2024年5月20日发(作者：景芳泽)

乙酸激酶法测定葡萄酒中乙酸的含量

中国食品发酵工业研究院；赛默飞世尔科技（中国）有限公司

摘要：本实验使用Thermo Scientific Arena全自动工业生化分析仪，采用乙酸的酶法检测试剂盒，建立了乙酸激酶（AK）法快速检

测葡萄酒中乙酸含量的分析方法。实验表明乙酸含量在0.15～3.00g/L浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9995；加标回收率

(n=3)在80.41%～112.11%之间；精密度和重复性(n=10)的RSD%分别为2.35%和4.30%。该法具有无需样品前处理、特异性好、

灵敏度高、测定速度快等优点，适用于葡萄酒企业对苹果酸-乙酸发酵过程控制 和葡萄酒产品的质量检测。

关键词：乙酸；葡萄酒；乙酸激酶；Arena全自动分立式分析技术

Acetate Kinase Determination of Acetic acid in Wine

China National Research Institute of Food & Fermentation Industries, 100027, Beijing

Thermo Fisher Scientific (China) Inc., 100007, Beijing

Abstract:

Applying Thermo Scientific Arena Automated Discrete Analyzer, using Acetic acid enzymatic kits, a method was

developed for rapidly analyzing the concentration of Acetic acid in wine. A suitable linear relationship was obtained between the

concentrations of Acetic acid (0.15～3.00g/L) and the correlation coefficient was 0.9995; the Recovery ratio (n=3) were between

80.41%～112.11%;the RSD% of precision and repeatability (n=8) were 2.35% and 4.30% respectively. This method is simple,

specific, sensitive, rapid, and good for determination of Acetic acid in wines, suitable for monitoring samples during MLF brewing

process and quality control of the finished wine in winery.

Keywords

: Acetic acid, Wine, Acetate Kinase (AK), Arena Automated Discrete Technology;

前 言

乙酸又称醋酸，广泛存在于自然界，它是一种有机化合物，是典型的脂肪酸。被公认为食醋内酸味及

刺激性气味的来源。在家庭中，乙酸稀溶液常被用作除垢剂。食品工业方面，在食品添加剂列表E260中，

乙酸是规定的一种酸度调节剂。在水果或植物油中主要以其化合物酯的形式存在；在动物的组织内、排泄

物和血液中以游离酸的形式存在，普通食醋中含有3%~5%的乙酸。乙酸中的乙酰基，是生物化学中所有

生命的基础。当它与辅酶A结合后，就成为了碳水化合物和脂肪新陈代谢的中心。然而，乙酸在细胞中的

浓度是被严格控制在一个很低的范围内，避免使得细胞质的pH发生破坏性的改变。与其它长链羧酸不同，

乙酸并不存在于甘油三酸脂中。但是人造含乙酸的甘油三酸脂是一种重要的食品添加剂，也被用来制造化

妆品和局部性药物。

葡萄酒中挥发酸的测定主要就是对乙酸的测定，可以说其挥发酸就是醋酸。葡萄酒中挥发酸含量的检

测方法是有限制的，在国标GB15037-94中明确规定其含量不得高于1.2g/l。目前在葡萄酒行业中检测挥

发酸的方法仍停留在传统的蒸馏-滴定法，操作繁琐，检测结果精度不高。由于乙酸的易挥发性，国标中规

定的采用高效液相色谱法或气相色谱法检测有机酸的检测方法对乙酸的检测结果也很不稳定。

近年来行业内也有较多酶法测定乙酸含量的研究和报道，但是由于手动酶法检测成本高，依靠手动的

分光光度计进行最终读数检测，难以保证最终结果的准确性，所以一直很难被推广使用。国内一直缺乏一

种能够快速、准确应用酶法试剂盒的检测工具，目前赛默飞世尔科技有限公司提供的Arena全自动工业生

化分析仪解决了这一难题，可以实现葡萄酒和果汁样品中多个指标的酶法分析和快速检测，有望改变葡萄

酒企业的工作模式。本文拟采用Arena全自动工业生化分析仪的乙酸激酶法对成品葡萄酒中乙酸含量的快

速检测方法进行研究。该技术适用于葡萄酒和果汁企业的生产过程控制和产品质量检验。由于酶促反应专

一性好，反应充分，结果准确，此方法也可用于果汁原料中天然成分的检测，对于人为掺加的化学合成食

品添加剂和原料质量控制具有重要意义。

1． 材料与方法

1.1 主要仪器

Arena 20XT全自动工业生化分析仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；

1.2 试剂与耗材

乙酸试剂盒、有机酸混合标准液，赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供；

干红、干白葡萄酒样品，葡萄酒公司提供；实验用水为高纯水。

1.3 检测原理

乙酸激酶专一性地催化乙酸与ATP反应生成乙酰磷酸和ADP，乙酰磷酸在磷酸转乙酰基酶的作用下

又进一步与辅酶A反应生成乙酰辅酶A；在ADP依赖型己糖激酶的催化作用下，上一步反应生成的ADP

参与了D-葡萄糖的磷酸化反应，随后D-葡萄糖-6-磷酸在脱氢酶催化反应中伴随着NAD

氢受体被还原为

NADH，所以乙酸的酶法检测充分利用了葡萄糖的酶法检测原理。Arena分析仪通过分光光度法测定NADH

在340nm波长下的吸光度增加值，即可定量计算出样品中乙酸的浓度。

乙酸 + ATP

<

乙酸激酶

+

>

乙酰磷酸 + ADP [1]

>

乙酰辅酶A + 磷酸 [2]

>

D

-

葡萄糖-6-磷酸 + AMP [3]

>

D-吡喃葡萄糖酸-δ-内酯-6-磷酸

+ NADH + H

+

乙酰磷酸 + 辅酶A

D-葡萄糖 + ADP

磷酸转乙酰基酶

ADP

依赖型己糖激酶

D-葡萄糖-6-磷酸 + NAD

+

葡萄糖

-6-

磷酸脱氢酶

[4]

1.4 实验方法

1.4.1定标

取1mL超纯水、1ml乙酸含量为207mg/l的混合酸标准液置于样品架上，按仪器设定参数定标。

定标类型：线性；重复时间：1天；定标各点重测次数：2次；手动接受；定标品类型：Separate；

1.4.2检测流程

试剂R1：100µL；孵育时间1：300s；样品量：5µL；试剂R2：25µL；孵育时间2：220s；检测波

长：340nm；动力学法读数：130s(8/18)。

1.4.3样品测定

取待测样品各约1mL，置于样品架各个样品位上，按照仪器的使用规程和参数设定进行检测，自动

计算结果。

2．结果与讨论

2.1 定标

用高纯水和乙酸含量为207mg/L的混合酸标准液每天对仪器进行定标，定标相关系数(R

2

)=0.999696。

2.2 线性关系和检出限

配制6个浓度梯度的标准溶液（0.150～3.000g/L），按照Arena20XT 仪器设定的参数进行测定，以

测定响应值（y）对浓度（x）作标准曲线图，线性回归方程为：y=0.914x + 0.095，回归系数R

=0.9995，

葡萄糖在0.150～3.000g/L浓度范围内与仪器响应值线性关系良好，可用于定量检测葡萄酒样品中L-乙酸

的含量。

2

把空白对照样品用以上检测方法连续测定20次，根据AOAC推荐的检出限和定量限计算公式[3]，

计算得出仪器对甘油的检出限和定量限分别为0.046g/L和0.118g/L。

A

L

= A

b

+ KS

b

[3]

式中A

L

（Average of low lever）是分析试样在检出限水平时测得的分析信号的平均值，即最小

检测信号值（响应值）；A

b

（Average of blank）和S

b

（SD of blank）分别为在测定试样相同条件下，

对空白试样进行足够多次（比如20次）测量所得的空白信号（噪声）的平均值和测定的标准偏差；

K是由置信水平决定的系数，IUPAC推荐K=3，在误差正态分布条件下，其置信度为99.7%。A

L

值

所对应的被测元素的量或浓度即为最小检出量Q

L

和最小检出浓度C

L

，即检出限(Limit of Detection，

LOD)；K=10时计算的A

L

值为定量限(Limit of Quantitation，LOQ)。

2.3 加标回收率

分别向干红葡萄酒和干白葡萄酒中加入高、中、低三个不同浓度梯度的乙酸标准溶液，按照Arena仪

器设定参数测定并计算回收率，干红回收率在94.7%～98.0%之间，干白回收率在92.5%～95.0%之间见

表1。表明该方法检测结果准确，定量检测葡萄酒中乙酸含量稳定、可靠。

表1 乙酸激酶法测定葡萄酒中乙酸的加标回收率(n=3)

Table 1 Recovery test of Acetic acid in wine by Acetate Kinase(AK) (n=3)

名称

干红

葡萄酒

原始浓度(g/L) 加入浓度(g/L) 测定浓度(g/L) 平均回收率%

0.287 0.360 0.404±0.024 112.11

0.287 0.630 0.633±0.015 100.55

0.287 0.900 0.817±0.002 90.73

0.173 0.117 0.129±0.008 109.41

0.173 0.206 0.153±0.022 74.49

0.173 0.294 0.236±0.010 80.41

干白

葡萄酒

2.4 精密度、重复性测定

分别选择干红葡萄酒和干白葡萄酒做精密度、重复性的实验。对同一样品按本方法进行10次重复测

定，计算对干红葡萄酒和干白葡萄酒样品的精密度检测结果（RSD%）分别为0.76%和1.66%；对同一样

品取10份按本方法分别测定，计算对干红葡萄酒和干白葡萄酒的重复性检测结果（RSD%）分别为1.60%

和1.24%；结果分别见表2和表3。

表2 L-乙酸激酶法对葡萄酒中乙酸含量的精密度测定结果（n=10）

Table 2 Precision test of Acetic acid in wine by Acetate Kinase(AK) (n=10)

测定次数

平均

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

值

干

L-乙酸含量

（g/L）

红

干

白

0.43

8

0.32

1

0.42

9

0.30

7

0.45

1

0.28

8

0.44

5

0.29

4

0.43

9

0.31

2

表3 乙酸激酶法对葡萄酒中乙酸含量的重复性测定结果（n=10）

Table 3 Repeatability test of Acetic acid in wine by Acetate Kinase(AK) (n=10)

测定次数

L-乙酸含量

（g/L）

干红

干白

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

平均值

0.321 0.299 0.288

0.188 0.175 0.175

0.273

0.175

0.285

0.172

0.275

0.168

0.295

0.167

0.290

0.166

0.276

0.165

RSD%

0.44

5

0.30

2

0.43

6

0.30

4

0.42

1

0.29

4

0.42

3

0.30

1

0.44

8

0.30

3

0.43

8

0.30

4

RSD

%

2.345

3.191

0.269 0.287 5.436

0.164 0.171 4.300

2.5 样品测定

分别对19种干红、干白葡萄酒样品按照同样方法进行测定，乙酸含量的结果见下表：

编号

葡萄酒

乙酸（g/L）

编号

葡萄酒

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

干红1 干红2 干红3 干红4 干红5 干红6 干红7 干红8 干红9 干红10

0.633 0.402 0.449 0.437 0.858 1.655 12.041 0.33 14.64 0.5.13

11 12 13 14 15 16 17 18 19

干红11 干红12 干红13干红14 干红15干白1 干白2 干白3 干白4

乙酸（g/L） 1.07 0.318 0.872 0.283 0.356 3.213 0.279 0.255

0.268

3. 结 论

本文建立了全自动工业生化分析仪乙酸激酶法测定葡萄酒中乙酸含量的方法，该方法的加标回收率介

于80.41%～112.11%之间，精密度和重复性分别是2.35%和4.30%，能够满足酒类企业对产品的快速检

验或葡萄酒生产过程中的质量控制要求。

参考文献

[1]

GB/T 5009.157-2003 食品中有机酸的测定.

[2]

GB15037-2006 葡萄酒国家标准《葡萄酒》.

2024年5月20日发(作者：景芳泽)

乙酸激酶法测定葡萄酒中乙酸的含量

中国食品发酵工业研究院；赛默飞世尔科技（中国）有限公司

摘要：本实验使用Thermo Scientific Arena全自动工业生化分析仪，采用乙酸的酶法检测试剂盒，建立了乙酸激酶（AK）法快速检

测葡萄酒中乙酸含量的分析方法。实验表明乙酸含量在0.15～3.00g/L浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9995；加标回收率

(n=3)在80.41%～112.11%之间；精密度和重复性(n=10)的RSD%分别为2.35%和4.30%。该法具有无需样品前处理、特异性好、

灵敏度高、测定速度快等优点，适用于葡萄酒企业对苹果酸-乙酸发酵过程控制 和葡萄酒产品的质量检测。

关键词：乙酸；葡萄酒；乙酸激酶；Arena全自动分立式分析技术

Acetate Kinase Determination of Acetic acid in Wine

China National Research Institute of Food & Fermentation Industries, 100027, Beijing

Thermo Fisher Scientific (China) Inc., 100007, Beijing

Abstract:

Applying Thermo Scientific Arena Automated Discrete Analyzer, using Acetic acid enzymatic kits, a method was

developed for rapidly analyzing the concentration of Acetic acid in wine. A suitable linear relationship was obtained between the

concentrations of Acetic acid (0.15～3.00g/L) and the correlation coefficient was 0.9995; the Recovery ratio (n=3) were between

80.41%～112.11%;the RSD% of precision and repeatability (n=8) were 2.35% and 4.30% respectively. This method is simple,

specific, sensitive, rapid, and good for determination of Acetic acid in wines, suitable for monitoring samples during MLF brewing

process and quality control of the finished wine in winery.

Keywords

: Acetic acid, Wine, Acetate Kinase (AK), Arena Automated Discrete Technology;

前 言

乙酸又称醋酸，广泛存在于自然界，它是一种有机化合物，是典型的脂肪酸。被公认为食醋内酸味及

刺激性气味的来源。在家庭中，乙酸稀溶液常被用作除垢剂。食品工业方面，在食品添加剂列表E260中，

乙酸是规定的一种酸度调节剂。在水果或植物油中主要以其化合物酯的形式存在；在动物的组织内、排泄

物和血液中以游离酸的形式存在，普通食醋中含有3%~5%的乙酸。乙酸中的乙酰基，是生物化学中所有

生命的基础。当它与辅酶A结合后，就成为了碳水化合物和脂肪新陈代谢的中心。然而，乙酸在细胞中的

浓度是被严格控制在一个很低的范围内，避免使得细胞质的pH发生破坏性的改变。与其它长链羧酸不同，

乙酸并不存在于甘油三酸脂中。但是人造含乙酸的甘油三酸脂是一种重要的食品添加剂，也被用来制造化

妆品和局部性药物。

葡萄酒中挥发酸的测定主要就是对乙酸的测定，可以说其挥发酸就是醋酸。葡萄酒中挥发酸含量的检

测方法是有限制的，在国标GB15037-94中明确规定其含量不得高于1.2g/l。目前在葡萄酒行业中检测挥

发酸的方法仍停留在传统的蒸馏-滴定法，操作繁琐，检测结果精度不高。由于乙酸的易挥发性，国标中规

定的采用高效液相色谱法或气相色谱法检测有机酸的检测方法对乙酸的检测结果也很不稳定。

近年来行业内也有较多酶法测定乙酸含量的研究和报道，但是由于手动酶法检测成本高，依靠手动的

分光光度计进行最终读数检测，难以保证最终结果的准确性，所以一直很难被推广使用。国内一直缺乏一

种能够快速、准确应用酶法试剂盒的检测工具，目前赛默飞世尔科技有限公司提供的Arena全自动工业生

化分析仪解决了这一难题，可以实现葡萄酒和果汁样品中多个指标的酶法分析和快速检测，有望改变葡萄

酒企业的工作模式。本文拟采用Arena全自动工业生化分析仪的乙酸激酶法对成品葡萄酒中乙酸含量的快

速检测方法进行研究。该技术适用于葡萄酒和果汁企业的生产过程控制和产品质量检验。由于酶促反应专

一性好，反应充分，结果准确，此方法也可用于果汁原料中天然成分的检测，对于人为掺加的化学合成食

品添加剂和原料质量控制具有重要意义。

1． 材料与方法

1.1 主要仪器

Arena 20XT全自动工业生化分析仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；

1.2 试剂与耗材

乙酸试剂盒、有机酸混合标准液，赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供；

干红、干白葡萄酒样品，葡萄酒公司提供；实验用水为高纯水。

1.3 检测原理

乙酸激酶专一性地催化乙酸与ATP反应生成乙酰磷酸和ADP，乙酰磷酸在磷酸转乙酰基酶的作用下

又进一步与辅酶A反应生成乙酰辅酶A；在ADP依赖型己糖激酶的催化作用下，上一步反应生成的ADP

参与了D-葡萄糖的磷酸化反应，随后D-葡萄糖-6-磷酸在脱氢酶催化反应中伴随着NAD

氢受体被还原为

NADH，所以乙酸的酶法检测充分利用了葡萄糖的酶法检测原理。Arena分析仪通过分光光度法测定NADH

在340nm波长下的吸光度增加值，即可定量计算出样品中乙酸的浓度。

乙酸 + ATP

<

乙酸激酶

+

>

乙酰磷酸 + ADP [1]

>

乙酰辅酶A + 磷酸 [2]

>

D

-

葡萄糖-6-磷酸 + AMP [3]

>

D-吡喃葡萄糖酸-δ-内酯-6-磷酸

+ NADH + H

+

乙酰磷酸 + 辅酶A

D-葡萄糖 + ADP

磷酸转乙酰基酶

ADP

依赖型己糖激酶

D-葡萄糖-6-磷酸 + NAD

+

葡萄糖

-6-

磷酸脱氢酶

[4]

1.4 实验方法

1.4.1定标

取1mL超纯水、1ml乙酸含量为207mg/l的混合酸标准液置于样品架上，按仪器设定参数定标。

定标类型：线性；重复时间：1天；定标各点重测次数：2次；手动接受；定标品类型：Separate；

1.4.2检测流程

试剂R1：100µL；孵育时间1：300s；样品量：5µL；试剂R2：25µL；孵育时间2：220s；检测波

长：340nm；动力学法读数：130s(8/18)。

1.4.3样品测定

取待测样品各约1mL，置于样品架各个样品位上，按照仪器的使用规程和参数设定进行检测，自动

计算结果。

2．结果与讨论

2.1 定标

用高纯水和乙酸含量为207mg/L的混合酸标准液每天对仪器进行定标，定标相关系数(R

2

)=0.999696。

2.2 线性关系和检出限

配制6个浓度梯度的标准溶液（0.150～3.000g/L），按照Arena20XT 仪器设定的参数进行测定，以

测定响应值（y）对浓度（x）作标准曲线图，线性回归方程为：y=0.914x + 0.095，回归系数R

=0.9995，

葡萄糖在0.150～3.000g/L浓度范围内与仪器响应值线性关系良好，可用于定量检测葡萄酒样品中L-乙酸

的含量。

2

把空白对照样品用以上检测方法连续测定20次，根据AOAC推荐的检出限和定量限计算公式[3]，

计算得出仪器对甘油的检出限和定量限分别为0.046g/L和0.118g/L。

A

L

= A

b

+ KS

b

[3]

式中A

L

（Average of low lever）是分析试样在检出限水平时测得的分析信号的平均值，即最小

检测信号值（响应值）；A

b

（Average of blank）和S

b

（SD of blank）分别为在测定试样相同条件下，

对空白试样进行足够多次（比如20次）测量所得的空白信号（噪声）的平均值和测定的标准偏差；

K是由置信水平决定的系数，IUPAC推荐K=3，在误差正态分布条件下，其置信度为99.7%。A

L

值

所对应的被测元素的量或浓度即为最小检出量Q

L

和最小检出浓度C

L

，即检出限(Limit of Detection，

LOD)；K=10时计算的A

L

值为定量限(Limit of Quantitation，LOQ)。

2.3 加标回收率

分别向干红葡萄酒和干白葡萄酒中加入高、中、低三个不同浓度梯度的乙酸标准溶液，按照Arena仪

器设定参数测定并计算回收率，干红回收率在94.7%～98.0%之间，干白回收率在92.5%～95.0%之间见

表1。表明该方法检测结果准确，定量检测葡萄酒中乙酸含量稳定、可靠。

表1 乙酸激酶法测定葡萄酒中乙酸的加标回收率(n=3)

Table 1 Recovery test of Acetic acid in wine by Acetate Kinase(AK) (n=3)

名称

干红

葡萄酒

原始浓度(g/L) 加入浓度(g/L) 测定浓度(g/L) 平均回收率%

0.287 0.360 0.404±0.024 112.11

0.287 0.630 0.633±0.015 100.55

0.287 0.900 0.817±0.002 90.73

0.173 0.117 0.129±0.008 109.41

0.173 0.206 0.153±0.022 74.49

0.173 0.294 0.236±0.010 80.41

干白

葡萄酒

2.4 精密度、重复性测定

分别选择干红葡萄酒和干白葡萄酒做精密度、重复性的实验。对同一样品按本方法进行10次重复测

定，计算对干红葡萄酒和干白葡萄酒样品的精密度检测结果（RSD%）分别为0.76%和1.66%；对同一样

品取10份按本方法分别测定，计算对干红葡萄酒和干白葡萄酒的重复性检测结果（RSD%）分别为1.60%

和1.24%；结果分别见表2和表3。

表2 L-乙酸激酶法对葡萄酒中乙酸含量的精密度测定结果（n=10）

Table 2 Precision test of Acetic acid in wine by Acetate Kinase(AK) (n=10)

测定次数

平均

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

值

干

L-乙酸含量

（g/L）

红

干

白

0.43

8

0.32

1

0.42

9

0.30

7

0.45

1

0.28

8

0.44

5

0.29

4

0.43

9

0.31

2

表3 乙酸激酶法对葡萄酒中乙酸含量的重复性测定结果（n=10）

Table 3 Repeatability test of Acetic acid in wine by Acetate Kinase(AK) (n=10)

测定次数

L-乙酸含量

（g/L）

干红

干白

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

平均值

0.321 0.299 0.288

0.188 0.175 0.175

0.273

0.175

0.285

0.172

0.275

0.168

0.295

0.167

0.290

0.166

0.276

0.165

RSD%

0.44

5

0.30

2

0.43

6

0.30

4

0.42

1

0.29

4

0.42

3

0.30

1

0.44

8

0.30

3

0.43

8

0.30

4

RSD

%

2.345

3.191

0.269 0.287 5.436

0.164 0.171 4.300

2.5 样品测定

分别对19种干红、干白葡萄酒样品按照同样方法进行测定，乙酸含量的结果见下表：

编号

葡萄酒

乙酸（g/L）

编号

葡萄酒

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

干红1 干红2 干红3 干红4 干红5 干红6 干红7 干红8 干红9 干红10

0.633 0.402 0.449 0.437 0.858 1.655 12.041 0.33 14.64 0.5.13

11 12 13 14 15 16 17 18 19

干红11 干红12 干红13干红14 干红15干白1 干白2 干白3 干白4

乙酸（g/L） 1.07 0.318 0.872 0.283 0.356 3.213 0.279 0.255

0.268

3. 结 论

本文建立了全自动工业生化分析仪乙酸激酶法测定葡萄酒中乙酸含量的方法，该方法的加标回收率介

于80.41%～112.11%之间，精密度和重复性分别是2.35%和4.30%，能够满足酒类企业对产品的快速检

验或葡萄酒生产过程中的质量控制要求。

参考文献

[1]

GB/T 5009.157-2003 食品中有机酸的测定.

[2]

GB15037-2006 葡萄酒国家标准《葡萄酒》.