2024年2月24日发(作者：梁斐)

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠CD86和ICAM-1表达的影响

蔺晓源; 徐菲; 张嘉伦; 赵应松; 王敏; 刘杰民; 胡国恒

【期刊名称】《《湖南中医药大学学报》》

【年(卷),期】2019(039)011

【总页数】5页(P1321-1325)

【关键词】溃疡性结肠炎; 健脾益肠散; CD86分子; 细胞间黏附分子-1

【作 者】蔺晓源; 徐菲; 张嘉伦; 赵应松; 王敏; 刘杰民; 胡国恒

【作者单位】湖南中医药大学 湖南 长沙 410208; 湖南中医药大学第一附属医院

湖南 长沙 410007; 湖南中医药大学中医学国内一流建设学科 湖南 长沙 410208;

贵阳中医学院 贵州 贵阳 550002; 贵州省人民医院 贵州 贵阳 550002

【正文语种】中 文

【中图分类】R285.5; R656.9

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种反复发作的以腹痛、腹泻和便血等症状和体征为主要临床表现的特发性慢性炎症性肠病[1]。 UC 病因尚不清楚，研究认为其发病与遗传、环境、感染、微生物群失调和免疫应答等因素密切相关[2]。目前UC 的西医治疗药物常包括柳氮磺胺嘧啶等氨基水杨酸制剂，布地奈德等糖皮质激素、硫唑嘌呤等免疫抑制剂，英夫利昔等生物制剂及微生态制剂，临床多联合用药，虽有成效，但仍面临不良反应大、易复发等诸多问题。 健脾益肠散是基于

UC“本虚标实”的中医病机组方的董菲洛教授经验方，临床治疗UC 安全有效，并能明显改善患者机体的免疫功能[3]。为了进一步明确健脾益肠散治疗UC 的作用靶点，鉴于CD86 分子（CD86）和 细 胞 间 黏 附 分 子1(intercellular

adhesion molecule-1，ICAM-1)异常已被证实在UC 发病的免疫机制中起重要作用[4-5]。 因此，本研究观察健脾益肠散对UC 模型大鼠结肠组织CD86、ICAM-1 表达的影响，以深入探讨其对UC 结肠黏膜的免疫保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD 大鼠60 只，SPF 级，雄性，体质量180～220 g，由重庆腾鑫华阜实验动物销售有限公司提供， 许可证号：SCXK-（军）2012-0011。 饲养于SPF 级实验动物房，饲养温度21～25 ℃，湿度50%～70%，符合饲养环境标准要求。所有大鼠自由饮水、进食，每2 天更换一次垫料。

1.2 实验药物

健脾益肠散全方由太子参15 g，黄芪15 g，白术12 g，木香6 g，白豆蔻6 g，茯苓12 g，芡实12 g，败酱草30 g，补骨脂20 g，炙甘草6 g 组成。中药饮片均购自贵州省中医院门诊中药房，浓缩成生药含量分别为15、10、5 g/mL 的药液冰箱冷藏备用。西药柳氮磺吡啶肠溶片（上海福达制药有限公司，规格：0.25

g/片)，配制成浓度为22.1 mg/mL 的药液冷藏备用。

1.3 主要试剂与仪器

CD86、ICAM-1 兔抗多克隆抗体（abcam），PCR 引物合成（南京金斯瑞生物科技有限公司），引物序列：ICAM-1-F：CGGGATGGTGAAGTCTGT，ICAM-1-R：GGCGGTAATAGGTGTAAATG，产物片段长度200 bp；GAPDH-F：CAAGTTCAACGGCACAG，GAPDH-R：CCAGTAGACTCCACGACAT，产物片段长度138 bp。BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Bio-Swamp），蛋白质

Marker(Thermo)，逆转录试剂盒（TAKARA），PCR 试剂盒（KAPA

Biosystems），2，4，6-三 硝 基 苯 磺 酸(TNBS，Sigma)。 Z32HK 高速冷冻离心机（德国Hermle），RM2235 石蜡切片机（德国莱卡），MK3 酶标仪（芬兰雷勃），BX51 显微镜和图像分析系统（日本奥林巴斯），Mini Protean tetra

cell 蛋 白 印 记 系 统、T100 梯 度PCR 扩增仪、CheemiDoc XRS+Imager 化学发光系统（美国BIO-RAD），Realplex 2 荧光定量PCR 仪（德国Eppendorf）。

1.4 动物分组与模型复制

将60 只大鼠先按体质量用随机数字法分为2组，正常组(10 只)和造模组(50 只)。

造模组参考文献方法[6]将大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，然后肛内8 cm处注入TNBS 溶液制备UC 大鼠模型。 待模型复制成功后再将造模组随机分为5 组，分别为空白组、模型组、西药组和健脾益肠散3 个剂量组（简称中药高、中、低剂量组），每组10 只。

1.5 干预与标本取材

从造模第3 天起， 西药组给予0.3 g/kg 的柳氮磺吡啶肠溶片药液，中药高、中、低剂量组分别给予204、136、68 g/kg 的健脾益肠散药液，模型组给予蒸馏水。

灌胃体积量均为13.6 mL/kg，连续灌胃21 d。

空白组大鼠和各给药组大鼠在最后一次灌胃后禁食不禁水24 h，然后予以水合氯醛麻醉。 冰盒上剪取距离肛门10 cm 处的末端结肠，其中一小段用生理盐水漂洗后装入冻存管中放置在-80 ℃冰箱中保存供Western Blot 和RT-PCR 检测使用，另一小段放入多聚甲醛中供免疫组化检测使用。

1.6 指标检测

1.6.1 CD86 阳性表达的免疫组化法检测 每组随机取出结肠组织标本5 个，流水冲洗，不同浓度的乙醇逐级脱水， 置入纯乙醇和二甲苯的等体积混合液中透明，石蜡包埋切片，一抗（CD86 抗体，稀释比例1∶100）孵育，maxvision 二抗孵育，

DAB 显色，苏木素复染3 min，透明、封片。 使用400 倍镜选取阳性表达（以胞膜或胞浆内出现棕黄色颗粒染色为标志）不重复的5 个视野拍片，最后使用图像分析系统分析CD86 阳性染色的平均OD 值。

1.6.2 ICAM-1 蛋白表达的Western Blot 法检测 每组随机取出结肠组织标本5 个，按每20 mg 组织加入150～250 μL 裂解液提取蛋白，使用酶标法进行蛋白定量，

制备SDS-PAGE 胶 （下层分离胶选用12%的胶），每孔上样10 μg 蛋白，经电泳、湿转膜、5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗(ICAM-1 抗体，稀释比例1∶1 000) 室温孵育1 h、1∶10 000 稀释HRP 标记的二抗室温孵育1 h，显色后将膜置于化学发光系统中检测。

1.6.3 ICAM-1 mRNA 表达的RT- PCR 法检测 每组随机取出结肠组织标本3 个，根据Real-Time PCR 的操作方法进行组织总RNA 的提取、cDNA 第一条链的合成(总RNA 中DNA 的消除；总RNA 中DNase 1 的消除； 反转录：42 ℃，60

min；70 ℃，15 min；16 ℃，hold) 和PCR 扩增。 数据采用仪器自带软件qbase plus 分析每个样本待测基因相对于内参基因GAPDH 的相对表达量。

1.7 统计学处理

实验数据均采用SPSS 20.0 统计学软件进行分析。 计量资料以“±s”表示，多组间的比较满足正态性检验后，方差齐时采用单因素方差分析，两两比较采用LSD

法，方差不齐时采用Tamhane's T2 法。 不满足正态性分布的采用非参数检验。

P〈0.05 代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠结肠组织CD86 的阳性表达

与空白组比较，模型组CD86 的阳性表达显著增多(P〈0.01)；各给药组均可不同程度地降低CD86的阳性表达(P〈0.05 或P〈0.01)；且中药高剂量组优于其他给药组(P〈0.05 或P〈0.01)，中药低剂量组不及中药中剂量组和西药组（P

〈0.05），而中药中剂量组与西药组比较差异无统计学意义(P〉0.05)。 见表1、图1。

表1 各组大鼠结肠组织CD86 阳性表达OD 值、ICAM-1蛋白和mRNA 表达比较(±s)注：与空白组比较，##P〈0.01；与模型组比较，△P〈0.05，△△P〈0.01；与中药高剂量组比较，☆P〈0.05，☆☆P〈0.01，与中药低剂量组比较，★P〈0.05，★★P〈0.01；与西药组比较，▲P〈0.05，▲▲P〈0.01；*n=5,＊n=3组别空白组模型组西药组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组CD86*0.09±0.02

0.62±0.10##0.38±0.07△△☆★0.50±0.09△☆☆0.35±0.06△△☆★0.18±0.04△△ICAM-1 蛋白*0.19±0.02

1.08±0.09##0.62±0.05△△☆☆★★0.92±0.07△☆☆▲▲0.81±0.06△△☆☆▲0.40±0.04△△ICAM-1 mRNA＊1.00±0.08

1.29±0.12##1.14±0.11△☆1.18±0.13△☆1.10±0.10△△1.05±0.09△△

图1 各组结肠CD86 的阳性表达（DAB 染色，×400）

2.2 各组大鼠结肠组织ICAM-1 的蛋白表达

与空白组比较，模型组ICAM-1 蛋白表达明显增多（P〈0.01）；各给药组与模型组比较，ICAM-1 的蛋白表达均不同程度地减少（P〈0.05 或P〈0.01），且以中药高剂量组最为明显（P〈0.01），而中药中、低剂量组与西药组比较差异亦有统计学意义（P〈0.05）。见表1、图2。

图2 各组结肠ICAM-1 蛋白免疫印迹电泳图

2.3 各组大鼠结肠组织ICAM-1 mRNA 表达

模型组ICAM-1 mRNA 表达较空白组显著升高(P〈0.01)；各给药组ICAM-1 的mRNA 表达与模型组比较均不同程度地降低（P〈0.05 或P〈0.01），且中药高剂量组优于中药低剂量组和西药组(P〈0.05)，而中药中、低剂量组与西药组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。 见表1。

3 讨论

树突状细胞(dendritic cells，DC)是功能最强大的抗原提呈细胞，也是激发免疫应答的始动细胞。 DC参与UC 肠道黏膜免疫激活和免疫耐受，结肠黏膜DC 浸润的频率与UC 活动性炎症的严重性显著关联[7]。 成熟DC 高表达共刺激分子CD86

和黏附分子ICAM-1 等，可有效激活T 细胞免疫应答[8]。 而当特定的CD86、ICAM-1 等缺乏时，T 细胞活化受到抑制，进而导致外周免疫耐受产生。Scarpa

M 等[4]研究表明，CD86 的表达在UC 患者中明显存在，而健康受试者体内未检测到CD86，且CD86 的表达与疾病的持续时间呈负相关，其研究证实了CD86

在UC发病中的主要作用。 而早在Nakazawa A 等[9]探讨共刺激分子CD86 在人结肠上皮细胞中的表达及其在炎症结肠黏膜T 细胞活化中的作用时就发现，抗原提呈细胞可通过CD86 在炎症结肠黏膜中的表达促进T 细胞的活化。TNBS 诱导的UC 模型大鼠结肠黏膜ICAM-1 的阳性表达较正常大鼠明显增强[10]。 柳氮磺吡啶可降低老年UC 患者肠黏膜ICAM-1 的m RNA 表达，检测ICAM-1 水平可作为判断UC 疗效的指标[11]。 我们前期的研究也表明UC 模型大鼠血清ICAM-1 含量较正常大鼠显著升高，免疫组化结果则证实其在结肠中的阳性表达亦高于正常大鼠[12]。因此，CD86 和ICAM-1 在UC 发病的免疫应答机制中起重要作用。

UC 属中医学“泄泻”“肠癖”等范畴，其本在于脾气亏虚，其标在于气滞、湿热和血瘀。若饮食失摄，脾胃运化失司，则脾气虚弱，肠胃不固。 气虚无以御邪，邪留肠间，日久不化，终致气滞、湿热、血瘀复合而伤，溃肠化疡，日久则更易伤及先天肾元致使疾病缠绵不愈[13]。 王爱华教授也认为，UC 的根本病机为本虚标实，脾虚失运为其本，湿热、热毒为其标，日久夹瘀，脾肾双亏[14]。 因此，针对此本虚标实之证治宜扶正祛邪、标本兼治。 健脾益肠散方中黄芪补气固表、敛疮生肌、固肠御邪为君；太子参益气健脾，《中药志》言其：“治脾虚泄泻”；白

术健脾益气、燥湿利水，《药性论》言其：“主多年气痢，止下泄”；白豆蔻化湿行气；木香行气止痛、抗菌止泻，《日华子本草》言其：“止泻，治痢疾”；败酱草清热行瘀消痈，共为臣药。 补骨脂补肾止泻，《本草纲目》言其：“治肾泄，通命门”；芡实益肾补脾止泻；茯苓健脾渗湿，共为佐药。甘草补脾益气，缓急止痛，调和诸药为使。现代药理研究表明，黄芪中的黄芪多糖对非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均具有明显的促进作用[15]。 太子参多糖粗提物能升高CD3、CD4、CD4/CD8，具有增强辅助性T 细胞的作用，可增强免疫功能[16]。 此外，白术的免疫调节作用，茯苓、补骨脂的增强免疫、抗炎作用也得到证实[17-18]。

而甘草黄酮类成分是甘草用于腹部解痉、“缓急止痛”功效的主要活性成分[19]。

课题组在前期的实验研究中发现，健脾益肠散可能通过促进热休克蛋白70 的表达、降低CD40 分子的表达而起到对UC 大鼠结肠黏膜的免疫保护作用[20-21]。 本研究采用经典的TNBS/乙醇法复制UC 大鼠模型，结果显示，模型大鼠结肠CD86

的阳性表达以及ICAM-1 的蛋白和mRNA 表达均显著高于正常大鼠，说明UC 肠黏膜的免疫应答被有效激活。健脾益肠散高、中、低剂量均可不同程度地降低CD86和ICAM-1 的表达，且以健脾益肠散高剂量效果最为显著，也明显优于西药组。同时表明健脾益肠散治疗UC 的作用机制可能与下调CD86 的阳性表达，降低ICAM-1 的蛋白和mRNA 表达，进而通过调节机体免疫应答向免疫耐受方向发展而减轻免疫损伤有关。

参考文献

【相关文献】

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[2] 甄建华，黄光瑞.溃疡性结肠炎病因和发病机制的现代医学研究进展[J].世界华人消化杂志，2019，27（4）：245-251.

[3] 刘杰民，黄盛文，董菲洛.健脾益肠散合固本保元腹袋治疗溃疡性结肠炎的疗效及机制[J].吉林中医药，2011，31（1）：42-43.

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and CD86 and IFNgamma in the pathogenesis of ulcerative colitis[J]. Digestive Diseases

and Sciences, 2004, 49(11-12): 1738-1744.

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regulatory response of human intestinal dendritic cells exposed to Lactobacillus

extracellular encrypted peptide[J].PLoS One,2012,7(5):e36262.

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molecule CD86 on epithelial cells in the inflamed colonic mucosa[J]. Gastroenterology,

1999, 117(3):536-545.

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[13] 刘杰民，蔺晓源，王 敏，等.董菲洛教授诊治溃疡性结肠炎经验[J].长春中医药大学学报，2013，29(4)：617-618.

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[17] 张晓娟，左冬冬.白术化学成分及药理作用研究新进展[J].中医药信息，2018，35(6)：101-106.

[18] 刘 淼，吴玉冰.药食同源植物茯苓的研究现状与展望[J].湖南中医药大学学报，2018，38(12)：1476-1480.

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[21] 刘杰民，张 瑜，古 娟，等.健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠CD40 表达的影响[J].中医药信息，2018，35（5）：5-8.

2024年2月24日发(作者：梁斐)

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠CD86和ICAM-1表达的影响

蔺晓源; 徐菲; 张嘉伦; 赵应松; 王敏; 刘杰民; 胡国恒

【期刊名称】《《湖南中医药大学学报》》

【年(卷),期】2019(039)011

【总页数】5页(P1321-1325)

【关键词】溃疡性结肠炎; 健脾益肠散; CD86分子; 细胞间黏附分子-1

【作 者】蔺晓源; 徐菲; 张嘉伦; 赵应松; 王敏; 刘杰民; 胡国恒

【作者单位】湖南中医药大学 湖南 长沙 410208; 湖南中医药大学第一附属医院

湖南 长沙 410007; 湖南中医药大学中医学国内一流建设学科 湖南 长沙 410208;

贵阳中医学院 贵州 贵阳 550002; 贵州省人民医院 贵州 贵阳 550002

【正文语种】中 文

【中图分类】R285.5; R656.9

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种反复发作的以腹痛、腹泻和便血等症状和体征为主要临床表现的特发性慢性炎症性肠病[1]。 UC 病因尚不清楚，研究认为其发病与遗传、环境、感染、微生物群失调和免疫应答等因素密切相关[2]。目前UC 的西医治疗药物常包括柳氮磺胺嘧啶等氨基水杨酸制剂，布地奈德等糖皮质激素、硫唑嘌呤等免疫抑制剂，英夫利昔等生物制剂及微生态制剂，临床多联合用药，虽有成效，但仍面临不良反应大、易复发等诸多问题。 健脾益肠散是基于

UC“本虚标实”的中医病机组方的董菲洛教授经验方，临床治疗UC 安全有效，并能明显改善患者机体的免疫功能[3]。为了进一步明确健脾益肠散治疗UC 的作用靶点，鉴于CD86 分子（CD86）和 细 胞 间 黏 附 分 子1(intercellular

adhesion molecule-1，ICAM-1)异常已被证实在UC 发病的免疫机制中起重要作用[4-5]。 因此，本研究观察健脾益肠散对UC 模型大鼠结肠组织CD86、ICAM-1 表达的影响，以深入探讨其对UC 结肠黏膜的免疫保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD 大鼠60 只，SPF 级，雄性，体质量180～220 g，由重庆腾鑫华阜实验动物销售有限公司提供， 许可证号：SCXK-（军）2012-0011。 饲养于SPF 级实验动物房，饲养温度21～25 ℃，湿度50%～70%，符合饲养环境标准要求。所有大鼠自由饮水、进食，每2 天更换一次垫料。

1.2 实验药物

健脾益肠散全方由太子参15 g，黄芪15 g，白术12 g，木香6 g，白豆蔻6 g，茯苓12 g，芡实12 g，败酱草30 g，补骨脂20 g，炙甘草6 g 组成。中药饮片均购自贵州省中医院门诊中药房，浓缩成生药含量分别为15、10、5 g/mL 的药液冰箱冷藏备用。西药柳氮磺吡啶肠溶片（上海福达制药有限公司，规格：0.25

g/片)，配制成浓度为22.1 mg/mL 的药液冷藏备用。

1.3 主要试剂与仪器

CD86、ICAM-1 兔抗多克隆抗体（abcam），PCR 引物合成（南京金斯瑞生物科技有限公司），引物序列：ICAM-1-F：CGGGATGGTGAAGTCTGT，ICAM-1-R：GGCGGTAATAGGTGTAAATG，产物片段长度200 bp；GAPDH-F：CAAGTTCAACGGCACAG，GAPDH-R：CCAGTAGACTCCACGACAT，产物片段长度138 bp。BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Bio-Swamp），蛋白质

Marker(Thermo)，逆转录试剂盒（TAKARA），PCR 试剂盒（KAPA

Biosystems），2，4，6-三 硝 基 苯 磺 酸(TNBS，Sigma)。 Z32HK 高速冷冻离心机（德国Hermle），RM2235 石蜡切片机（德国莱卡），MK3 酶标仪（芬兰雷勃），BX51 显微镜和图像分析系统（日本奥林巴斯），Mini Protean tetra

cell 蛋 白 印 记 系 统、T100 梯 度PCR 扩增仪、CheemiDoc XRS+Imager 化学发光系统（美国BIO-RAD），Realplex 2 荧光定量PCR 仪（德国Eppendorf）。

1.4 动物分组与模型复制

将60 只大鼠先按体质量用随机数字法分为2组，正常组(10 只)和造模组(50 只)。

造模组参考文献方法[6]将大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，然后肛内8 cm处注入TNBS 溶液制备UC 大鼠模型。 待模型复制成功后再将造模组随机分为5 组，分别为空白组、模型组、西药组和健脾益肠散3 个剂量组（简称中药高、中、低剂量组），每组10 只。

1.5 干预与标本取材

从造模第3 天起， 西药组给予0.3 g/kg 的柳氮磺吡啶肠溶片药液，中药高、中、低剂量组分别给予204、136、68 g/kg 的健脾益肠散药液，模型组给予蒸馏水。

灌胃体积量均为13.6 mL/kg，连续灌胃21 d。

空白组大鼠和各给药组大鼠在最后一次灌胃后禁食不禁水24 h，然后予以水合氯醛麻醉。 冰盒上剪取距离肛门10 cm 处的末端结肠，其中一小段用生理盐水漂洗后装入冻存管中放置在-80 ℃冰箱中保存供Western Blot 和RT-PCR 检测使用，另一小段放入多聚甲醛中供免疫组化检测使用。

1.6 指标检测

1.6.1 CD86 阳性表达的免疫组化法检测 每组随机取出结肠组织标本5 个，流水冲洗，不同浓度的乙醇逐级脱水， 置入纯乙醇和二甲苯的等体积混合液中透明，石蜡包埋切片，一抗（CD86 抗体，稀释比例1∶100）孵育，maxvision 二抗孵育，

DAB 显色，苏木素复染3 min，透明、封片。 使用400 倍镜选取阳性表达（以胞膜或胞浆内出现棕黄色颗粒染色为标志）不重复的5 个视野拍片，最后使用图像分析系统分析CD86 阳性染色的平均OD 值。

1.6.2 ICAM-1 蛋白表达的Western Blot 法检测 每组随机取出结肠组织标本5 个，按每20 mg 组织加入150～250 μL 裂解液提取蛋白，使用酶标法进行蛋白定量，

制备SDS-PAGE 胶 （下层分离胶选用12%的胶），每孔上样10 μg 蛋白，经电泳、湿转膜、5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗(ICAM-1 抗体，稀释比例1∶1 000) 室温孵育1 h、1∶10 000 稀释HRP 标记的二抗室温孵育1 h，显色后将膜置于化学发光系统中检测。

1.6.3 ICAM-1 mRNA 表达的RT- PCR 法检测 每组随机取出结肠组织标本3 个，根据Real-Time PCR 的操作方法进行组织总RNA 的提取、cDNA 第一条链的合成(总RNA 中DNA 的消除；总RNA 中DNase 1 的消除； 反转录：42 ℃，60

min；70 ℃，15 min；16 ℃，hold) 和PCR 扩增。 数据采用仪器自带软件qbase plus 分析每个样本待测基因相对于内参基因GAPDH 的相对表达量。

1.7 统计学处理

实验数据均采用SPSS 20.0 统计学软件进行分析。 计量资料以“±s”表示，多组间的比较满足正态性检验后，方差齐时采用单因素方差分析，两两比较采用LSD

法，方差不齐时采用Tamhane's T2 法。 不满足正态性分布的采用非参数检验。

P〈0.05 代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠结肠组织CD86 的阳性表达

与空白组比较，模型组CD86 的阳性表达显著增多(P〈0.01)；各给药组均可不同程度地降低CD86的阳性表达(P〈0.05 或P〈0.01)；且中药高剂量组优于其他给药组(P〈0.05 或P〈0.01)，中药低剂量组不及中药中剂量组和西药组（P

〈0.05），而中药中剂量组与西药组比较差异无统计学意义(P〉0.05)。 见表1、图1。

表1 各组大鼠结肠组织CD86 阳性表达OD 值、ICAM-1蛋白和mRNA 表达比较(±s)注：与空白组比较，##P〈0.01；与模型组比较，△P〈0.05，△△P〈0.01；与中药高剂量组比较，☆P〈0.05，☆☆P〈0.01，与中药低剂量组比较，★P〈0.05，★★P〈0.01；与西药组比较，▲P〈0.05，▲▲P〈0.01；*n=5,＊n=3组别空白组模型组西药组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组CD86*0.09±0.02

0.62±0.10##0.38±0.07△△☆★0.50±0.09△☆☆0.35±0.06△△☆★0.18±0.04△△ICAM-1 蛋白*0.19±0.02

1.08±0.09##0.62±0.05△△☆☆★★0.92±0.07△☆☆▲▲0.81±0.06△△☆☆▲0.40±0.04△△ICAM-1 mRNA＊1.00±0.08

1.29±0.12##1.14±0.11△☆1.18±0.13△☆1.10±0.10△△1.05±0.09△△

图1 各组结肠CD86 的阳性表达（DAB 染色，×400）

2.2 各组大鼠结肠组织ICAM-1 的蛋白表达

与空白组比较，模型组ICAM-1 蛋白表达明显增多（P〈0.01）；各给药组与模型组比较，ICAM-1 的蛋白表达均不同程度地减少（P〈0.05 或P〈0.01），且以中药高剂量组最为明显（P〈0.01），而中药中、低剂量组与西药组比较差异亦有统计学意义（P〈0.05）。见表1、图2。

图2 各组结肠ICAM-1 蛋白免疫印迹电泳图

2.3 各组大鼠结肠组织ICAM-1 mRNA 表达

模型组ICAM-1 mRNA 表达较空白组显著升高(P〈0.01)；各给药组ICAM-1 的mRNA 表达与模型组比较均不同程度地降低（P〈0.05 或P〈0.01），且中药高剂量组优于中药低剂量组和西药组(P〈0.05)，而中药中、低剂量组与西药组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。 见表1。

3 讨论

树突状细胞(dendritic cells，DC)是功能最强大的抗原提呈细胞，也是激发免疫应答的始动细胞。 DC参与UC 肠道黏膜免疫激活和免疫耐受，结肠黏膜DC 浸润的频率与UC 活动性炎症的严重性显著关联[7]。 成熟DC 高表达共刺激分子CD86

和黏附分子ICAM-1 等，可有效激活T 细胞免疫应答[8]。 而当特定的CD86、ICAM-1 等缺乏时，T 细胞活化受到抑制，进而导致外周免疫耐受产生。Scarpa

M 等[4]研究表明，CD86 的表达在UC 患者中明显存在，而健康受试者体内未检测到CD86，且CD86 的表达与疾病的持续时间呈负相关，其研究证实了CD86

在UC发病中的主要作用。 而早在Nakazawa A 等[9]探讨共刺激分子CD86 在人结肠上皮细胞中的表达及其在炎症结肠黏膜T 细胞活化中的作用时就发现，抗原提呈细胞可通过CD86 在炎症结肠黏膜中的表达促进T 细胞的活化。TNBS 诱导的UC 模型大鼠结肠黏膜ICAM-1 的阳性表达较正常大鼠明显增强[10]。 柳氮磺吡啶可降低老年UC 患者肠黏膜ICAM-1 的m RNA 表达，检测ICAM-1 水平可作为判断UC 疗效的指标[11]。 我们前期的研究也表明UC 模型大鼠血清ICAM-1 含量较正常大鼠显著升高，免疫组化结果则证实其在结肠中的阳性表达亦高于正常大鼠[12]。因此，CD86 和ICAM-1 在UC 发病的免疫应答机制中起重要作用。

UC 属中医学“泄泻”“肠癖”等范畴，其本在于脾气亏虚，其标在于气滞、湿热和血瘀。若饮食失摄，脾胃运化失司，则脾气虚弱，肠胃不固。 气虚无以御邪，邪留肠间，日久不化，终致气滞、湿热、血瘀复合而伤，溃肠化疡，日久则更易伤及先天肾元致使疾病缠绵不愈[13]。 王爱华教授也认为，UC 的根本病机为本虚标实，脾虚失运为其本，湿热、热毒为其标，日久夹瘀，脾肾双亏[14]。 因此，针对此本虚标实之证治宜扶正祛邪、标本兼治。 健脾益肠散方中黄芪补气固表、敛疮生肌、固肠御邪为君；太子参益气健脾，《中药志》言其：“治脾虚泄泻”；白

术健脾益气、燥湿利水，《药性论》言其：“主多年气痢，止下泄”；白豆蔻化湿行气；木香行气止痛、抗菌止泻，《日华子本草》言其：“止泻，治痢疾”；败酱草清热行瘀消痈，共为臣药。 补骨脂补肾止泻，《本草纲目》言其：“治肾泄，通命门”；芡实益肾补脾止泻；茯苓健脾渗湿，共为佐药。甘草补脾益气，缓急止痛，调和诸药为使。现代药理研究表明，黄芪中的黄芪多糖对非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均具有明显的促进作用[15]。 太子参多糖粗提物能升高CD3、CD4、CD4/CD8，具有增强辅助性T 细胞的作用，可增强免疫功能[16]。 此外，白术的免疫调节作用，茯苓、补骨脂的增强免疫、抗炎作用也得到证实[17-18]。

而甘草黄酮类成分是甘草用于腹部解痉、“缓急止痛”功效的主要活性成分[19]。

课题组在前期的实验研究中发现，健脾益肠散可能通过促进热休克蛋白70 的表达、降低CD40 分子的表达而起到对UC 大鼠结肠黏膜的免疫保护作用[20-21]。 本研究采用经典的TNBS/乙醇法复制UC 大鼠模型，结果显示，模型大鼠结肠CD86

的阳性表达以及ICAM-1 的蛋白和mRNA 表达均显著高于正常大鼠，说明UC 肠黏膜的免疫应答被有效激活。健脾益肠散高、中、低剂量均可不同程度地降低CD86和ICAM-1 的表达，且以健脾益肠散高剂量效果最为显著，也明显优于西药组。同时表明健脾益肠散治疗UC 的作用机制可能与下调CD86 的阳性表达，降低ICAM-1 的蛋白和mRNA 表达，进而通过调节机体免疫应答向免疫耐受方向发展而减轻免疫损伤有关。

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