2024年5月6日发(作者：牵昂)
鱼腥藻PCC 7120中几个固氮相关基因的功能验证
鱼腥藻PCC 7120(Anabaena 7120)在细菌发育学和多细胞结构的研究中,是
一种典型的模式生物。在缺乏化合氮源的环境中,丝状体中的营养细胞能分化成为具有特殊
结构的异形胞。
主要研究内容如下:在实验室研究基础上,选择可能与固氮有关的靶基因,利用p ZR606
敲除某一个靶基因,观察敲除菌株在不含有化合氮源上的培养条件下的表型变化,确定可能
与鱼腥藻PCC 7120细胞固氮相关的基因;选用含有Pgln A强启动子的pZR670质粒作为
互补表达质粒,构建含有靶基因启动子序列的互补型表达质粒,观察互补菌株是否在恢复一
定的表达后能使细胞在缺少化合氮源的培养基上恢复生长,从而确定与固氮相关的基因;通
过分析鱼腥藻PCC 7120的转录组数据,选择在缺氮和有氮条件下不同表达量的sRNA,利用
pZR670构建干涉质粒,通过三亲接合转移方法获得干涉菌株,观察干涉在培养过程中所引
起的细胞形状的变化,确定能引起鱼腥藻PCC 7120细胞型状改变的sRNA序列。主要研究
结果如下:取生长状态良好的鱼腥藻PCC 7120细胞,接种于AA/8和AA/8N液体中培养,
通过测量鱼腥藻PCC 7120细胞在700 nm处的吸光度值,观察细胞的生长状态,通过生长曲
线分析,氮源是细胞生长的一种限制性因素,也是异形胞形成的关键元素。
成功利用单交换基因重组技术,以p ZR606质粒为基本骨架,构建了all2022、all2676、
alr0834基因的敲除质粒pHEP52、pHEP34和pHEP55,敲除了all2022、all2676、alr0834
基因,获得了基因敲除菌株Δall2022、Δall2676、Δalr0834,在不含有化合氮源的AA培养
基上培养,观察其生长变化状态,发现此三种敲除菌株在不含化合氮源的培养基培养条件下,
鱼腥藻PCC 7120在培养一段时间后均会变黄死亡。成功利用表达质粒pZR670构建了
all2022、all2676、alr0834基因的互补质粒pHEP90、pHEP91、pHEP92,通过三亲结合
转移获得其互补菌株▲all2022、▲all2676、▲alr0834,将获得的互补菌株在不含有化合氮
源的AA培养基中培养,▲all2676和▲alr0834在培养一段时间后能恢复生长,而▲all2022
不能恢复正常生长。
由此可以初步确定all2676和alr0834是与鱼腥藻PCC 7120细胞的固氮过程有关的
基因,而all2022可能是因为是某个操纵子的中间位置的基因而出现导致细胞死亡的极效应
现象基因。成功利用pZR670质粒构建了多个具有能转录含有sRNA互补序列的干涉质粒,
并利用三亲结合转移技术成功获得了含有干涉质粒的菌株,将干涉菌株在AA/16N和
AA/16固体培养基上和AA/8N液体培养基内培养,对比其生长变化情况,发现含有能转录包
含sRNA0425反向序列的质粒的干涉菌株在AA/8N液体培养中,细胞极易贴壁生长,含有
能转录包含sRNA1064反向序列的质粒的干涉菌株培养一段时间后细胞不能形成长的丝
状体,每一个丝状体含有的细胞数目绝大部分不超过30个。
2024年5月6日发(作者：牵昂)
鱼腥藻PCC 7120中几个固氮相关基因的功能验证
鱼腥藻PCC 7120(Anabaena 7120)在细菌发育学和多细胞结构的研究中,是
一种典型的模式生物。在缺乏化合氮源的环境中,丝状体中的营养细胞能分化成为具有特殊
结构的异形胞。
主要研究内容如下:在实验室研究基础上,选择可能与固氮有关的靶基因,利用p ZR606
敲除某一个靶基因,观察敲除菌株在不含有化合氮源上的培养条件下的表型变化,确定可能
与鱼腥藻PCC 7120细胞固氮相关的基因;选用含有Pgln A强启动子的pZR670质粒作为
互补表达质粒,构建含有靶基因启动子序列的互补型表达质粒,观察互补菌株是否在恢复一
定的表达后能使细胞在缺少化合氮源的培养基上恢复生长,从而确定与固氮相关的基因;通
过分析鱼腥藻PCC 7120的转录组数据,选择在缺氮和有氮条件下不同表达量的sRNA,利用
pZR670构建干涉质粒,通过三亲接合转移方法获得干涉菌株,观察干涉在培养过程中所引
起的细胞形状的变化,确定能引起鱼腥藻PCC 7120细胞型状改变的sRNA序列。主要研究
结果如下:取生长状态良好的鱼腥藻PCC 7120细胞,接种于AA/8和AA/8N液体中培养,
通过测量鱼腥藻PCC 7120细胞在700 nm处的吸光度值,观察细胞的生长状态,通过生长曲
线分析,氮源是细胞生长的一种限制性因素,也是异形胞形成的关键元素。
成功利用单交换基因重组技术,以p ZR606质粒为基本骨架,构建了all2022、all2676、
alr0834基因的敲除质粒pHEP52、pHEP34和pHEP55,敲除了all2022、all2676、alr0834
基因,获得了基因敲除菌株Δall2022、Δall2676、Δalr0834,在不含有化合氮源的AA培养
基上培养,观察其生长变化状态,发现此三种敲除菌株在不含化合氮源的培养基培养条件下,
鱼腥藻PCC 7120在培养一段时间后均会变黄死亡。成功利用表达质粒pZR670构建了
all2022、all2676、alr0834基因的互补质粒pHEP90、pHEP91、pHEP92,通过三亲结合
转移获得其互补菌株▲all2022、▲all2676、▲alr0834,将获得的互补菌株在不含有化合氮
源的AA培养基中培养,▲all2676和▲alr0834在培养一段时间后能恢复生长,而▲all2022
不能恢复正常生长。
由此可以初步确定all2676和alr0834是与鱼腥藻PCC 7120细胞的固氮过程有关的
基因,而all2022可能是因为是某个操纵子的中间位置的基因而出现导致细胞死亡的极效应
现象基因。成功利用pZR670质粒构建了多个具有能转录含有sRNA互补序列的干涉质粒,
并利用三亲结合转移技术成功获得了含有干涉质粒的菌株,将干涉菌株在AA/16N和
AA/16固体培养基上和AA/8N液体培养基内培养,对比其生长变化情况,发现含有能转录包
含sRNA0425反向序列的质粒的干涉菌株在AA/8N液体培养中,细胞极易贴壁生长,含有
能转录包含sRNA1064反向序列的质粒的干涉菌株培养一段时间后细胞不能形成长的丝
状体,每一个丝状体含有的细胞数目绝大部分不超过30个。