2024年5月8日发(作者：濯浩岚)
抗氧化活性实验方法（体外实验）
1、清除DPPH自由基能力的测定
称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。分别取2mL
不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置
30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对
照。样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：
DPPH
清除率1
A
1
A
2
100%
A
0
A
0
—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；
A
1
—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；
A
2
—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。
2、总还原能力的测定
在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，
4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。
取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。取上清液2.5mL，
加入2.5mL蒸馏水和0.5mL FeCl
3
，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。Vc
作为阳性对照。
3、对Fe2+离子螯合能力的测定
分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L
的FeCl
2
溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处
测吸光值。EDTA为阳性对照。样品对Fe
2+
的螯合率计算公式如下：
Fe
2+
螯合率1
A
1
A
2
100%
A
0
A
0
—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；
A
1
—样品溶液反应后的吸光值；
A
2
—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl
2
溶液后的吸光值。
4、超氧自由基（O2-）清除率的测定
采用邻苯三酚自氧化法测定。取50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃
水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后
于25℃水浴中反应5min，加入1mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度
（A
x
），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。按下式计算O
2
-
清除率：
A
0
A
x
100%
A
0
O
2
-
清除率
A
0
—空白对照液吸光度；A
x
—样品溶液吸光度。
5、羟自由基（•OH）清除率的测定
利用H
2
O
2
与Fe
2+
混合产生•OH，在体系中加入水杨酸捕捉•OH并产生有色物质，该
物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含8.8mmol/L H
2
O
2
1mL、9mmol/L FeSO
4
1mL、9mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的样品溶液1mL。最后加H
2
O
2
启动反
应，37℃反应30min，以蒸馏水为参比，在510nm下测定各浓度的吸光度。考虑到样品
本身的吸光值，以9mmol/L FeSO
4
1mL、9mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的
样品溶液1mL和1mL蒸馏水作为样品的本底吸收值。按下式计算•OH清除率：
A
x
A
x0
清除率
1
100%
A
0
•OH
A
0
—空白对照液的吸光度；
A
x
—加入样品溶液后的吸光度；
A
x0
—不加显色剂H
2
O
2
样品溶液本底的吸光度。
2024年5月8日发(作者：濯浩岚)
抗氧化活性实验方法（体外实验）
1、清除DPPH自由基能力的测定
称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。分别取2mL
不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置
30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对
照。样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：
DPPH
清除率1
A
1
A
2
100%
A
0
A
0
—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；
A
1
—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；
A
2
—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。
2、总还原能力的测定
在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，
4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。
取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。取上清液2.5mL，
加入2.5mL蒸馏水和0.5mL FeCl
3
，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。Vc
作为阳性对照。
3、对Fe2+离子螯合能力的测定
分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L
的FeCl
2
溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处
测吸光值。EDTA为阳性对照。样品对Fe
2+
的螯合率计算公式如下：
Fe
2+
螯合率1
A
1
A
2
100%
A
0
A
0
—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；
A
1
—样品溶液反应后的吸光值；
A
2
—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl
2
溶液后的吸光值。
4、超氧自由基（O2-）清除率的测定
采用邻苯三酚自氧化法测定。取50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃
水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后
于25℃水浴中反应5min，加入1mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度
（A
x
），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。按下式计算O
2
-
清除率：
A
0
A
x
100%
A
0
O
2
-
清除率
A
0
—空白对照液吸光度；A
x
—样品溶液吸光度。
5、羟自由基（•OH）清除率的测定
利用H
2
O
2
与Fe
2+
混合产生•OH，在体系中加入水杨酸捕捉•OH并产生有色物质，该
物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含8.8mmol/L H
2
O
2
1mL、9mmol/L FeSO
4
1mL、9mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的样品溶液1mL。最后加H
2
O
2
启动反
应，37℃反应30min，以蒸馏水为参比，在510nm下测定各浓度的吸光度。考虑到样品
本身的吸光值，以9mmol/L FeSO
4
1mL、9mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的
样品溶液1mL和1mL蒸馏水作为样品的本底吸收值。按下式计算•OH清除率：
A
x
A
x0
清除率
1
100%
A
0
•OH
A
0
—空白对照液的吸光度；
A
x
—加入样品溶液后的吸光度；
A
x0
—不加显色剂H
2
O
2
样品溶液本底的吸光度。