2024年5月27日发(作者：佟盼夏)
S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定
何黎黎1, 杨立开2, 邓黎2, 龚涛2, 孙迅2, 张志荣2
【摘 要】目的：研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法. 方法：采用苯巴比妥钠
作为诱导剂制备大鼠肝S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9蛋白含量. 结果：成功制得
大鼠肝S9, 并测定其蛋白含量为38.66mg/ml. 结论：苯巴比妥钠作为诱导剂可以成功制
备出大鼠肝S9.
【期刊名称】西南民族大学学报（自然科学版）
【年(卷),期】2010(036)002
【总页数】3
【关键词】S9制备; 蛋白含量测定
许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的. 大鼠肝
S9(Hepatic post-mitochondrial supernatant)是许多体外实验常用的体外活化系统, 其
主要有效成分为混合功能氧化酶(mixed function oxidase , MPO) 系统, 其中许多酶共同
组成电子传递体系, 其中细胞色素P450(CYP450)在整个酶系中起着末端氧化酶作用, 具有
活化氧分子和与底物结合的双重功能. CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在
MPO系统中起决定作用[1], 苯巴比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂[2,3], 能诱导活化
许多致癌性化学物所需要的细胞色素. 因此, 本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂, 制备S9, 并
采用Lowry法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法
和测定方法.
1 试药与仪器
1.1 药品与试剂
KCl(分析纯), 苯巴比妥钠(分析纯), MgCl2 6 H2O(分析纯)PBS缓冲液(自配), 6-磷酸
葡萄糖(glucose-6-phosphate, Sigma, 美国), 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶Ⅱ,
nicotinamide -adenine dinucleotide phosphate, NADP, Sigma, 美国), Lowry法蛋白
测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)
1.2 仪器
冷冻高速离心机(Beckman, AllegraTMX-22R, 美国)；紫外可见分光光度计()
1.3 实验动物
Sprague –Dawley大鼠, 雄性, 体重约200g/只(四川大学华西动物实验中心)
2 方法
2.1 肝酶系统的诱导
用苯巴比妥钠诱导制备大鼠肝脏S9[2,4]. 将苯巴比妥钠用生理盐水配置成10mg/ml
的溶液. 选用体重约200克的Sprague –Dawley雄性大鼠腹腔注射苯巴比妥钠溶液
80mg/kg(每日一次), 连续给药三日. 于第四日断颈处死.
2.2 大鼠肝S9的制备
取采用苯巴比妥钠诱导大鼠, 处死后立即无菌条件下冲洗并取出肝脏. 立即用4℃含有
1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)灌洗肝脏. 再按3 ml/g 湿重的比例加入含
有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)于冰浴中匀浆. 合并匀浆, 并于冷冻高速
离心机中9000×g离心30min, 取其上清液即为S9. 蛋白质含量按 Lowry 法测定. 测定合
格者, 用离心管分装为1.0ml/管, -80℃冰箱中保存, 在实验使用前将冷冻的S9 缓慢融化.
将1 ml S9, 0.33 ml 1 M KCl, 0.32 ml 0.25 M MgCl2 6 H2O, 0.25 ml 0.2 M 6-磷酸葡
萄糖, 1 ml 0.04 M NADP, 2.10 ml去离子水和5 ml 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)配制成代谢
酶活化系统[5,6].
2.3 Lowry法测定S9中蛋白含量
2.3.1 标准曲线的绘制
取6个带盖的1.5 ml离心管, 编好号后, 按下表顺序加入试剂：
每管加入碱性铜试剂工作液后需立即混匀, 20～25℃放置10min后加入Folin-酚试
剂, 混匀后, 20～25℃放置30min后在660nm下比色测定(1ml比色杯, 1cm光径测定).
以蛋白含量(μg/μl)为横坐标, 吸光值为纵坐标, 绘出标准曲线；
2.3.2 自制S9样品的蛋白浓度测定
分别取3份分装后的大鼠肝S9样品, 生理盐水稀释100倍, 取样品稀释液总体积为
200μl, 加入碱性铜试剂工作液1000μl, 充分混匀, 置20～25℃水浴保温10分钟后, 加入
1N Folin-酚试剂100μl, 20～250C放置30min后, 以标准曲线0号管做参比, 在660nm
波长下比色, 记录吸光值. 根据所测样品的吸光值, 在标准曲线上即可查得相应的蛋白质含
量(μg/μl), 乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度.
3 结果
3.1 Lowry法测定蛋白含量的标准曲线
按照lowry法, 采用蛋白质标准工作液进行测定, 将蛋白含量对紫外可见吸收值(OD)
作图, 得到标准曲线, OD=0.7662×C+0.0086, R2=0.9928, 线性关系良好, 线性范围为：
0.1mg/ml-0.5mg/ml.
3.2 自制大鼠肝S9蛋白质含量的测定
根据3份自制大鼠肝S9稀释液测得的平均吸光度(OD值), 带入蛋白含量测定标准曲
线, 即可求得平均蛋白含量. 测得所制备的大鼠肝S9平均蛋白含量为38.66mg/ml.
4 讨论
在制备S9混悬液过程中, 应注意用新鲜冰冷的0.15 mol/l氯化钾溶液连续冲洗肝脏
数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白. 所制备得到的S9应测定蛋白浓度[1,2], 本
实验应用Lowry法测定大鼠肝S9 蛋白浓度, 其显色原理为Folin酚试剂与蛋白质的酷氨
酸和色氨酸残基反应显蓝色, 可采用紫外分光光度法测定吸收值测定.
参考文献:
[1] 王亚其, 李宏霞, 肖凯, 等. 两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活
性比较[J]. 现代预防医学, 2006, 33(4):457-459.
[2] FABIANI R, ROSIGNOLI P, BARTOLOMEO AD, et al. DNA-damaging ability
of isoprene and isoprene mono-epoxide (EPOX I) in human cells evaluated with
the comet assay[J]. Mutat Res, 2007, 629: 7-13.
[3] 程培英, 曲桂娟, 马红霞, 董晓庆. 苷肽注射液对鼠致突变作用的研究[J]. 吉林农业
大学学报, 2007, 29 (3) :334-337.
[4] AARON CS, BOLCSFOLDI G, GLATT HR, et al. Mammalian cell gene
mutation assays working group report[J]. Mutat Res, 1994, 312: 235-239.
[5] EREXSON GL, PERIAGO MV, SPICER C S. Differential sensitivity of Chinese
hamster V79 and Chinese hamster ovary (CHO) cells in the in vitro micronucleus
screening assay[J]. Mutation Research, 2001, 495: 75-80.
[6] EKE D, CELIK A. Genotoxicity of thimerosal in cultured human lymphocytes
with and without metabolic activation sister chromatid exchange analysis
proliferation index and mitotic index[J]. Toxicology in vitro, 2008, 22: 927-934.
book=36,ebook=47
【文献来源】/academic-journal-cn_journal-
southwest-minzu-university-natural-science-edition_thesis/
2024年5月27日发(作者：佟盼夏)
S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定
何黎黎1, 杨立开2, 邓黎2, 龚涛2, 孙迅2, 张志荣2
【摘 要】目的：研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法. 方法：采用苯巴比妥钠
作为诱导剂制备大鼠肝S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9蛋白含量. 结果：成功制得
大鼠肝S9, 并测定其蛋白含量为38.66mg/ml. 结论：苯巴比妥钠作为诱导剂可以成功制
备出大鼠肝S9.
【期刊名称】西南民族大学学报（自然科学版）
【年(卷),期】2010(036)002
【总页数】3
【关键词】S9制备; 蛋白含量测定
许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的. 大鼠肝
S9(Hepatic post-mitochondrial supernatant)是许多体外实验常用的体外活化系统, 其
主要有效成分为混合功能氧化酶(mixed function oxidase , MPO) 系统, 其中许多酶共同
组成电子传递体系, 其中细胞色素P450(CYP450)在整个酶系中起着末端氧化酶作用, 具有
活化氧分子和与底物结合的双重功能. CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在
MPO系统中起决定作用[1], 苯巴比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂[2,3], 能诱导活化
许多致癌性化学物所需要的细胞色素. 因此, 本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂, 制备S9, 并
采用Lowry法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法
和测定方法.
1 试药与仪器
1.1 药品与试剂
KCl(分析纯), 苯巴比妥钠(分析纯), MgCl2 6 H2O(分析纯)PBS缓冲液(自配), 6-磷酸
葡萄糖(glucose-6-phosphate, Sigma, 美国), 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶Ⅱ,
nicotinamide -adenine dinucleotide phosphate, NADP, Sigma, 美国), Lowry法蛋白
测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)
1.2 仪器
冷冻高速离心机(Beckman, AllegraTMX-22R, 美国)；紫外可见分光光度计()
1.3 实验动物
Sprague –Dawley大鼠, 雄性, 体重约200g/只(四川大学华西动物实验中心)
2 方法
2.1 肝酶系统的诱导
用苯巴比妥钠诱导制备大鼠肝脏S9[2,4]. 将苯巴比妥钠用生理盐水配置成10mg/ml
的溶液. 选用体重约200克的Sprague –Dawley雄性大鼠腹腔注射苯巴比妥钠溶液
80mg/kg(每日一次), 连续给药三日. 于第四日断颈处死.
2.2 大鼠肝S9的制备
取采用苯巴比妥钠诱导大鼠, 处死后立即无菌条件下冲洗并取出肝脏. 立即用4℃含有
1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)灌洗肝脏. 再按3 ml/g 湿重的比例加入含
有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)于冰浴中匀浆. 合并匀浆, 并于冷冻高速
离心机中9000×g离心30min, 取其上清液即为S9. 蛋白质含量按 Lowry 法测定. 测定合
格者, 用离心管分装为1.0ml/管, -80℃冰箱中保存, 在实验使用前将冷冻的S9 缓慢融化.
将1 ml S9, 0.33 ml 1 M KCl, 0.32 ml 0.25 M MgCl2 6 H2O, 0.25 ml 0.2 M 6-磷酸葡
萄糖, 1 ml 0.04 M NADP, 2.10 ml去离子水和5 ml 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)配制成代谢
酶活化系统[5,6].
2.3 Lowry法测定S9中蛋白含量
2.3.1 标准曲线的绘制
取6个带盖的1.5 ml离心管, 编好号后, 按下表顺序加入试剂：
每管加入碱性铜试剂工作液后需立即混匀, 20～25℃放置10min后加入Folin-酚试
剂, 混匀后, 20～25℃放置30min后在660nm下比色测定(1ml比色杯, 1cm光径测定).
以蛋白含量(μg/μl)为横坐标, 吸光值为纵坐标, 绘出标准曲线；
2.3.2 自制S9样品的蛋白浓度测定
分别取3份分装后的大鼠肝S9样品, 生理盐水稀释100倍, 取样品稀释液总体积为
200μl, 加入碱性铜试剂工作液1000μl, 充分混匀, 置20～25℃水浴保温10分钟后, 加入
1N Folin-酚试剂100μl, 20～250C放置30min后, 以标准曲线0号管做参比, 在660nm
波长下比色, 记录吸光值. 根据所测样品的吸光值, 在标准曲线上即可查得相应的蛋白质含
量(μg/μl), 乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度.
3 结果
3.1 Lowry法测定蛋白含量的标准曲线
按照lowry法, 采用蛋白质标准工作液进行测定, 将蛋白含量对紫外可见吸收值(OD)
作图, 得到标准曲线, OD=0.7662×C+0.0086, R2=0.9928, 线性关系良好, 线性范围为：
0.1mg/ml-0.5mg/ml.
3.2 自制大鼠肝S9蛋白质含量的测定
根据3份自制大鼠肝S9稀释液测得的平均吸光度(OD值), 带入蛋白含量测定标准曲
线, 即可求得平均蛋白含量. 测得所制备的大鼠肝S9平均蛋白含量为38.66mg/ml.
4 讨论
在制备S9混悬液过程中, 应注意用新鲜冰冷的0.15 mol/l氯化钾溶液连续冲洗肝脏
数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白. 所制备得到的S9应测定蛋白浓度[1,2], 本
实验应用Lowry法测定大鼠肝S9 蛋白浓度, 其显色原理为Folin酚试剂与蛋白质的酷氨
酸和色氨酸残基反应显蓝色, 可采用紫外分光光度法测定吸收值测定.
参考文献:
[1] 王亚其, 李宏霞, 肖凯, 等. 两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活
性比较[J]. 现代预防医学, 2006, 33(4):457-459.
[2] FABIANI R, ROSIGNOLI P, BARTOLOMEO AD, et al. DNA-damaging ability
of isoprene and isoprene mono-epoxide (EPOX I) in human cells evaluated with
the comet assay[J]. Mutat Res, 2007, 629: 7-13.
[3] 程培英, 曲桂娟, 马红霞, 董晓庆. 苷肽注射液对鼠致突变作用的研究[J]. 吉林农业
大学学报, 2007, 29 (3) :334-337.
[4] AARON CS, BOLCSFOLDI G, GLATT HR, et al. Mammalian cell gene
mutation assays working group report[J]. Mutat Res, 1994, 312: 235-239.
[5] EREXSON GL, PERIAGO MV, SPICER C S. Differential sensitivity of Chinese
hamster V79 and Chinese hamster ovary (CHO) cells in the in vitro micronucleus
screening assay[J]. Mutation Research, 2001, 495: 75-80.
[6] EKE D, CELIK A. Genotoxicity of thimerosal in cultured human lymphocytes
with and without metabolic activation sister chromatid exchange analysis
proliferation index and mitotic index[J]. Toxicology in vitro, 2008, 22: 927-934.
book=36,ebook=47
【文献来源】/academic-journal-cn_journal-
southwest-minzu-university-natural-science-edition_thesis/