2024年9月19日发(作者：贯恨风)
８５４ ， ２毗ｓ７（８）ｈ ／一ｃｓｕｍｅａ－ｏｒｓ 印：／／ｘｂ￣ …ｅｔ
日本血吸虫ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗与ＩＬ－１ ２
对水牛保护性作用的研究
胡平成 ，夏大 ，崔虹艳 ，张苹芳 ，何永康。，喻鑫玲 ，孙振球
（１．中南大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，长沙４１００７８；２．湖南省益阳市卫生局，湖南益阳４１３０００；
３．湖南省血吸虫病防治所，湖南岳阳４１４０００）
【摘要】目的：研究日本血吸虫中国大陆株２３ ｋＤ膜蛋白一热休克蛋白（ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０）ＤＮＡ疫苗联合佐剂白细胞
介素１２（ＩＬ．１２）质粒ＤＮＡ对水牛的免疫保护作用。方法：将血吸虫病非流行区８～１０月龄健康水牛４５头随机分为Ａ
组（ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０＋ＩＬ．１２）、Ｂ组（ＳｊＣ２３＋ＩＬ一１２）和Ｃ组（ｐＶＡＸ＋ＩＬ．１２），每组１５头。每头牛经肩部肌注免疫３次，每次间
隔２８ ｄ。末次免疫后２８ ｄ，每头牛感染日本血吸虫尾蚴１０００条。解剖前２天及当天分别收集粪便１次，用定量法检
测虫卵和毛蚴数。攻击感染后５６天解剖所有水牛，经胸主动脉灌冲法收集成虫，计数成虫数，检测每克肝组织虫卯数。
结果：Ａ，Ｂ组与ｃ组相比，分别获得４５．７０％和２６．６１％的减雌率，４４．５１％和２５．８４％的减虫率，４１．１０％和３１．６３％
的减粪卵率，４８．１１％和３８．０７％的减毛蚴率及４３．３９％和３１．９５％的减肝卯率。Ａ组的５个率均比Ｂ组高（ｐ＜０．０５）。结论：
用ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗和ＩＬ一１２联合免疫水牛可获得明显的免疫保护作用。
【关键词］日本血吸虫；２３ ｋＤ膜蛋白；热休克蛋白７０；ＤＮＡ疫苗；白细胞介素１２；保护性作用
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—７３４７．２０１２．０８．０１７
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＳｊＣ２３－Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ—Ｉ ２ ｏｎ Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｉｎ ｗａｔｅｒ ｂｕｆｆａｌｏｓ
ＨＵ Ｐｉｎｇｃｈｅｎｇ Ｊ ＸＩＡ Ｄａ ，ＣＵＩ Ｈｏｎｇｙａｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｐｉｎｇｆａｎｇ Ｊ ＨＥ Ｙｏｎｇｋａｎｇ ，ＹＵ Ｘｉｎｌｉｎｇ３，ＳＵＮ Ｚｈｅｎｑｉｕ
ｆｊ＿Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ 印ｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ６ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１ ００７８；２．Ｙｉｙａｎｇ Ｈｅａｌｔｈ
Ｂｕｒｅａｕ ｏｌＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＹｉｙａｎｇＨｕｎａｎ４１３０００；３．ＨｕｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ３ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓＧＹｕｅｙａｎｇＨｕｎａｎ４１４００ＧＣｈｉｎａ）
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ—ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆＪａｐａｎ Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍａｉｎｌａｎｄ
ｓｔｒａｉｎ）２３ ｋＤ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０）ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｌｕｓ ａｄｊｕｖａｎｔ—
ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１２（ＩＬ一１２）ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｏｎＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｗａｔｅｒｂｕｆｆａｌｏｓ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｏｒｔｙ—ｆｉｖｅ ｈｅａｌｔｈ ｗａｔｅｒ ｂｕｆｆａｌｏｓ（８－１０ ｍｏｎｔｈｓ ｏｌｄ）ｉｎ ｎＯＤ—ｅｎｄｅｍｉｃ ａｒｅａ ｏｆ
ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｓｓｉｇｎｅｄ ｉｎｔｏ ｇｒｏｕｐ Ａ（ｓｊｃ２３一Ｈｓｐ７０＋ＩＬ一１２，３００ ｇ），ｇｒｏｕｐ Ｂ
（ＳｊＣ２３＋ＩＬ一１２，３００ ｔｘｇ）ａｎｄ ｇｒｏｕｐ Ｃ（ｐＶＡＸ＋ＩＬ一１２，３００ ），ＩＳ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ．Ｅａｃｈ ｂｕｆｆａｌｏ ｗａｓ
ｉｍｍｕｎｅｄ ｂｙ ｓｈｏｕｌｄｅｒ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ３ ｔｉｍｅｓ，ａｔ ａｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｏｆ ２８ ｄａｙｓ．Ｔｗｅｎｔｙ－ｅｉｇｈｔ
ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｌａｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＪ ｅａｃｈ ｂｕｆｆａｌｏ ｗａｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ １０００Ｊａｐａｎ ｃｅｒｃａｒｉａｅ ｏｆＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ．
Ｆｅｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ２ ｄａｙｓ ａｎｄ １ ｄａｙ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ａｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ｄａｙ ｏｆ
收稿日期（Ｄａｔｅ ｏｆｒｅｃｅｐｔｉｏｎ）：２０１２—０６—１２
作者简介（Ｂｉｏｇｒａｐｈｙ）：胡平成，硕士，副教授，主要从事流行病与卫生统计学研究。
通信作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ）：喻鑫玲，Ｅｍａｉｌ：ｘｉｎｌｉｎｇｙｙ６６＠１６３．ｃｏｍ
日本血吸虫ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗与ＩＬ一１２对水牛保护性作用的研究胡平成，等
ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｈａｔｃｈｉｎｇ ｍｉｒａｃｉｄｉａ ａｎｄ ｅｇｇｓ ｐｅｒ ｇｒａｍ ｆｅｃｅｓ ｗａｓ ｒｅｃｏｒｄｅｄ．Ｆｉｆｔｙ－ｓｉｘ ｄａｙｓ
ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｂｕｆｆａｌｏｓ ｗｅｒｅ ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ ａｎｄ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｖｉａ ｔｈｅ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ａｏｒｔａ．ｑｑａｅ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ
ａｄｕｌｔ ｗｏｒｍｓ ａｎｄ ｅｇｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｗｅｒｅ ｃｏｕｎｔｅｄ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｗｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｇｒｏｕｐ Ａ ａｎｄ Ｂ ｗｉｔｈ ｇｒｏｕｐ Ｃ：ｔｈｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４５．７％ａｎｄ
２６．６１％；ｂｕｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４４．５１％ａｎｄ ２５．８４％ｊ ｔｈｅ ｆｅｃａｌ ｅｇｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４１．１％ａｎｄ
３１．６３％；ｔｈｅ ｍｉｒａｃｉｄｉｕｍ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４８．１１％ａｎｄ ３８．０７％；ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｅｇｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ
ｗａｓ ４３．３９％ａｎｄ ３ １．９５％．ｑ－ｈｅ ａｂｏｖｅ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｂ（Ｐ＜０．０ｓ）．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＳｊＣ２３－Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＩＬ・－１２ ｍａｙ ｈａｖｅ ａ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｉｍｍｕｎｏ・・
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｎｂｕｆｆａｌｏｓ．
ＫＥＹＷＯＲＤＳ
Ｊａｐａｎ Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ；２３ ｋＤ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０；ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ；ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１ ２；
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ
血吸虫病是世界上最常见的寄生虫病之一，不
仅影响个人健康，而且影响整个血吸虫病流行区域
的经济发展［１－３］０我国是日本血吸虫病流行最为严重
的国家，约１亿人口受到血吸虫病的威胁 Ｊ。特别是
近年来长江洪水泛滥，血吸虫病有增多和向城市蔓
进行了对比研究，为血吸虫ＤＮＡ疫苗研究与应用提
供科学依据。
１材料与方法
１．１试验现场
延的趋势。水牛是湖区血吸虫病主要传染源之一，
重复感染机会多，频繁化疗费用高、效果差，ＷＨＯ
把血吸虫病疫苗的研究放在优先发展的位置上 ５Ｊ，
选在血吸虫病非流行区湖南省岳阳县筻口镇新安
村铁山水库下游的沙港河河畔旁，草滩面积约２００ ｍ×
２００ｍ，距岳阳市区约４０ ｋｍ。新安村居民７０８人，耕
牛５５头，无外来渔船民，历史上无钉螺、亦无血吸虫
病流行。
１．２分组
近十年来，血吸虫病ＤＮＡ疫苗研究日益受到重视，
显示出较好的发展潜力［６－７］ｏ日本血吸虫２３膜蛋白
ＤＮＡ疫苗（ＳＪＣ２３）经小鼠及猪等一系列动物实验已
被证实是一种前景较好的疫苗候选分子 。Ｈｓｐ７０
家族是Ｈｓｐ家族中最大的一族，生物学功能十分广
泛，具有分子伴侣作用并参与抗原提呈过程，可结合 ４５头健康水牛购自非血吸虫病流行区湖南省邵
多种抗原肽形成Ｈｓｐ 抗原肽复合物，激活特异性细
胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）和记忆性Ｔ细胞，引发细
胞免疫反应并有效防止免疫逃避，因而，日本血吸
虫Ｈｓｐ一抗原肽复合疫苗可增强疫苗的免疫性保护作
用，现已成为抗寄生虫感染中研究的热点之一ｌｌ 。
Ｈｅｄｓｔｒｏｍ等 证实曼氏血吸虫的Ｈｓｐ７０是感染宿
主的一种主要的免疫原。阎玉涛等Ｈ刮用未感染日本
阳市隆回县，８－１０月龄，体质量（１５４．８±１４．７）ｋｇ。水
牛于试验开始前半月以上进入试点牛棚，以适应当
地环境。以粪便集卵孵化法确定所有水牛无血吸虫
病，并用全剂量阿维菌素作肠道驱虫处理。按体质量
大小编号，用牛角烙编号和挂颈标两种方法标记，用
完全随机化分组方法分成Ａ组（ＳＪＣ２３．Ｈｓｐ７０＋ＩＬ一１２
组）、Ｂ组（ＳＪＣ２３＋ＩＬ一１２组）、Ｃ组（
照组），每组１５头。
１．３疫苗及制剂
＋ＩＬ一１２对
血吸虫的东方田鼠的血清免疫筛选日本血吸虫成虫
ｃＤＮＡ文库时，发现７个具有天然抵抗力蛋白分子基
因中有Ｈｓｐ７０的基因。因此，日本血吸虫Ｈｓｐ一抗原
肽复合疫苗有可能成为提高疫苗保护率的一个突破
按盲法实验设计，２种疫苗及ｉ种制剂和ＩＬ一
１２质粒ＤＮＡ均由美国哈佛大学公共卫生学院Ｄ．Ａ．
点，而白细胞介素１２（ＩＬ一１２）是决定Ｔｈｌ型免疫应答
的主要细胞因子，已用于对多种病原体（细菌、寄生
虫、真菌和病毒）所致疾病及肿瘤的ＤＮＡ疫苗的研
Ｈａｒｎ教授制备并提供。２种疫苗及１种制剂由与本实
验无关的澳大利亚专家编码，并同ＩＬ一１２质粒ＤＮＡ
一
究，以增强其免疫保护作用＿ｌ 。本研究采用ＳＪＣ２３一
Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗、ＳＪＣ２３ ＤＮＡ疫苗与基因佐剂ＩＬ一１２
起派专人直接送至现场使用，实验结束后由澳大
利亚专家解码疫苗及制剂。２种疫苗及１种制剂仅编
号和颜色标记不同：ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０（编号１０，黄色）、
质粒ＤＮＡ，对水牛血吸虫病的联合免疫保护性作用
中南大学学报（医学版），２ｏ１２ ３７（８）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｕｍｅｄ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｘ．ｘｙｓｍ．ｎｅｔ
ＳＪＣ２３９（编号４０，红色）、空质粒（编号２５，蓝色），
ＩＬ一１２质粒ＤＮＡ已标明。原液浓度均为１ ｍｇ／ｍＬ，使
用前以无菌生理盐水将疫苗、制剂与ＩＬ—ｌ２质粒ＤＮＡ
混合配制成所需浓度，即疫苗、制剂与ＩＬ一１２质粒
ＤＮＡ在混合液中浓度均为３００ ａｔｇ／ｍＬ。
１．４免疫方法
在草滩上用麻绳将水牛绑定，免疫方式为肩部
肌肉注射，免疫剂量为１ ｍＬ。共免疫３次，每次间隔
２８ ｄ，Ａ组第１次免疫Ｓ）Ｃ２３．Ｈｓｐ７０质粒ＤＮＡ ３００ ａｔｇ，
第２，３次免疫均同时注射ＳＪＣ２３．Ｈｓｐ７０和ＩＬ．１２质
粒ＤＮＡ各３００ ｔａｇ；Ｂ组第１次免疫ＳＪＣ２３质粒ＤＮＡ
３００ ａｔｇ，第２，３次免疫均同时注射ＳＪＣ２３和ＩＬ一１２质
粒ＤＮＡ各３００ ａｔｇ；Ｃ组第１次免疫ｐＶＡＸ空白质粒
ＤＮＡ ３００ ，第２，３次免疫均同时注射ｐＶＡＸ空质
粒、ＩＬ—ｌ２质粒ＤＮＡ各３００ｔａｇ。
１．５攻击感染
６００只日本血吸虫阳性钉螺由江苏省血吸虫病
防治研究所提供。第３次免疫后２８ ｄ，每头牛经大腿
内侧皮肤感染日本血吸虫尾蚴１０００条。分３ ｄ按组
别顺序随机抽取水牛进行感染，每天感染１５头牛。
感染时，维持室温２０～２５℃，将水牛绑定于特制木板
上，大腿内侧皮肤刮毛，范围约１０ ｃｍ×１０ ｃｍ，去
氯水洗净，计时感染３０ ｍｉｎ。
１．６粪便毛蚴及虫卵检查
于解剖前２ｄ及当天，分别收集每牛粪便标本１次。
１．６．１毛蚴数计数方法
用定量孵化法检测虫卵和毛蚴。称取搅匀的
牛粪Ｓ０ ｇ，用１２０孔目、３００孑Ｌ目尼龙绢袋过筛，
５００ ｍＬ三角烧瓶孵化。孵化２，４，６，８，１０，１３，
ｌ６，ｌ９，２４ ｈ后分别观察并收集毛蚴，每次倒出含
毛蚴上层液至１０００ ｍＬ锥形量筒中，滴加２－３滴碘
液以杀死并染色毛蚴。量筒水满且毛蚴自然沉淀时，
用医院妇产科用吸宫器吸去上层水液。孵化并收集
完毕，将含毛蚴的沉淀移至５０ ｍＬ塑料刻度离心管
中，定容至Ｓ ｍＬ，混匀，取０．３ ｍＬ涂片３片，镜下
计数毛蚴。沉淀镜检毛蚴数（ＭＰＧ一１）＝３人计数的毛
蚴总数ｘ５／０．３／１５０；按组别收集上清液混合，计数毛
蚴数得上清液镜检毛蚴数（ＭＰＧ一２）。总ＭＰＧ＝ＭＰＧ一
１＋ＭＰＧ一２。
１．６．２粪便未孵化虫卵计数方法
将３次孵化完毕的粪渣按水牛编号以３００孔目
尼龙绢袋收集于５０ ｍＬ塑料刻度离心管中，加１０％
甲醛１５ ｍＬ混匀固定５ ｍｉｎ，加乙醚１０ ｍＬ，加水
至４０ ｍＬ，充分摇匀３ ｍｉｎ，静置３０ ａｒｉｎ，低速离心
（１０００ ｒ／ｍｉｎ）３ ａｒｉｎ。离心后弃去含甲醛、乙醚和粪渣
的上层，取沉淀加数滴卢戈氏液染色镜检，定量计
数未孵出的血吸虫卵。若沉淀粪渣过多可重复以上
步骤。粪便未孵化虫卵计数方法：３次粪检孵化后粪
渣按编号混合，称量混合粪渣重量后取５ ｇ稀释至４０
ｍＬ。镜检计数Ｓ ｍＬ中虫卵数（Ｅ），粪卵（ＥＰＧ）＝Ｅ×４０／
（５×混合粪渣重量）／（５＋１）／１５０。为减小测量误差，
取３次检查结果的平均值作为该研究对象（水牛）的
分析指标（粪卵数或毛蚴数），对３组的粪卯数和毛
蚴数进行假设检验（方差分析）后，如果有统计学意
义，按如下公式计算综合指标减粪卵率和减毛蚴率。
减粪卵率＝［（对照组平均每克粪便虫卵数一实验组
平均每克粪便虫卵数）／对照组平均每克粪便虫卵
数］×１００％。
１．７解剖和冲虫
于攻击感染后５６ ｄ解剖水牛和冲虫。计数每头
水牛所有收集的虫体数和雌虫数，通过所收集的虫
体数和雌虫数来计算其减虫率和减雌虫率，其计算
公式为：减虫率＝［（对照组平均检获虫数一实验组平
均检获虫数）／对照组平均检获虫数］×１００％；减雌
虫率＝［（对照组平均检获雌虫数一实验组平均检获雌
虫数）／对照组平均检获雌虫数１×１００％。
１．８肝组织虫卵检查
于每头牛肝脏左、右肝边缘相同部位取样各
约１０ ｇ，剪碎，用电子分析天平称取左、右肝组织各
５ ｇ，于４５ ｍＬ ｓ％ＫＯＨ中３７￣Ｃ摇动消化３ ｈ，离心将
沉渣定容至４ ｍＬ，取ｏ．４ ｍＬ涂片４片镜检计数虫卵
数。左肝粪卵数（ＬＥＰＧ）或右肝粪卵数（ＲＥＰＧ）＝镜
检虫卵数×４／０．４／５；总ＥＰＧ＝（ＬＥＰＧ＋ＲＥＰＧ）／２。
减肝卵率＝［（对照组平均每克肝脏虫卵数一实验组
平均每克肝脏虫卵数）／对照组平均每克肝脏虫卵
数］×１００％。
１．９统计学处理
用ＳＰＳＳ１７．０统计软件对数据进行统计分析，多
个均数的比较采用完全随机设计的方差分析，组间
均数的比较采用方差分析中两两比较的ＬＳＤ—ｔ法，
Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结 果
２．１ ３组检获雌虫数和成虫数的比较与减雌率和减
虫率的计算
３组检获雌虫数的比较，经方差分析有统计学意
义（Ｆ＝８６．８０７，Ｐ＜０．０Ｏｌ；表１）；经方差分析两两比较
日本血吸虫ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗与ＩＬ一１２对水牛保护性作用的研究胡平成，等
的ＬＳＤ—ｔ法，Ａ，Ｂ和Ｃ组检获雌虫数两两间差异均
有统计学意义（ＰＡＢ＜ｏ．００１，ＰＡｃ＜０．００１，ＰＢｃ＜０．００１）。
与Ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减雌率分别为４５．７０％和
２６．６ｌ％，Ａ组的减雌率高于Ｂ组。
３组检获成虫数的比较，经方差分析有统计学意
义（Ｆ＝９２．１８９，Ｐ＜Ｏ．００１；表１）；经方差分析两两比较
的ＬＳＤ—ｔ法，Ａ，Ｂ和Ｃ组检获雌虫数两两间差异均
有统计学意义（Ｐ Ｂ＜０．００１，ＰＡｃ＜０．００１，ＰＢｃ＜ｏ．００１）。
与Ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减虫率分别为４４．５ｌ％，
２５．８４％，Ａ组的减虫率高于Ｂ组。
表１ ３组水牛检获雌虫数和成虫数的比较（ｎ＝１５， ±ｓ）
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ ａｎｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ａｄｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ３ ｇｒｏｕｐｓ（ｎ＝１５， ±Ｓ）
２．２ ３组粪便虫卯数、毛蚴数的比较与减粪卵率和
减毛蚴率的计算
３组粪便虫卵数的比较，经方差分析有统计学
意义（Ｆ＝４２．５８３，Ｐ＜Ｏ．００１；表２）；经方差分析两
两比较的ＬＳＤ．ｔ法，Ａ，Ｂ和Ｃ组粪便虫卵数两两
间差异均有统计学意义（Ｐ ＜ｏ．００１，Ｐ ＜ｏ．００１，
ｐ ＜０．００１）。与ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减粪卵率分别
为４１．１０％，３１．６３％，Ａ组的减粪卵率高于Ｂ组。
３组粪便毛蚴数的比较，经方差分析有统计学
意义（Ｆ＝４５．８０６，Ｐ＜Ｏ．００１；表２）；经方差分析两
两比较的ＬＳＤ—ｔ法，Ａ，Ｂ和Ｃ组粪便毛蚴数两两
间差异均有统计学意义（ＰＡＢ＜０．００１，ＰＡｃ＜０．００１，
Ｐ ＜ｏ．００１）。与Ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减毛蚴率分别
为４８．１１％，３８．０７％，Ａ组的减毛蚴率高于Ｂ组。
表２ ３组水牛粪便虫卵数与毛蚴数的比较（ｎ＝１５， ±ｓ）
Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂｕｆｆａｌｏ ｄｕｎｇ ｅｇｇ ａｎｄ
ｍｉｒａｃｉｄｉａ ｉｎ ｔｈｅ ３ ｇｒｏｕｐｓ（ｎ＝１５， ±ｓ）
２．３ ３组肝脏虫卵数的比较与减肝卵率的计算
Ａ，Ｂ和ｃ组肝组织虫卵数分别为２４９．５３±
５９．２１，２９９．９３±５４．３４，４００．７７±９０．８３，经方差分
析差异有统计学意义（Ｆ＝３０．０５３，Ｐ＜０．００１），经方差
分析两两比较的ＬＳＤ—ｔ法，Ａ，Ｂ和ｃ组肝组织虫卵
两两问差异均有统计学意义（ｐ ＜０．００１，Ｐ ｃ＜０．００１，
Ｐ。 ＜０．ｏｏ１）。与ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减肝卵率分别
为４３．３９％，３１．９５％，Ａ组的减肝卵率高于Ｂ组。
３讨论
２０世纪８０年代中期，根据全球血吸虫病流行
情况及防治进展，ＷＨＯ提出控制血吸虫病的新策
略，以疾病控制代替以往的传播阻断作为防治目标。
防治措施的重点也从中间宿主控制（灭螺）为主转
移到健康教育与化疗为主ｆ２。 ”，吡喹酮是一种对人
体５种主要血吸虫病ｆ曼氏、埃及、湄公、间插与
日本血吸虫病）都非常有效的药物。全球已对１亿
多例血吸虫感染者及有疫水接触史的可能感染者用
吡喹酮进行了治疗，积累了极为丰富的经验［２２］ｏ然
而，已有证据 引表明：曼氏血吸虫对吡喹酮已产生
抗药株，埃及血吸虫病也出现了用吡喹酮难以治愈
的现象。尽管目前还未发现日本血吸虫对吡喹酮敏
感性下降的证据，但是仍需要密切观察日本血吸虫
对吡喹酮是否产生抗药性。事实证明以灭螺和吡喹
酮大规模化疗为主的防治对策并未根本解决血吸虫
病防治问题。
疫苗是控制传染性疾病的有效手段，２０世纪
初就有人设想研制血吸虫疫苗来预防和控制血吸虫
病。抗日本血吸虫ＤＮＡ疫苗的动物实验研究［２ 表
明：混和或多价疫苗是未来ＤＮＡ疫苗的发展方向。
２３ ｋＤ的表面膜分子是第一个从蠕虫的寄生虫中被
详细描述的分子。它是第４家族（ＴＭ４ＳＦ）成员，
是一个完整的膜蛋白质，由４个疏水跨膜结构域及
大小不同的胞外亲水结构域组成。这种２３ ｋＤ蛋白
存在于脊椎动物寄生虫的所有阶段，几乎所有的细
胞都具有这种蛋白。因此，这种蛋白是一个非常好
的疫苗靶标［２５－２７］。
血吸虫２３ ｋＤ膜蛋白存在于血吸虫尾蚴、童
虫、晚期童虫和成虫等各期的表膜上，单抗Ｍ２经
转移到实验小鼠，能产生一定的被动免疫保护作
用，重组Ｓｍ２３在小鼠中可以诱导产生４０％～５０％
的保护作用，表明血吸虫２３ ｋＤ膜蛋白为一潜在
的疫苗候选抗原［２８１０当ｒＳｊ２３与福氏佐剂乳化后
免疫注射绵羊证实其具有高度免疫原性，可获得
５１．２％～６６．１％的减虫率 。ｚｈｕ等 用ＳＪＣ２３
基因克隆人ｐｃＤＮＡ３．１中，构建成ＳＪＣ２３的质粒
ＤＮＡ，在Ｃ５７ＢＬ／６小鼠可诱导产生２６．９％的减虫率，
与ＩＬ一１２质粒ＤＮＡ一起免疫则可产生３５．４％的减虫
率，而且发现免疫鼠的ＩＬ一１２和ＩＦＮ 水平有明显
８５８ 中南大学学报（医学版），２０１２，３７（８）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｕｍｅｄ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｘ．ｘｙｓｍ．ｎｅｔ
升高，但ＩＬ＿４和ＩＬ一１０则无变化；表明Ｓｊ２３ＤＮＡ疫
苗可诱导产生明显的细胞免疫反应（Ｔｈ１）。Ｗｅｓｔｅｒｎ
印迹分析大部分实验鼠可产生抗体，表明ＳｊＣ２３ＤＮＡ
疫苗具有一定的保护作用，可能与ＳＪＣ２３可诱导Ｔ细
胞免疫有关，也可能还有体液免疫的参与。Ｚｈｕ等
用大动物猪作为实验动物，取得了比在小鼠中更好
的免疫保护作用，ＳＪＣ２３组可产生２９．２％的减虫率、
５０．８％的减雌率和４８．２％的减卵率，进一步表明
ＳＪＣ２３可诱导产生较好的保护作用。
本研究以水牛为研究对象，在血吸虫病非疫
区湖南省岳阳县筻口镇的一个天然优良的水牛养
殖基地，采用融合了Ｈｓｐ７０诱导子的日本血吸虫
２３ ｋＤ膜蛋白ＤＮＡ疫苗ｆＳｊＣ２３一Ｈｓｐ７０）与细胞因
子（ＩＬ一１２质粒ＤＮＡ）分子佐剂的联合免疫对水牛的
免疫保护作用进行了观察。与对照组相比，ＳＪＣ２３一
Ｈｓｐ７０＋ＩＬ一１２组和ＳｊＣ２３＋ＩＬ １２组的减雌率、减虫率、
减粪卵率、减毛蚴率及减肝卵率分别为４５．７０％和
２６．６１％，４４．５ｌ％和２５．８４％，４１．１０％和３１．６３％，
４８．１１％和３８．０７％及４３－３９％和３１．９５％，表明多
价ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗对水牛血吸虫病的保护
作用明显高于单价ＳＪＣ２３ ＤＮＡ疫苗；多价ＳＪＣ２３一
Ｈｓｐ７０＋ＩＬ一１２ ＤＮＡ疫苗对水牛血吸虫病可产生与
ＳｊＣ２３＋ＩＬ一１２ ＤＮＡ疫苗对猪的同样较为理想的保护作
用，提示ＳｊＣ２３ＤＮＡ疫苗是一种有发展前景的疫苗。
本研究严格按盲法实验设计进行，避免了主观
因素的干扰，取得了较好的保护性免疫效果，为研
究抗水牛血吸虫病ＤＮＡ疫苗提供了新的科学依据
与途径。因水牛个体大，操作有一定的难度，本结
果仅为初步试验，其现场应用价值仍有待进一步研
究证实。
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（本文编辑彭敏宁）
2024年9月19日发(作者：贯恨风)
８５４ ， ２毗ｓ７（８）ｈ ／一ｃｓｕｍｅａ－ｏｒｓ 印：／／ｘｂ￣ …ｅｔ
日本血吸虫ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗与ＩＬ－１ ２
对水牛保护性作用的研究
胡平成 ，夏大 ，崔虹艳 ，张苹芳 ，何永康。，喻鑫玲 ，孙振球
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【摘要】目的：研究日本血吸虫中国大陆株２３ ｋＤ膜蛋白一热休克蛋白（ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０）ＤＮＡ疫苗联合佐剂白细胞
介素１２（ＩＬ．１２）质粒ＤＮＡ对水牛的免疫保护作用。方法：将血吸虫病非流行区８～１０月龄健康水牛４５头随机分为Ａ
组（ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０＋ＩＬ．１２）、Ｂ组（ＳｊＣ２３＋ＩＬ一１２）和Ｃ组（ｐＶＡＸ＋ＩＬ．１２），每组１５头。每头牛经肩部肌注免疫３次，每次间
隔２８ ｄ。末次免疫后２８ ｄ，每头牛感染日本血吸虫尾蚴１０００条。解剖前２天及当天分别收集粪便１次，用定量法检
测虫卵和毛蚴数。攻击感染后５６天解剖所有水牛，经胸主动脉灌冲法收集成虫，计数成虫数，检测每克肝组织虫卯数。
结果：Ａ，Ｂ组与ｃ组相比，分别获得４５．７０％和２６．６１％的减雌率，４４．５１％和２５．８４％的减虫率，４１．１０％和３１．６３％
的减粪卵率，４８．１１％和３８．０７％的减毛蚴率及４３．３９％和３１．９５％的减肝卯率。Ａ组的５个率均比Ｂ组高（ｐ＜０．０５）。结论：
用ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗和ＩＬ一１２联合免疫水牛可获得明显的免疫保护作用。
【关键词］日本血吸虫；２３ ｋＤ膜蛋白；热休克蛋白７０；ＤＮＡ疫苗；白细胞介素１２；保护性作用
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—７３４７．２０１２．０８．０１７
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＳｊＣ２３－Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ—Ｉ ２ ｏｎ Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｉｎ ｗａｔｅｒ ｂｕｆｆａｌｏｓ
ＨＵ Ｐｉｎｇｃｈｅｎｇ Ｊ ＸＩＡ Ｄａ ，ＣＵＩ Ｈｏｎｇｙａｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｐｉｎｇｆａｎｇ Ｊ ＨＥ Ｙｏｎｇｋａｎｇ ，ＹＵ Ｘｉｎｌｉｎｇ３，ＳＵＮ Ｚｈｅｎｑｉｕ
ｆｊ＿Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ 印ｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ６ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１ ００７８；２．Ｙｉｙａｎｇ Ｈｅａｌｔｈ
Ｂｕｒｅａｕ ｏｌＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＹｉｙａｎｇＨｕｎａｎ４１３０００；３．ＨｕｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ３ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓＧＹｕｅｙａｎｇＨｕｎａｎ４１４００ＧＣｈｉｎａ）
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ—ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆＪａｐａｎ Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍａｉｎｌａｎｄ
ｓｔｒａｉｎ）２３ ｋＤ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０）ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｌｕｓ ａｄｊｕｖａｎｔ—
ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１２（ＩＬ一１２）ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｏｎＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｗａｔｅｒｂｕｆｆａｌｏｓ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｏｒｔｙ—ｆｉｖｅ ｈｅａｌｔｈ ｗａｔｅｒ ｂｕｆｆａｌｏｓ（８－１０ ｍｏｎｔｈｓ ｏｌｄ）ｉｎ ｎＯＤ—ｅｎｄｅｍｉｃ ａｒｅａ ｏｆ
ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｓｓｉｇｎｅｄ ｉｎｔｏ ｇｒｏｕｐ Ａ（ｓｊｃ２３一Ｈｓｐ７０＋ＩＬ一１２，３００ ｇ），ｇｒｏｕｐ Ｂ
（ＳｊＣ２３＋ＩＬ一１２，３００ ｔｘｇ）ａｎｄ ｇｒｏｕｐ Ｃ（ｐＶＡＸ＋ＩＬ一１２，３００ ），ＩＳ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ．Ｅａｃｈ ｂｕｆｆａｌｏ ｗａｓ
ｉｍｍｕｎｅｄ ｂｙ ｓｈｏｕｌｄｅｒ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ３ ｔｉｍｅｓ，ａｔ ａｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｏｆ ２８ ｄａｙｓ．Ｔｗｅｎｔｙ－ｅｉｇｈｔ
ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｌａｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＪ ｅａｃｈ ｂｕｆｆａｌｏ ｗａｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ １０００Ｊａｐａｎ ｃｅｒｃａｒｉａｅ ｏｆＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ．
Ｆｅｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ２ ｄａｙｓ ａｎｄ １ ｄａｙ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ａｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ｄａｙ ｏｆ
收稿日期（Ｄａｔｅ ｏｆｒｅｃｅｐｔｉｏｎ）：２０１２—０６—１２
作者简介（Ｂｉｏｇｒａｐｈｙ）：胡平成，硕士，副教授，主要从事流行病与卫生统计学研究。
通信作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ）：喻鑫玲，Ｅｍａｉｌ：ｘｉｎｌｉｎｇｙｙ６６＠１６３．ｃｏｍ
日本血吸虫ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗与ＩＬ一１２对水牛保护性作用的研究胡平成，等
ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｈａｔｃｈｉｎｇ ｍｉｒａｃｉｄｉａ ａｎｄ ｅｇｇｓ ｐｅｒ ｇｒａｍ ｆｅｃｅｓ ｗａｓ ｒｅｃｏｒｄｅｄ．Ｆｉｆｔｙ－ｓｉｘ ｄａｙｓ
ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｂｕｆｆａｌｏｓ ｗｅｒｅ ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ ａｎｄ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｖｉａ ｔｈｅ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ａｏｒｔａ．ｑｑａｅ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ
ａｄｕｌｔ ｗｏｒｍｓ ａｎｄ ｅｇｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｗｅｒｅ ｃｏｕｎｔｅｄ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｗｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｇｒｏｕｐ Ａ ａｎｄ Ｂ ｗｉｔｈ ｇｒｏｕｐ Ｃ：ｔｈｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４５．７％ａｎｄ
２６．６１％；ｂｕｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４４．５１％ａｎｄ ２５．８４％ｊ ｔｈｅ ｆｅｃａｌ ｅｇｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４１．１％ａｎｄ
３１．６３％；ｔｈｅ ｍｉｒａｃｉｄｉｕｍ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４８．１１％ａｎｄ ３８．０７％；ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｅｇｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ
ｗａｓ ４３．３９％ａｎｄ ３ １．９５％．ｑ－ｈｅ ａｂｏｖｅ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｂ（Ｐ＜０．０ｓ）．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＳｊＣ２３－Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＩＬ・－１２ ｍａｙ ｈａｖｅ ａ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｉｍｍｕｎｏ・・
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｎｂｕｆｆａｌｏｓ．
ＫＥＹＷＯＲＤＳ
Ｊａｐａｎ Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ；２３ ｋＤ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０；ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ；ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１ ２；
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ
血吸虫病是世界上最常见的寄生虫病之一，不
仅影响个人健康，而且影响整个血吸虫病流行区域
的经济发展［１－３］０我国是日本血吸虫病流行最为严重
的国家，约１亿人口受到血吸虫病的威胁 Ｊ。特别是
近年来长江洪水泛滥，血吸虫病有增多和向城市蔓
进行了对比研究，为血吸虫ＤＮＡ疫苗研究与应用提
供科学依据。
１材料与方法
１．１试验现场
延的趋势。水牛是湖区血吸虫病主要传染源之一，
重复感染机会多，频繁化疗费用高、效果差，ＷＨＯ
把血吸虫病疫苗的研究放在优先发展的位置上 ５Ｊ，
选在血吸虫病非流行区湖南省岳阳县筻口镇新安
村铁山水库下游的沙港河河畔旁，草滩面积约２００ ｍ×
２００ｍ，距岳阳市区约４０ ｋｍ。新安村居民７０８人，耕
牛５５头，无外来渔船民，历史上无钉螺、亦无血吸虫
病流行。
１．２分组
近十年来，血吸虫病ＤＮＡ疫苗研究日益受到重视，
显示出较好的发展潜力［６－７］ｏ日本血吸虫２３膜蛋白
ＤＮＡ疫苗（ＳＪＣ２３）经小鼠及猪等一系列动物实验已
被证实是一种前景较好的疫苗候选分子 。Ｈｓｐ７０
家族是Ｈｓｐ家族中最大的一族，生物学功能十分广
泛，具有分子伴侣作用并参与抗原提呈过程，可结合 ４５头健康水牛购自非血吸虫病流行区湖南省邵
多种抗原肽形成Ｈｓｐ 抗原肽复合物，激活特异性细
胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）和记忆性Ｔ细胞，引发细
胞免疫反应并有效防止免疫逃避，因而，日本血吸
虫Ｈｓｐ一抗原肽复合疫苗可增强疫苗的免疫性保护作
用，现已成为抗寄生虫感染中研究的热点之一ｌｌ 。
Ｈｅｄｓｔｒｏｍ等 证实曼氏血吸虫的Ｈｓｐ７０是感染宿
主的一种主要的免疫原。阎玉涛等Ｈ刮用未感染日本
阳市隆回县，８－１０月龄，体质量（１５４．８±１４．７）ｋｇ。水
牛于试验开始前半月以上进入试点牛棚，以适应当
地环境。以粪便集卵孵化法确定所有水牛无血吸虫
病，并用全剂量阿维菌素作肠道驱虫处理。按体质量
大小编号，用牛角烙编号和挂颈标两种方法标记，用
完全随机化分组方法分成Ａ组（ＳＪＣ２３．Ｈｓｐ７０＋ＩＬ一１２
组）、Ｂ组（ＳＪＣ２３＋ＩＬ一１２组）、Ｃ组（
照组），每组１５头。
１．３疫苗及制剂
＋ＩＬ一１２对
血吸虫的东方田鼠的血清免疫筛选日本血吸虫成虫
ｃＤＮＡ文库时，发现７个具有天然抵抗力蛋白分子基
因中有Ｈｓｐ７０的基因。因此，日本血吸虫Ｈｓｐ一抗原
肽复合疫苗有可能成为提高疫苗保护率的一个突破
按盲法实验设计，２种疫苗及ｉ种制剂和ＩＬ一
１２质粒ＤＮＡ均由美国哈佛大学公共卫生学院Ｄ．Ａ．
点，而白细胞介素１２（ＩＬ一１２）是决定Ｔｈｌ型免疫应答
的主要细胞因子，已用于对多种病原体（细菌、寄生
虫、真菌和病毒）所致疾病及肿瘤的ＤＮＡ疫苗的研
Ｈａｒｎ教授制备并提供。２种疫苗及１种制剂由与本实
验无关的澳大利亚专家编码，并同ＩＬ一１２质粒ＤＮＡ
一
究，以增强其免疫保护作用＿ｌ 。本研究采用ＳＪＣ２３一
Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗、ＳＪＣ２３ ＤＮＡ疫苗与基因佐剂ＩＬ一１２
起派专人直接送至现场使用，实验结束后由澳大
利亚专家解码疫苗及制剂。２种疫苗及１种制剂仅编
号和颜色标记不同：ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０（编号１０，黄色）、
质粒ＤＮＡ，对水牛血吸虫病的联合免疫保护性作用
中南大学学报（医学版），２ｏ１２ ３７（８）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｕｍｅｄ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｘ．ｘｙｓｍ．ｎｅｔ
ＳＪＣ２３９（编号４０，红色）、空质粒（编号２５，蓝色），
ＩＬ一１２质粒ＤＮＡ已标明。原液浓度均为１ ｍｇ／ｍＬ，使
用前以无菌生理盐水将疫苗、制剂与ＩＬ—ｌ２质粒ＤＮＡ
混合配制成所需浓度，即疫苗、制剂与ＩＬ一１２质粒
ＤＮＡ在混合液中浓度均为３００ ａｔｇ／ｍＬ。
１．４免疫方法
在草滩上用麻绳将水牛绑定，免疫方式为肩部
肌肉注射，免疫剂量为１ ｍＬ。共免疫３次，每次间隔
２８ ｄ，Ａ组第１次免疫Ｓ）Ｃ２３．Ｈｓｐ７０质粒ＤＮＡ ３００ ａｔｇ，
第２，３次免疫均同时注射ＳＪＣ２３．Ｈｓｐ７０和ＩＬ．１２质
粒ＤＮＡ各３００ ｔａｇ；Ｂ组第１次免疫ＳＪＣ２３质粒ＤＮＡ
３００ ａｔｇ，第２，３次免疫均同时注射ＳＪＣ２３和ＩＬ一１２质
粒ＤＮＡ各３００ ａｔｇ；Ｃ组第１次免疫ｐＶＡＸ空白质粒
ＤＮＡ ３００ ，第２，３次免疫均同时注射ｐＶＡＸ空质
粒、ＩＬ—ｌ２质粒ＤＮＡ各３００ｔａｇ。
１．５攻击感染
６００只日本血吸虫阳性钉螺由江苏省血吸虫病
防治研究所提供。第３次免疫后２８ ｄ，每头牛经大腿
内侧皮肤感染日本血吸虫尾蚴１０００条。分３ ｄ按组
别顺序随机抽取水牛进行感染，每天感染１５头牛。
感染时，维持室温２０～２５℃，将水牛绑定于特制木板
上，大腿内侧皮肤刮毛，范围约１０ ｃｍ×１０ ｃｍ，去
氯水洗净，计时感染３０ ｍｉｎ。
１．６粪便毛蚴及虫卵检查
于解剖前２ｄ及当天，分别收集每牛粪便标本１次。
１．６．１毛蚴数计数方法
用定量孵化法检测虫卵和毛蚴。称取搅匀的
牛粪Ｓ０ ｇ，用１２０孔目、３００孑Ｌ目尼龙绢袋过筛，
５００ ｍＬ三角烧瓶孵化。孵化２，４，６，８，１０，１３，
ｌ６，ｌ９，２４ ｈ后分别观察并收集毛蚴，每次倒出含
毛蚴上层液至１０００ ｍＬ锥形量筒中，滴加２－３滴碘
液以杀死并染色毛蚴。量筒水满且毛蚴自然沉淀时，
用医院妇产科用吸宫器吸去上层水液。孵化并收集
完毕，将含毛蚴的沉淀移至５０ ｍＬ塑料刻度离心管
中，定容至Ｓ ｍＬ，混匀，取０．３ ｍＬ涂片３片，镜下
计数毛蚴。沉淀镜检毛蚴数（ＭＰＧ一１）＝３人计数的毛
蚴总数ｘ５／０．３／１５０；按组别收集上清液混合，计数毛
蚴数得上清液镜检毛蚴数（ＭＰＧ一２）。总ＭＰＧ＝ＭＰＧ一
１＋ＭＰＧ一２。
１．６．２粪便未孵化虫卵计数方法
将３次孵化完毕的粪渣按水牛编号以３００孔目
尼龙绢袋收集于５０ ｍＬ塑料刻度离心管中，加１０％
甲醛１５ ｍＬ混匀固定５ ｍｉｎ，加乙醚１０ ｍＬ，加水
至４０ ｍＬ，充分摇匀３ ｍｉｎ，静置３０ ａｒｉｎ，低速离心
（１０００ ｒ／ｍｉｎ）３ ａｒｉｎ。离心后弃去含甲醛、乙醚和粪渣
的上层，取沉淀加数滴卢戈氏液染色镜检，定量计
数未孵出的血吸虫卵。若沉淀粪渣过多可重复以上
步骤。粪便未孵化虫卵计数方法：３次粪检孵化后粪
渣按编号混合，称量混合粪渣重量后取５ ｇ稀释至４０
ｍＬ。镜检计数Ｓ ｍＬ中虫卵数（Ｅ），粪卵（ＥＰＧ）＝Ｅ×４０／
（５×混合粪渣重量）／（５＋１）／１５０。为减小测量误差，
取３次检查结果的平均值作为该研究对象（水牛）的
分析指标（粪卵数或毛蚴数），对３组的粪卯数和毛
蚴数进行假设检验（方差分析）后，如果有统计学意
义，按如下公式计算综合指标减粪卵率和减毛蚴率。
减粪卵率＝［（对照组平均每克粪便虫卵数一实验组
平均每克粪便虫卵数）／对照组平均每克粪便虫卵
数］×１００％。
１．７解剖和冲虫
于攻击感染后５６ ｄ解剖水牛和冲虫。计数每头
水牛所有收集的虫体数和雌虫数，通过所收集的虫
体数和雌虫数来计算其减虫率和减雌虫率，其计算
公式为：减虫率＝［（对照组平均检获虫数一实验组平
均检获虫数）／对照组平均检获虫数］×１００％；减雌
虫率＝［（对照组平均检获雌虫数一实验组平均检获雌
虫数）／对照组平均检获雌虫数１×１００％。
１．８肝组织虫卵检查
于每头牛肝脏左、右肝边缘相同部位取样各
约１０ ｇ，剪碎，用电子分析天平称取左、右肝组织各
５ ｇ，于４５ ｍＬ ｓ％ＫＯＨ中３７￣Ｃ摇动消化３ ｈ，离心将
沉渣定容至４ ｍＬ，取ｏ．４ ｍＬ涂片４片镜检计数虫卵
数。左肝粪卵数（ＬＥＰＧ）或右肝粪卵数（ＲＥＰＧ）＝镜
检虫卵数×４／０．４／５；总ＥＰＧ＝（ＬＥＰＧ＋ＲＥＰＧ）／２。
减肝卵率＝［（对照组平均每克肝脏虫卵数一实验组
平均每克肝脏虫卵数）／对照组平均每克肝脏虫卵
数］×１００％。
１．９统计学处理
用ＳＰＳＳ１７．０统计软件对数据进行统计分析，多
个均数的比较采用完全随机设计的方差分析，组间
均数的比较采用方差分析中两两比较的ＬＳＤ—ｔ法，
Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结 果
２．１ ３组检获雌虫数和成虫数的比较与减雌率和减
虫率的计算
３组检获雌虫数的比较，经方差分析有统计学意
义（Ｆ＝８６．８０７，Ｐ＜０．０Ｏｌ；表１）；经方差分析两两比较
日本血吸虫ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗与ＩＬ一１２对水牛保护性作用的研究胡平成，等
的ＬＳＤ—ｔ法，Ａ，Ｂ和Ｃ组检获雌虫数两两间差异均
有统计学意义（ＰＡＢ＜ｏ．００１，ＰＡｃ＜０．００１，ＰＢｃ＜０．００１）。
与Ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减雌率分别为４５．７０％和
２６．６ｌ％，Ａ组的减雌率高于Ｂ组。
３组检获成虫数的比较，经方差分析有统计学意
义（Ｆ＝９２．１８９，Ｐ＜Ｏ．００１；表１）；经方差分析两两比较
的ＬＳＤ—ｔ法，Ａ，Ｂ和Ｃ组检获雌虫数两两间差异均
有统计学意义（Ｐ Ｂ＜０．００１，ＰＡｃ＜０．００１，ＰＢｃ＜ｏ．００１）。
与Ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减虫率分别为４４．５ｌ％，
２５．８４％，Ａ组的减虫率高于Ｂ组。
表１ ３组水牛检获雌虫数和成虫数的比较（ｎ＝１５， ±ｓ）
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ ａｎｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ａｄｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ３ ｇｒｏｕｐｓ（ｎ＝１５， ±Ｓ）
２．２ ３组粪便虫卯数、毛蚴数的比较与减粪卵率和
减毛蚴率的计算
３组粪便虫卵数的比较，经方差分析有统计学
意义（Ｆ＝４２．５８３，Ｐ＜Ｏ．００１；表２）；经方差分析两
两比较的ＬＳＤ．ｔ法，Ａ，Ｂ和Ｃ组粪便虫卵数两两
间差异均有统计学意义（Ｐ ＜ｏ．００１，Ｐ ＜ｏ．００１，
ｐ ＜０．００１）。与ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减粪卵率分别
为４１．１０％，３１．６３％，Ａ组的减粪卵率高于Ｂ组。
３组粪便毛蚴数的比较，经方差分析有统计学
意义（Ｆ＝４５．８０６，Ｐ＜Ｏ．００１；表２）；经方差分析两
两比较的ＬＳＤ—ｔ法，Ａ，Ｂ和Ｃ组粪便毛蚴数两两
间差异均有统计学意义（ＰＡＢ＜０．００１，ＰＡｃ＜０．００１，
Ｐ ＜ｏ．００１）。与Ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减毛蚴率分别
为４８．１１％，３８．０７％，Ａ组的减毛蚴率高于Ｂ组。
表２ ３组水牛粪便虫卵数与毛蚴数的比较（ｎ＝１５， ±ｓ）
Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂｕｆｆａｌｏ ｄｕｎｇ ｅｇｇ ａｎｄ
ｍｉｒａｃｉｄｉａ ｉｎ ｔｈｅ ３ ｇｒｏｕｐｓ（ｎ＝１５， ±ｓ）
２．３ ３组肝脏虫卵数的比较与减肝卵率的计算
Ａ，Ｂ和ｃ组肝组织虫卵数分别为２４９．５３±
５９．２１，２９９．９３±５４．３４，４００．７７±９０．８３，经方差分
析差异有统计学意义（Ｆ＝３０．０５３，Ｐ＜０．００１），经方差
分析两两比较的ＬＳＤ—ｔ法，Ａ，Ｂ和ｃ组肝组织虫卵
两两问差异均有统计学意义（ｐ ＜０．００１，Ｐ ｃ＜０．００１，
Ｐ。 ＜０．ｏｏ１）。与ｃ组相比，Ａ，Ｂ组的减肝卵率分别
为４３．３９％，３１．９５％，Ａ组的减肝卵率高于Ｂ组。
３讨论
２０世纪８０年代中期，根据全球血吸虫病流行
情况及防治进展，ＷＨＯ提出控制血吸虫病的新策
略，以疾病控制代替以往的传播阻断作为防治目标。
防治措施的重点也从中间宿主控制（灭螺）为主转
移到健康教育与化疗为主ｆ２。 ”，吡喹酮是一种对人
体５种主要血吸虫病ｆ曼氏、埃及、湄公、间插与
日本血吸虫病）都非常有效的药物。全球已对１亿
多例血吸虫感染者及有疫水接触史的可能感染者用
吡喹酮进行了治疗，积累了极为丰富的经验［２２］ｏ然
而，已有证据 引表明：曼氏血吸虫对吡喹酮已产生
抗药株，埃及血吸虫病也出现了用吡喹酮难以治愈
的现象。尽管目前还未发现日本血吸虫对吡喹酮敏
感性下降的证据，但是仍需要密切观察日本血吸虫
对吡喹酮是否产生抗药性。事实证明以灭螺和吡喹
酮大规模化疗为主的防治对策并未根本解决血吸虫
病防治问题。
疫苗是控制传染性疾病的有效手段，２０世纪
初就有人设想研制血吸虫疫苗来预防和控制血吸虫
病。抗日本血吸虫ＤＮＡ疫苗的动物实验研究［２ 表
明：混和或多价疫苗是未来ＤＮＡ疫苗的发展方向。
２３ ｋＤ的表面膜分子是第一个从蠕虫的寄生虫中被
详细描述的分子。它是第４家族（ＴＭ４ＳＦ）成员，
是一个完整的膜蛋白质，由４个疏水跨膜结构域及
大小不同的胞外亲水结构域组成。这种２３ ｋＤ蛋白
存在于脊椎动物寄生虫的所有阶段，几乎所有的细
胞都具有这种蛋白。因此，这种蛋白是一个非常好
的疫苗靶标［２５－２７］。
血吸虫２３ ｋＤ膜蛋白存在于血吸虫尾蚴、童
虫、晚期童虫和成虫等各期的表膜上，单抗Ｍ２经
转移到实验小鼠，能产生一定的被动免疫保护作
用，重组Ｓｍ２３在小鼠中可以诱导产生４０％～５０％
的保护作用，表明血吸虫２３ ｋＤ膜蛋白为一潜在
的疫苗候选抗原［２８１０当ｒＳｊ２３与福氏佐剂乳化后
免疫注射绵羊证实其具有高度免疫原性，可获得
５１．２％～６６．１％的减虫率 。ｚｈｕ等 用ＳＪＣ２３
基因克隆人ｐｃＤＮＡ３．１中，构建成ＳＪＣ２３的质粒
ＤＮＡ，在Ｃ５７ＢＬ／６小鼠可诱导产生２６．９％的减虫率，
与ＩＬ一１２质粒ＤＮＡ一起免疫则可产生３５．４％的减虫
率，而且发现免疫鼠的ＩＬ一１２和ＩＦＮ 水平有明显
８５８ 中南大学学报（医学版），２０１２，３７（８）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｕｍｅｄ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｘ．ｘｙｓｍ．ｎｅｔ
升高，但ＩＬ＿４和ＩＬ一１０则无变化；表明Ｓｊ２３ＤＮＡ疫
苗可诱导产生明显的细胞免疫反应（Ｔｈ１）。Ｗｅｓｔｅｒｎ
印迹分析大部分实验鼠可产生抗体，表明ＳｊＣ２３ＤＮＡ
疫苗具有一定的保护作用，可能与ＳＪＣ２３可诱导Ｔ细
胞免疫有关，也可能还有体液免疫的参与。Ｚｈｕ等
用大动物猪作为实验动物，取得了比在小鼠中更好
的免疫保护作用，ＳＪＣ２３组可产生２９．２％的减虫率、
５０．８％的减雌率和４８．２％的减卵率，进一步表明
ＳＪＣ２３可诱导产生较好的保护作用。
本研究以水牛为研究对象，在血吸虫病非疫
区湖南省岳阳县筻口镇的一个天然优良的水牛养
殖基地，采用融合了Ｈｓｐ７０诱导子的日本血吸虫
２３ ｋＤ膜蛋白ＤＮＡ疫苗ｆＳｊＣ２３一Ｈｓｐ７０）与细胞因
子（ＩＬ一１２质粒ＤＮＡ）分子佐剂的联合免疫对水牛的
免疫保护作用进行了观察。与对照组相比，ＳＪＣ２３一
Ｈｓｐ７０＋ＩＬ一１２组和ＳｊＣ２３＋ＩＬ １２组的减雌率、减虫率、
减粪卵率、减毛蚴率及减肝卵率分别为４５．７０％和
２６．６１％，４４．５ｌ％和２５．８４％，４１．１０％和３１．６３％，
４８．１１％和３８．０７％及４３－３９％和３１．９５％，表明多
价ＳＪＣ２３一Ｈｓｐ７０ ＤＮＡ疫苗对水牛血吸虫病的保护
作用明显高于单价ＳＪＣ２３ ＤＮＡ疫苗；多价ＳＪＣ２３一
Ｈｓｐ７０＋ＩＬ一１２ ＤＮＡ疫苗对水牛血吸虫病可产生与
ＳｊＣ２３＋ＩＬ一１２ ＤＮＡ疫苗对猪的同样较为理想的保护作
用，提示ＳｊＣ２３ＤＮＡ疫苗是一种有发展前景的疫苗。
本研究严格按盲法实验设计进行，避免了主观
因素的干扰，取得了较好的保护性免疫效果，为研
究抗水牛血吸虫病ＤＮＡ疫苗提供了新的科学依据
与途径。因水牛个体大，操作有一定的难度，本结
果仅为初步试验，其现场应用价值仍有待进一步研
究证实。
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（本文编辑彭敏宁）