国低温离心机 Sigma，美国Heraeus二氧化碳培养箱
Thermo，德国倒置相差显微镜 Olympus，日本FACSCalibur流式细胞仪 BD，
美国
实验方法：
ADMSCs的分离培养： 10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，无菌条件下切
取腹股沟脂肪垫。手术显微镜下清除小血管，PBS液冲洗3次，眼科剪剪碎成约1
mm×1 mm ×1 mm 大小，加入2倍体积的1.5 g/L的Ⅰ型胶原酶，37 ℃下间断
振荡消化40 min后用等量的含体积分数为10%胎牛血清的DMEM中和，1 200
r/ min离心10 min，去除上清，用含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉
素的DMEM重悬细胞，200目筛网过滤，以8 000～10 000 /cm2的密度接种于
25 cm2培养瓶，放置于37 ℃，体积分数为5 %CO2的培养箱中培养。1 d后换
液，以后每3 d换液1次,至长满80%瓶底时用1.5 g/L胰蛋白酶/0.02%EDTA消
化后按照1∶3传代，倒置相差显微镜下观察照相。
流式细胞术检测第4代ADMSCs表面标志：取第4代ADMSCs，按照每管106
个细胞离心，PBS重悬，分别和APC标记的小鼠单克隆抗大鼠CD11b、CD29，
PE标记的小鼠单克隆抗大鼠CD45、CD106，FITC标记的小鼠单克隆抗大鼠
CD49d、CD90孵育20 min，加入含体积分数为5%胎牛血清的PBS离心重悬2
次，后用流式细胞仪检测4种表面标志的表达率。
主要观察指标：ADMSCs的细胞形态以及6种表面标志的表达率。
设计、实施、评估者：设计、实施、评估为全体作者，均经过南方医科大学正规培
训。
2 结果
2.1 ADMSCs的分离培养 原代细胞经过约9 d后长满80%瓶底，胰蛋白酶消化后
传代，每3 d传1代，生长迅速，稳定传代至第10代细胞传代时间未见明显变化。
2.2 ADMSCs的形态 SD大鼠腹股沟脂肪垫来源的各代ADMSCs在倒置显微镜下
观察，经过传代后细胞形态逐渐均一，类似成纤维细胞，多呈长梭型或者纺锤形，
间有不规则型和三角形，见图1。
Figure 1 Morphology of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells at
passage 4图1 第4代ADMSCs形态
2.3 第4代ADMSCs表面标志的表达率 SD大鼠第4代ADMSCs中CD29和
CD90呈高表达，CD11b、CD45、CD49d和CD106表达率较低，见表1和图2。
表1 第4代SD大鼠ADMSCs流式细胞仪检测结果，以各抗原的阳性细胞百分率
表示Table 1 Results of flow cytometric analysis of adipose tissue-derived
mesenchymal stem cells from Sprague Dawley rats at passage 4 described
as percentage of positive fluorescence (±s)Surface marker CD11b CD29
CD45 CD49d CD90 CD106 Percentage of positive cells (%)3.7±3.1 99.5±0.9
1.8±0.8 2.4±4.5 92.1±2.6 2.5±2.2
Figure 2 Immunophenotype of adipose tissue-derived mesenchymal stem
cells (ADMSCs)from Sprague Dawley rats at passage 4图2 SD大鼠第4代
ADMSCs的免疫表型
3 讨论
作为间充质干细胞的一种， ADMSCs为机体提供了重要干细胞储备，具有容易获
取、含量较大、具有免疫抑制作用等优势[14-15]，为细胞移植治疗提供了新的细
胞来源，并进行了相关的移植应用研究，取得了一定效果[16-19]。相关研究对人
类、马、兔、小鼠等物种获取的ADMSCs的部分表面标志进行了鉴定，对这种间
充质干细胞免疫表型有了初步了解。
目前从脂肪组织中获取ADMSCs的方法在不同的文献中略有差异，但是基本方法
都是酶消化的方法，经过离心后将获得的间质血管碎片种植于塑料培养皿中，用含
体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养，将贴壁细胞传代后获得ADMSCs[8]。
实验采用的方法是在这种基本方法的基础经过多次探索后获得的，符合ADMSCs
的分离和培养方法，能稳定地获得SD大鼠的ADMSCs，传至第10代时细胞仍生
长良好迅速，传代时间未见延长，经过传代后细胞形态逐渐均一，呈类似成纤维细
胞的形态特征。
用消化离心的方法获得的间质血管碎片中含有多种细胞，包括内皮细胞、平滑肌细
胞、周细胞、成纤维细胞以及血液循环系统的细胞等[20]。有一种观点认为由于
ADMSCs具有在塑料培养皿表面贴附的特性，所以在经过在塑料培养皿中种植后
ADMSCs能被直接从间质血管碎片中筛选出来，之后的传代细胞能被直接用来进
行实验，并认为这些贴壁细胞就是ADMSCs[21]。另一种更为普遍的观点认为不
仅仅是ADMSCs具有贴壁的特性，包括成纤维细胞在内的其他细胞也具有这种性
质，贴壁细胞经过数次传代后逐渐被纯化，获得的细胞才基本上是ADMSCs[22]。
有研究表明经过数次(三四次)传代后，贴壁细胞中的造血系细胞标志物如CD11、
CD14和CD45的表达率逐渐下降，而间充质细胞标记物如CD29 、CD90和
CD105等逐渐达到稳定的高水平表达，细胞呈现高度的同质性[12, 23]。实验对
SD大鼠的ADMSCs的免疫表型鉴定所采用的细胞是第4代细胞。
目前证实ADMSCs的干细胞性质多采用多向诱导分化和鉴定表面标志相结合的方
法，但没有证明其具有特异性的表面标志物。实验中获取的ADMSCs的表面标志
的特点证实了其间充质干细胞的特性。研究发现，ADMSCs作为间充质干细胞的
一种，CD29和CD90应该呈阳性表达[24]，实验中从SD大鼠获得的ADMSCs
中CD29和CD90具有相似的高表达率。在造血干细胞中高表达的CD11b、
CD45在两种ADMSCs表达率极低，证明其不是造血干细胞来源，与Safford等
[25]报道的检测结果相一致。关于CD49d在ADMSCs中的表达率，国内外文献
报道有很大差异，从阴性表达到强阳性表达均有报道[26-29]。实验中CD49d的
表达率很低，与Wagner等[27]的报道一致，产生这种差异的原因尚不清楚，可
能和选择动物的种系有关。在ADMSCs中不应当表达的内皮细胞标记物CD106，
在本实验中也是极低表达，与Daniel的报道相一致[30]。CD11b、CD45、
CD49d 和CD106在本实验所检测的第4代ADMSCs中的仍然有低表达率，说明
ADMSCs在传到第4代时没有达到完全纯化。
2006年国际细胞治疗协会就间充质干细胞的表面标志达成了共识，认为在人体间
充质干细胞的几种表面标志中，CD90表达率应大于95%，CD11b、CD45的表
达率应低于2%[31]。实验中CD90和CD45的表达率符合这种特征，CD11b的
表达率(3.7±3.1)%虽略高于2%，但也是低水平表达，与造血干细胞中的高表达明
显不同。
影响ADMSCs表面标志的因素有很多。有研究证实人体不同皮下脂肪组织中用不
同的方法获取的ADMSCs有不同[32]，从致密骨获得的ADMSCs和从皮下获得
的ADMSCs的免疫表型也有差异[12]。另外机体不同部位和不同年龄对分离培养
的ADMSCs都有影响。有研究表明，即使同在皮下组织，白色脂肪和褐色脂肪的
ADMSCs也不尽相同[33]，兔性腺来源的ADMSCs和皮下组织来源的ADMSCs
成骨能力也存在不同[34]。对各种物种ADMSCs免疫表型的深入研究对其实际应
用具有重要价值。
4 参考文献
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2024年4月25日发(作者：祭姣妍)
第4代大鼠脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定
李东飞;杨春;李桢;戴景兴;原林
【摘 要】背景:有文献证实以酶消化法可获得在脂肪组织间充质干细胞,传至第10
代时细胞生长仍良好,但表面标志物表达下降. 目的:分离培养大鼠脂肪组织间充质
干细胞,传代至第4代,检测免疫表型. 方法:从6只SD大鼠腹股沟脂肪垫中分离培
养脂肪组织间充质干细胞,以贴壁细胞扩增传代至第4代.相差显微镜下观察脂肪组
织间充质干细胞的形态,并用流式细胞术鉴定脂肪组织间充质干细胞的表面标志物
CD11b,CD29,CD45,CD49d,CD90 和 CD106的表达率.结果与结论:大鼠脂肪组织
间充质干细胞呈现类似成纤维细胞样形态学特征,免疫表型分析显示CD29和
CD90 呈阳性,而CD11b、CD45、CD49d和CD106呈阴性反应.结果提示通过这
种酶消化法获得的SD大鼠的脂肪组织间充质干细胞,免疫表型分析显示符合间充
质干细胞的特征.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2010(014)023
【总页数】4页(P4207-4210)
【关键词】脂肪组织;脂肪间充质干细胞;免疫表型;大鼠;细胞鉴定
【作 者】李东飞;杨春;李桢;戴景兴;原林
【作者单位】南方医科大学人体解剖学教研室,广东省广州市,510515;南方医科大
学人体解剖学教研室,广东省广州市,510515;南方医科大学人体解剖学教研室,广东
省广州市,510515;南方医科大学人体解剖学教研室,广东省广州市,510515;南方医
科大学人体解剖学教研室,广东省广州市,510515
【正文语种】中 文
【中图分类】R394.2
0 引言
目前已经从多种组织中分离出间充质干细胞，包括骨髓、脂肪、脐带血等[1-5]。
近年来对脂肪间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells,
ADMSCs)的研究证实，在特定的诱导条件下ADMSCs能够分化为肌细胞、成骨
细胞、神经细胞等各种细胞[5-7]，在细胞移植治疗中具有重要价值。作为细胞移
植的种子细胞之一，ADMSCs具有取材手术痛苦小、可重复进行、酶消化分离程
序简单等优点，吸引了众多研究者的兴趣[8-10]。在ADMSCs进行人体实验之前，
进行详细的动物试验来验证其安全性和有效性是必须的。目前国内外对人类和几个
种属实验动物的ADMSCs进行了研究，并鉴定了部分表面标志[11-12]。实验从
SD大鼠的腹股沟脂肪垫分离培养ADMSCs，并对这种间充质干细胞的表面标志
CD11b，CD29，CD45，CD49d，CD90和CD106的表达率进行分析，得到了
SD大鼠来源的ADMSCs的部分免疫表型。
1 材料和方法
设计：细胞学体外观察实验。
时间及地点：于2008-12/2009-05在南方医科大学人体解剖学实验室完成。
材料：2月龄SPF级SD大鼠6只，体质量200～220 g，雌雄不拘，由南方医科
大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK粤2006-0015。实验过程中对动物处
置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[13]。
主要试剂及仪器：
主要试剂及仪器 来源H-DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶 Gibco，美国Ⅰ型胶原酶
Sigma，美国小鼠单克隆抗大鼠CD11b, CD29、CD45、CD49d、CD90和
CD106 Biolegend，美国低温离心机 Sigma，美国Heraeus二氧化碳培养箱
Thermo，德国倒置相差显微镜 Olympus，日本FACSCalibur流式细胞仪 BD，
美国
实验方法：
ADMSCs的分离培养： 10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，无菌条件下切
取腹股沟脂肪垫。手术显微镜下清除小血管，PBS液冲洗3次，眼科剪剪碎成约1
mm×1 mm ×1 mm 大小，加入2倍体积的1.5 g/L的Ⅰ型胶原酶，37 ℃下间断
振荡消化40 min后用等量的含体积分数为10%胎牛血清的DMEM中和，1 200
r/ min离心10 min，去除上清，用含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉
素的DMEM重悬细胞，200目筛网过滤，以8 000～10 000 /cm2的密度接种于
25 cm2培养瓶，放置于37 ℃，体积分数为5 %CO2的培养箱中培养。1 d后换
液，以后每3 d换液1次,至长满80%瓶底时用1.5 g/L胰蛋白酶/0.02%EDTA消
化后按照1∶3传代，倒置相差显微镜下观察照相。
流式细胞术检测第4代ADMSCs表面标志：取第4代ADMSCs，按照每管106
个细胞离心，PBS重悬，分别和APC标记的小鼠单克隆抗大鼠CD11b、CD29，
PE标记的小鼠单克隆抗大鼠CD45、CD106，FITC标记的小鼠单克隆抗大鼠
CD49d、CD90孵育20 min，加入含体积分数为5%胎牛血清的PBS离心重悬2
次，后用流式细胞仪检测4种表面标志的表达率。
主要观察指标：ADMSCs的细胞形态以及6种表面标志的表达率。
设计、实施、评估者：设计、实施、评估为全体作者，均经过南方医科大学正规培
训。
2 结果
2.1 ADMSCs的分离培养 原代细胞经过约9 d后长满80%瓶底，胰蛋白酶消化后
传代，每3 d传1代，生长迅速，稳定传代至第10代细胞传代时间未见明显变化。
2.2 ADMSCs的形态 SD大鼠腹股沟脂肪垫来源的各代ADMSCs在倒置显微镜下
观察，经过传代后细胞形态逐渐均一，类似成纤维细胞，多呈长梭型或者纺锤形，
间有不规则型和三角形，见图1。
Figure 1 Morphology of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells at
passage 4图1 第4代ADMSCs形态
2.3 第4代ADMSCs表面标志的表达率 SD大鼠第4代ADMSCs中CD29和
CD90呈高表达，CD11b、CD45、CD49d和CD106表达率较低，见表1和图2。
表1 第4代SD大鼠ADMSCs流式细胞仪检测结果，以各抗原的阳性细胞百分率
表示Table 1 Results of flow cytometric analysis of adipose tissue-derived
mesenchymal stem cells from Sprague Dawley rats at passage 4 described
as percentage of positive fluorescence (±s)Surface marker CD11b CD29
CD45 CD49d CD90 CD106 Percentage of positive cells (%)3.7±3.1 99.5±0.9
1.8±0.8 2.4±4.5 92.1±2.6 2.5±2.2
Figure 2 Immunophenotype of adipose tissue-derived mesenchymal stem
cells (ADMSCs)from Sprague Dawley rats at passage 4图2 SD大鼠第4代
ADMSCs的免疫表型
3 讨论
作为间充质干细胞的一种， ADMSCs为机体提供了重要干细胞储备，具有容易获
取、含量较大、具有免疫抑制作用等优势[14-15]，为细胞移植治疗提供了新的细
胞来源，并进行了相关的移植应用研究，取得了一定效果[16-19]。相关研究对人
类、马、兔、小鼠等物种获取的ADMSCs的部分表面标志进行了鉴定，对这种间
充质干细胞免疫表型有了初步了解。
目前从脂肪组织中获取ADMSCs的方法在不同的文献中略有差异，但是基本方法
都是酶消化的方法，经过离心后将获得的间质血管碎片种植于塑料培养皿中，用含
体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养，将贴壁细胞传代后获得ADMSCs[8]。
实验采用的方法是在这种基本方法的基础经过多次探索后获得的，符合ADMSCs
的分离和培养方法，能稳定地获得SD大鼠的ADMSCs，传至第10代时细胞仍生
长良好迅速，传代时间未见延长，经过传代后细胞形态逐渐均一，呈类似成纤维细
胞的形态特征。
用消化离心的方法获得的间质血管碎片中含有多种细胞，包括内皮细胞、平滑肌细
胞、周细胞、成纤维细胞以及血液循环系统的细胞等[20]。有一种观点认为由于
ADMSCs具有在塑料培养皿表面贴附的特性，所以在经过在塑料培养皿中种植后
ADMSCs能被直接从间质血管碎片中筛选出来，之后的传代细胞能被直接用来进
行实验，并认为这些贴壁细胞就是ADMSCs[21]。另一种更为普遍的观点认为不
仅仅是ADMSCs具有贴壁的特性，包括成纤维细胞在内的其他细胞也具有这种性
质，贴壁细胞经过数次传代后逐渐被纯化，获得的细胞才基本上是ADMSCs[22]。
有研究表明经过数次(三四次)传代后，贴壁细胞中的造血系细胞标志物如CD11、
CD14和CD45的表达率逐渐下降，而间充质细胞标记物如CD29 、CD90和
CD105等逐渐达到稳定的高水平表达，细胞呈现高度的同质性[12, 23]。实验对
SD大鼠的ADMSCs的免疫表型鉴定所采用的细胞是第4代细胞。
目前证实ADMSCs的干细胞性质多采用多向诱导分化和鉴定表面标志相结合的方
法，但没有证明其具有特异性的表面标志物。实验中获取的ADMSCs的表面标志
的特点证实了其间充质干细胞的特性。研究发现，ADMSCs作为间充质干细胞的
一种，CD29和CD90应该呈阳性表达[24]，实验中从SD大鼠获得的ADMSCs
中CD29和CD90具有相似的高表达率。在造血干细胞中高表达的CD11b、
CD45在两种ADMSCs表达率极低，证明其不是造血干细胞来源，与Safford等
[25]报道的检测结果相一致。关于CD49d在ADMSCs中的表达率，国内外文献
报道有很大差异，从阴性表达到强阳性表达均有报道[26-29]。实验中CD49d的
表达率很低，与Wagner等[27]的报道一致，产生这种差异的原因尚不清楚，可
能和选择动物的种系有关。在ADMSCs中不应当表达的内皮细胞标记物CD106，
在本实验中也是极低表达，与Daniel的报道相一致[30]。CD11b、CD45、
CD49d 和CD106在本实验所检测的第4代ADMSCs中的仍然有低表达率，说明
ADMSCs在传到第4代时没有达到完全纯化。
2006年国际细胞治疗协会就间充质干细胞的表面标志达成了共识，认为在人体间
充质干细胞的几种表面标志中，CD90表达率应大于95%，CD11b、CD45的表
达率应低于2%[31]。实验中CD90和CD45的表达率符合这种特征，CD11b的
表达率(3.7±3.1)%虽略高于2%，但也是低水平表达，与造血干细胞中的高表达明
显不同。
影响ADMSCs表面标志的因素有很多。有研究证实人体不同皮下脂肪组织中用不
同的方法获取的ADMSCs有不同[32]，从致密骨获得的ADMSCs和从皮下获得
的ADMSCs的免疫表型也有差异[12]。另外机体不同部位和不同年龄对分离培养
的ADMSCs都有影响。有研究表明，即使同在皮下组织，白色脂肪和褐色脂肪的
ADMSCs也不尽相同[33]，兔性腺来源的ADMSCs和皮下组织来源的ADMSCs
成骨能力也存在不同[34]。对各种物种ADMSCs免疫表型的深入研究对其实际应
用具有重要价值。
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