2024年2月17日发(作者：卜痴旋)

12湖北科技学傥学报(医学版)2021

年第35卷第

1

期[Journal

of

Hubei

University

of

Science

and

Technology

(Medical

Sciences)]IncRNA

DSCR8在胃癌中的研究吴现磊

(濮阳市油田总医院消化内科，河南濮阳457001)摘要：目的探讨DSCR8在影响胃癌进程中的分子机制。方法IncBase数据库和Targetscan预测了

DSCR8

和miR-107之间的关系，并通过双荧光素酶和RIP实验验证了这一关系。FISH检测DSCR8在胃癌细胞中的

定位。通过qRT-PCR检测胃癌细胞中DSCR8和miR-107的表达水平,CCK-8、克隆形成、Transwell实验检测胃

癌细胞的增殖、迁移和侵袭。结果DSCR8在胃癌组织和细胞中上调，并定位在细胞质中。DSCR8低表达会抑

制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外,DSCR8能够海绵吸附miR-107对胃癌细胞的发生发展产生影响。同

时,miR-107表达下调会逆转DSCR8低表达对胃癌细胞发展的抑制作用。结论DSCR8作为ceRNA发挥作用，

它通过吸附miR-107在胃癌的发展中发挥作用。关键词：胃癌；DSCR8

；

miR-107;增殖;迁移；侵袭中图分类号:R735.2

文献标识码:A文章编号：2095-4646 (2021)01

-0012-04

DOI：

10.16751/j.

cnki.

20954646.2021.01.0012开放科学(资源服务)标识码(OSID):LncRNA

DSCR8

Promotes

the

Proliferation,

Migration

and

Invasion

of

Gastric

Cancer

Cells

via

Adsorbing

MiR-107

WU

Xian-Lei(Department

of

Gastroenterology,

Puyang

Oilfield

General

Hospital,

Puyang

Henan

457001,

China

)ABSTRACT:

Objective

To

explore

the molecular

mechanism

of

DSCR8

in

the

process

of

gastriccancer.

Methods

The

relationship

between

DSCR8

and

miR-107was

predictedby

IncBase

database

and

Targetscan,

and

verified

through

dual

luciferase

experiments

and

RIP

experiments.

FISH

detects

the

localization

of

DSCR8

in

gastric

cancer

cells.

The

expression

levels

of

DSCR8

and

miR-107

in

gastric

cancer

cells

were

detected

by

qRT-

PCR

,and

the

proliferation,

migration

and

invasion

of

gastric

cancer

cells

were

detected

by

CCK-8,

clone

forma­tion

,and

Transwell

experiments.

Results

DSCR8

is

up-regulated

in

gastric

cancer

tissues

and

cells,

and

local­ized

in

the

cytoplasm.

The

low

expression

of

DSCR8

can

inhibit

the

proliferation,

migration

and

invasion

of

gas­tric

cancer

cells.

In

addition,

DSCR8

can

sponge

miR-107

to

affect

the

occurrence

and

development

of

gastric

cancer

cells.

At

the

same

time,

down-regulation

of

miR-107

expression

will

reverse

the

inhibitory

effect

of

low

expression

of

DSCR8

on

the

development

of

gastric

cancer

cells.

Conclusion

DSCR8

acts

as

a

ceRNA,

which

plays

a

carcinogenic

effect

in

the

development

of

gastric

cancer

by

adsorbing

miR-107.

In

general,our

research

clarified

the mechanism

of

DSCR8

in

regulating

the

development

of

gastric

cancer,

and

provided

new

ideas

for

the

diagnosis

and

treatment

of

gastric

cancer

guided

by

WORDS:

Gastric

cancer

；

DSCR8

；

MiR-107

；

Proliferation

；

Migration

；

Invasion胃癌(gastric

cancer,

GC)是全球第五大最常

见的癌症和第三大癌症死亡原因,2018年新增病

例超过100万,死亡人数约为78.

3万人(相当于

全球死亡人数中每12人就有1人死于GC)⑴。

GC通常在晚期才被诊断出来，此时一般已经发生

价值，其中长链非编码RNA(long

noncodingRNA,

IncRNA)似乎是诊断GC最有前途的工具之一⑶°

研究表明⑷,IncRNA在癌症发展中起关键作用，

作为促癌基因或抑癌基因参与了癌症发展中细胞

增殖、迁移、侵袭和凋亡等各种生物学过程。例

如,ARHGAP5-AS1是在耐化学性GC细胞中上调

的IncRNA,其高表达与GC患者预后差有关⑸；过

表达IncRNA

HOXA11-AS在体内促进了

GC细胞

癌细胞远处转移,患者预后较差,而姑息化疗是主

要的治疗手段力。在过去的几年中，研究GC的分子生物学取

得了重要进展,GC相关的小分子被证明具有预后

的增殖、细胞周期进展和转移，提示其在GC的发生

妣科技学傥学报(医学版)2021

年第35

卷第

1

期[Journal

of

Hubei

University

of

Science

and

Technology

(Medical

Sciences)]13和进展中具有致癌特性⑹。尽管已经报道了参与

GC发生和发展的几种hicRNA,但是大多数IncRNA

在GC中生物学功能和潜在机制仍有待阐明。最近，研究⑺发现DSCR8在癌症中异常表达

并起到促癌基因的作用。据报道⑻,DSCR8是肝

细胞癌的致癌基因，通过充当miR485-5p海绵来

激活Wnt/p-catenin通路，从而调节肝细胞癌的细

胞生长和细胞周期;You等⑺研究发现在卵巢癌

细胞中，YY1诱导的DSCR8通过浸润miR-3192-

5p上调YY1,促进细胞增殖、迁移、侵袭，抑制细

胞凋亡。这表明DSCR8可能是癌症诊断和治疗

的潜在生物标志物和靶标，然而关于DSCR8在

GC中的调控机制仍知之甚少。在本研究中，我们研究了

DSCR8在调节GC

细胞恶性表型中的生物学作用以及可能的分子机

制，通过生信分析和细胞实验证实DSCR8与miR-

107之间的调控关系。我们的研究有助于更好地

了解DSCR8的致癌作用，为GC的诊断和治疗提

供潜在的靶点。1材料与方法1.1

细胞来源本研究中使用的细胞系信息见表1。人正常

胃黏膜细胞GES-1和GC细胞系HGC-27、NCI-

N87、KATO

-1均培养在补充有10%

FBS

的

RPMI-1640

(

GIBCO,货号

31800022,添加

NaHCO31.5g/L,

glucose

2.

5g/L,

sodium

pyruvate

0.11g/L)中，并置于37弋，含5%

C02的条件下培养。表1实验所用细胞系魏糸ws费号产地GES-1人正常詡BrtITDU964HGC-27GCttTCHu22上海，申国NCI-N87GCttTCHul30上海，申国KATODIGCttTCHu229上海，申国SNU-1GCttTCHu230上海，申国1.2质粒构建和细胞转染DSCR8的shRNA及相应的阴性对照由Sen­gong

Biotech(中国上海)合成，miR-107

inhibitor/

mimic及各自的阴性对照购自Gene

Pharma(中国

苏州)。根据制造商的说明书，用Lipofectamine

2000(

Invitrogen,

Carlsbad,

CA,

USA)进行所有转

染。转染48h后，收集细胞。1.3

qRT-PCR使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞中分离总RNA。通过

Nanodrop

ND-2000

分光光度计(Ther-

mo

Scientific™，美国)评估RNA的数量和质量。

为了评估DSCR8的表达分析，使用RevertAid

First

Strand

cDNA

Synthesis

Kit

(

Thermo

Scientific™

,美

国)将2憾总RNA反转录为cDNA。对于miR-

107

的表达分析，使用miDETECT

A

Track™

qRT-

PCR

试剂盒(广州日博生物有限公司冲国)将2憾

总RNA反转录为cDNA。使用SYBR

Green

PCR试

剂盒(Takara

Bio,

Otsu,

Japan

)在

StepOne

实时

PCR

系统(Thermo

Fisher

Scientific

)上进行

qRT-PCR。

2-

at方法用于计算通过GAPDH和U6标准化的相

对基因表达。弓I物序列在表2中列出。表2

qRT-PCR的引物序列geneForwward(5,-3,)Reverse(5'

-3')DSCR8CGTCTOCCACTCGHTCTTGGGTCCAGGCTCCTTCGAPDHCCCATCACCATCTTCCAGGAGCTTCTCCATGGTGGTGAAGACGmiR-107TGTGTAGTAGTITGTrrATAGTGCCAACTCTACAACTACTAAATCU6CTCGCITCGGCAGCACAAACGCTTCACGAAHTGCGT1.4

荧光原位杂交(FISH)使用Ribobio合成的FISH探针进行FISH,并

根据制造商的说明使用FISH试剂盒(RiboBio

Co.,中国广州)进行操作。将盖玻片上的细胞用

PBS洗涤并在室温下用4%多聚甲醛固定lOmin,

然后在4弋下用含0.5%

Triton

X-100的磷酸盐缓

冲盐水(PBS)渗透细胞5min。在添加探针之前，

将细胞在杂交混合物中预杂交30mino与DSCR8-

Fish

Probe

Mix在37弋下孵育过夜后，细胞用4

X

含0.

l%Tween-20

的柠檬酸钠(SSC)

,2xSSC

和

1

X

SSC

于

42弋洗涤

5min,用

4Z

jb-diamidino-Z-phe-

nylindole

(

DAPI

)染色10mino最后通过荧光显微

镜观察图像。1.5

CCK-8

分析使用

Cell

Counting

Kit-8

试剂盒(Beyotime,中

国上海)检测细胞增殖。将细胞以5

x

103个细

胞/孔的细胞浓度接种到96孔板中。细胞分别孵

育0、24、48、72、96h后，向每个孔中加入lO^L

CCK-8溶液，并在37弋下再培养2ho用酶标仪测

量每个孔在

450nm

(

Bio-Rad,

Hercules,

CA,

USA

)

波长处的吸光度。1.6克隆形成实验转染后48h,将细胞(每孔1

X103)接种到6

孔板中，并用完全培养基培养2周直到明显的克

隆形成。细胞集落用4%多聚甲醛固定30min,并

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of

Hubei

University

of

Science

and

Technology

(Medical

Sciences)]在室温下用0.5%结晶紫染色30mino用无菌水

清洗每个孔,去除残留的结晶紫。将细胞数超过

50个的定义为克隆,计算每孔的克隆数。1.7

细胞迁移和侵袭实验使用

Transwell

inserts

（

8（jiM

pore

size,

Costar,

Cambridge,MA,USA）进行迁移和侵袭测定。将细

胞接种到没有或预先涂有基质胶（BD,

Franklin

Lakes,USA）的顶室中分别进行迁移或侵袭分析,

将600mL含10%

FBS的培养基置于下腔室中。

在37弋、5%C（）2的条件下孵育24h后，用棉签擦

拭上室中未迁移或侵袭的细胞,并用甲醇固定迁

移或侵袭的细胞，用0.5%结晶紫染色并用PBS

洗涤。然后在显微镜下以200

x的放大倍数计数。

1.8双荧光素酶实验从人基因组DNA中扩增了

DSCR8的3-UTR

序列。然后将这些序列分别亚克隆到PGL3荧光

素酶报告载体（Promega,

Madison,

WI,USA

）中。

潜在的miR-107结合位点通过Quick-change定点

诱变试剂盒（Agilent

Technologies,

Santa

Clara, CA,

USA）突变。将

DSCR8

模拟物的

wt（mut）3-UTR

共转染到GC细胞中。转染48h后，通过Dual-Lu-

cy

Assay

Kit

（

Progema,

Madison,

WI,

USA

）测量萤

火虫和海肾荧光素酶的活性荧光素酶活性。1.9

RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）使用

Magna

RIP

kit

（

Millipore, Billerica,

USA

）

进行RIP检测。用DSCR8和miR-107转染细胞，

并将其重悬于裂解缓冲液中。将lOO^L全细胞提

取物与

Ago2

抗体（Abeam, Cambridge,

UK

）或

IgG

（Abeam,

Cambridge,

UK）缀合的

Protein

G

琼脂糖

微珠在4弋孵育过夜。在室温下用DNA酶I和蛋

白酶K处理免疫沉淀物20

mino回收共沉淀的

RNA,并进行qRT-PCR分析。1.10统计学方法使用

SPSS22.

0

和

GraphPad

Prism

8. 0

Soft­ware

进行统计分析。所有测量数据均以（无土

s

）表

示,两组间比较为Z检验。P<0.05表示差异具有

统计学意义。2结果2.1

DSCR8在GC组织的表达通过

starBase

数据库（starbase.

sysu.

edu.

cn/），我们发现DSCR8在GC组织中为高表

达（图1A,封二）。进一步利用qRT-PCR检测

DSCR8在GC细胞中的表达，结果显示，与GES-1

纟田胞木目比，DSCR8在GC纟田胞系

IH、NCI-N87和SNU-1中的表达显著上调（图1B,

封二）。接下来，我们选择HGC-27细胞和NCI-

N87细胞进行实验。由于IncRNA的亚细胞定位

与其生物学功能和潜在的分子机制密切相关⑼。

因此，我们通过RNA-FISH检测DSCR8的亚细胞

定位。结果表明，大多数阳性细胞主要定位于细

胞质中，少数分布在细胞核中（图1C,封二）。2.2

敲低DSCR8抑制GC细胞的增殖、迁

移和侵袭为了评估DSCR8在GC中的生物学作用，我

们通过将sh-DSCR8转染到HGC-27细胞和NCI-

N87细胞中抑制DSCR8的表达（图2A,封二）。

通过CCK-8和克隆形成实验验证细胞的增殖变

化,结果表明敲低DSCR8能抑制细胞的增殖和集

落形成（图2B、2C,封二）。接着，我们通过Tran-

swell

检测DSCR8的抑制对细胞的迁移和侵袭的

影响，结果发现,DSCR8敲低后的细胞的迁移和侵

袭能力显著降低（图2D,封二）。因此，敲低

DSCR8抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭。2.

3

DSCR8充当miR-107的分子海绵为了进一步验证DSCR8在GC中的调控机

制，我们通过NCBI查询DSCR8和miR-107的核

昔酸序列,然后在DNAMAN软件上进行结合位点

分析，发现DSCR8和miR-107具有互补的结合位

点（图3A,封二）。为了证实DSCR8充当了

miR-

107

的分子海绵，我们首先将sh-DSCR8转染到

HGC-27和NCI-N87细胞中，检查miR-107水平是

否受sh-DSCR8影响。qRT-PCR结果显示，转染

sh-DSCR8后,miR-107的表达显著上调（图3B,封

二）O构建了

DSCR8-Wt和DSCR8-mut报告载体

并进行双荧光素酶实验，结果发现DSCR8-wt的荧

光素酶活性显著下调，含有DSCR8-mut载体的细

胞其萤光素酶活性则未受影响（图3C,封二）。

RIP实验显示，使用Ago2抗体进行免疫沉淀后,

miR-107

和

DSCR8

在

HGC-27

和

NCI-N87

细胞中

富集（图3D,封二），表明miR-107和DSCR8存在

结合关系。因此，在GC中DSCR8与miR-107之

间存在直接相互作用。2.

4

miR-107逆转DSCR8对GC细胞增殖、迁移和侵袭产生的影响为了研究DSCR8是否通过miR-107依赖性

方式调节GC细胞的恶性表型，我们将sh-NC

+

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1

期[Journal

of

Hubei

University

of

Science

and

Technology

(Medical

Sciences)]15NC

inhibitorAsh-DSCR8

+

NC

inhibitor,sh-DSCR8

+

miR-107

inhibitor分别转染到HGC-27细胞和

NCI-N87细胞中，并评估了细胞的增殖、迁移和侵

袭。我们发现DSCR8的敲低能抑制HGC-27和

NCI-N87细胞的增殖、迁移和侵袭，而miR-107

in­hibitor

的转染可以逆转sh-DSCR8对HGC-27和

NCI-N87细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用（图4A

~

4D,封三）。因此，抑制miR-107逆转了敲低

DSCR8对GC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。3讨论IncRNA是近年来出现的最大且具有显著多样

性的RNA家族之一何。随着人类转录组测序的发

展，已鉴定出一些与GC发展相关的IncRNA,例如

IncRNA

MEG3［11］

A

IncRNA

AK023391［9

IncRNA

HOXC-AS3［⑵等。除了特征明确的IncRNA,在控

制GC进程中潜在的IncRNA及其相关调节机制仍

然值得研究。在本研究中，我们基于基因表达谱分

析鉴定出在GC中被上调的DSCR8,并通过qRT-

PCR、CCK8、克隆形成和Transwell等一系列的细胞

实验研究DSCR8表达量下调对GC细胞生物学功

能产生的影响。我们发现DSCR8表达量的下调会

对GC细胞的增殖、迁移和侵袭能力产生抑制作用,

这与其在子宫癌［⑶、黑素瘤［⑷和肝癌⑻的功能一

致。在这些癌症中,DSCR8可能是潜在的预后指标

和治疗靶点。总之,DSCR8在GC细胞中发挥了促

癌基因的作用。IncRNA在生物学上的作用和功能目前大部分

尚不清楚。它们在microRNAs

±的海绵功能最近

几年被发现后受到广泛研究。miRNAs是一类非编

码RNA,通过作用于mRNA来调控细胞，在蛋白编

码基因的转录后调控中发挥核心作用。IncRNA可

以作为miRNA海绵，降低其对mRNA的调控作

用［⑸。由于DSCR8很可能作为ceRNAs发挥作

用，因此，在本研究中，我们进行了生物信息学分析、

双荧光素酶实验以及RIP分析,确定了

DSCR8与在

GC中显著低表达的miR-107存在靶向结合位点,

DSCR8是miR-107的分子海绵。已有研究表明⑻，

DSCR8

能够靶向

miR485-5p/Wnt/catenin

轴调控肝

癌进程。同时，我们也在GC细胞中通过CCK8、克隆

形成、Transwell等实验验证了低表达miR-107对

DSCR8所发挥功能的抑制作用。因此，我们认为

DSCR8海绵吸附miR-107促进了

GC的发展。总之，我们确定DSCR8在GC中作为一种癌基

因在中起重要作用。我们的研究首次证实了

DSCR8通过吸附miR-107促进GC的发展。该调控

网络可能为阐明GC的肿瘤发生提供线索，并可能

为开发GC的新型诊断和治疗方法提供理论依据。参考文献：[1]

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100@i

mwuOWftMlsi

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x4oo）（接第14页）BDSCR8Merg.4aA：

D$CR酗表迦|U,馳箱秫表示iE常屛，业需秫表秫解本；B： qRT-PCRM!D$CR8在人瑞胃觥魏利GC觥糸朋表也C:皿$臓黠魏系申D$CR8緘他仰〈0.05；

»p<0.01）*El

D$CR8在黠繩和魏中上调，并定竝觥质中1.5-]

sh-NC

sh-

DSCR8NCI-N87sh-NC

-•-

sh-DSCR8|fHGC-27

1.0-gNC1-NS7■h-NC

®t»-DSCR80.5-0.0D

HGC-27NCI-N87Sh-NC

HGC-27»h-DSCR8*h-MC

»h-DSCR8NCI-Na7墨

A：

qRT-PCR胡隸sh-DSCR8后GC瞬中D$CR8附表JU平；B：

CCK-8號湖鱗敝』SCR8后GC魏的觀飙;C：克辭减翹號鱗sh-D$CR8

mumAH-,

D：

TmnsweT】號湖解潮h-D$CR8£GC细躺时械翹力仰〈0.闿A：

IncBdse教耕中预測曲DSCR8和miR-107的乳向结合序列；B：转變sh-DSCR8后HGC-27细胞和NCI-N87毓申miR-107的表达水平；C：双英光素酶实验

測定監证HGC-27细胞和NCI-N87细胞tmiR-107和DSCR8之间的现向结合关系；D：通过RIP检測miR-107和DSCR8在Ago2免赛汎淀申曲富集（*p〈0.05；

**p〈0.01）

B3

DSCR8tSmiR-107W子赭uosowquJnNB2啟低皿删制GC魏的黠、辻齡驟，OOtAAUGCUGCU2UACGACGAI

I

I

I

I

I

I

I

IBzw&julouolsssdxeOAjFs

一

DNCI-N87

sh-OSCR8+NC inhibitorNCI-N87■h-NC*NC

inhibitor

sh-DSCR8+NC

inhibitor

sh-DSCR8+

mkR-107

Inhibitorsh-NC*NC

inhibitor・h-D8CR8+NC

Inhibitor

sh-DSCR84-

miR-107

inhibitor■・2N6ZC

Inhibitor■・b>DSCR8-»NC

inhlbitor■

sb-DSCR8«

miR-107

inhlbltor■h-«iC«-NC

inttibHor

NC**h-OSCR8 Inhibitor

*sh-OSCR8

miR-107

inhibitorHGC-27NCI-N87A： B：

C：

T帥swell迁移蝇酬禰斜就佛動;D：

Transwellft*蜩刊祁帥觥縣敝仰〈0.05）S4抑術R-107辫/D$CR8时GC虢騒、辻務械制黠（接第22页）S1给觀触卿（左）驟鹤（右）免删傾达CD3飆（CD3主翳迟珂龜,X100）噩當劳缺（左）驟黔（右）:U酬隸CD56飙（CD56主肺记恼船X100）S3券直號蒯紅左）驟财（方）緘卿隸CD21常员他21主殊记DC魁,X100）

（接第60页）S3瘠理驟（旺X40）

2024年2月17日发(作者：卜痴旋)

12湖北科技学傥学报(医学版)2021

年第35卷第

1

期[Journal

of

Hubei

University

of

Science

and

Technology

(Medical

Sciences)]IncRNA

DSCR8在胃癌中的研究吴现磊

(濮阳市油田总医院消化内科，河南濮阳457001)摘要：目的探讨DSCR8在影响胃癌进程中的分子机制。方法IncBase数据库和Targetscan预测了

DSCR8

和miR-107之间的关系，并通过双荧光素酶和RIP实验验证了这一关系。FISH检测DSCR8在胃癌细胞中的

定位。通过qRT-PCR检测胃癌细胞中DSCR8和miR-107的表达水平,CCK-8、克隆形成、Transwell实验检测胃

癌细胞的增殖、迁移和侵袭。结果DSCR8在胃癌组织和细胞中上调，并定位在细胞质中。DSCR8低表达会抑

制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外,DSCR8能够海绵吸附miR-107对胃癌细胞的发生发展产生影响。同

时,miR-107表达下调会逆转DSCR8低表达对胃癌细胞发展的抑制作用。结论DSCR8作为ceRNA发挥作用，

它通过吸附miR-107在胃癌的发展中发挥作用。关键词：胃癌；DSCR8

；

miR-107;增殖;迁移；侵袭中图分类号:R735.2

文献标识码:A文章编号：2095-4646 (2021)01

-0012-04

DOI：

10.16751/j.

cnki.

20954646.2021.01.0012开放科学(资源服务)标识码(OSID):LncRNA

DSCR8

Promotes

the

Proliferation,

Migration

and

Invasion

of

Gastric

Cancer

Cells

via

Adsorbing

MiR-107

WU

Xian-Lei(Department

of

Gastroenterology,

Puyang

Oilfield

General

Hospital,

Puyang

Henan

457001,

China

)ABSTRACT:

Objective

To

explore

the molecular

mechanism

of

DSCR8

in

the

process

of

gastriccancer.

Methods

The

relationship

between

DSCR8

and

miR-107was

predictedby

IncBase

database

and

Targetscan,

and

verified

through

dual

luciferase

experiments

and

RIP

experiments.

FISH

detects

the

localization

of

DSCR8

in

gastric

cancer

cells.

The

expression

levels

of

DSCR8

and

miR-107

in

gastric

cancer

cells

were

detected

by

qRT-

PCR

,and

the

proliferation,

migration

and

invasion

of

gastric

cancer

cells

were

detected

by

CCK-8,

clone

forma­tion

,and

Transwell

experiments.

Results

DSCR8

is

up-regulated

in

gastric

cancer

tissues

and

cells,

and

local­ized

in

the

cytoplasm.

The

low

expression

of

DSCR8

can

inhibit

the

proliferation,

migration

and

invasion

of

gas­tric

cancer

cells.

In

addition,

DSCR8

can

sponge

miR-107

to

affect

the

occurrence

and

development

of

gastric

cancer

cells.

At

the

same

time,

down-regulation

of

miR-107

expression

will

reverse

the

inhibitory

effect

of

low

expression

of

DSCR8

on

the

development

of

gastric

cancer

cells.

Conclusion

DSCR8

acts

as

a

ceRNA,

which

plays

a

carcinogenic

effect

in

the

development

of

gastric

cancer

by

adsorbing

miR-107.

In

general,our

research

clarified

the mechanism

of

DSCR8

in

regulating

the

development

of

gastric

cancer,

and

provided

new

ideas

for

the

diagnosis

and

treatment

of

gastric

cancer

guided

by

WORDS:

Gastric

cancer

；

DSCR8

；

MiR-107

；

Proliferation

；

Migration

；

Invasion胃癌(gastric

cancer,

GC)是全球第五大最常

见的癌症和第三大癌症死亡原因,2018年新增病

例超过100万,死亡人数约为78.

3万人(相当于

全球死亡人数中每12人就有1人死于GC)⑴。

GC通常在晚期才被诊断出来，此时一般已经发生

价值，其中长链非编码RNA(long

noncodingRNA,

IncRNA)似乎是诊断GC最有前途的工具之一⑶°

研究表明⑷,IncRNA在癌症发展中起关键作用，

作为促癌基因或抑癌基因参与了癌症发展中细胞

增殖、迁移、侵袭和凋亡等各种生物学过程。例

如,ARHGAP5-AS1是在耐化学性GC细胞中上调

的IncRNA,其高表达与GC患者预后差有关⑸；过

表达IncRNA

HOXA11-AS在体内促进了

GC细胞

癌细胞远处转移,患者预后较差,而姑息化疗是主

要的治疗手段力。在过去的几年中，研究GC的分子生物学取

得了重要进展,GC相关的小分子被证明具有预后

的增殖、细胞周期进展和转移，提示其在GC的发生

妣科技学傥学报(医学版)2021

年第35

卷第

1

期[Journal

of

Hubei

University

of

Science

and

Technology

(Medical

Sciences)]13和进展中具有致癌特性⑹。尽管已经报道了参与

GC发生和发展的几种hicRNA,但是大多数IncRNA

在GC中生物学功能和潜在机制仍有待阐明。最近，研究⑺发现DSCR8在癌症中异常表达

并起到促癌基因的作用。据报道⑻,DSCR8是肝

细胞癌的致癌基因，通过充当miR485-5p海绵来

激活Wnt/p-catenin通路，从而调节肝细胞癌的细

胞生长和细胞周期;You等⑺研究发现在卵巢癌

细胞中，YY1诱导的DSCR8通过浸润miR-3192-

5p上调YY1,促进细胞增殖、迁移、侵袭，抑制细

胞凋亡。这表明DSCR8可能是癌症诊断和治疗

的潜在生物标志物和靶标，然而关于DSCR8在

GC中的调控机制仍知之甚少。在本研究中，我们研究了

DSCR8在调节GC

细胞恶性表型中的生物学作用以及可能的分子机

制，通过生信分析和细胞实验证实DSCR8与miR-

107之间的调控关系。我们的研究有助于更好地

了解DSCR8的致癌作用，为GC的诊断和治疗提

供潜在的靶点。1材料与方法1.1

细胞来源本研究中使用的细胞系信息见表1。人正常

胃黏膜细胞GES-1和GC细胞系HGC-27、NCI-

N87、KATO

-1均培养在补充有10%

FBS

的

RPMI-1640

(

GIBCO,货号

31800022,添加

NaHCO31.5g/L,

glucose

2.

5g/L,

sodium

pyruvate

0.11g/L)中，并置于37弋，含5%

C02的条件下培养。表1实验所用细胞系魏糸ws费号产地GES-1人正常詡BrtITDU964HGC-27GCttTCHu22上海，申国NCI-N87GCttTCHul30上海，申国KATODIGCttTCHu229上海，申国SNU-1GCttTCHu230上海，申国1.2质粒构建和细胞转染DSCR8的shRNA及相应的阴性对照由Sen­gong

Biotech(中国上海)合成，miR-107

inhibitor/

mimic及各自的阴性对照购自Gene

Pharma(中国

苏州)。根据制造商的说明书，用Lipofectamine

2000(

Invitrogen,

Carlsbad,

CA,

USA)进行所有转

染。转染48h后，收集细胞。1.3

qRT-PCR使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞中分离总RNA。通过

Nanodrop

ND-2000

分光光度计(Ther-

mo

Scientific™，美国)评估RNA的数量和质量。

为了评估DSCR8的表达分析，使用RevertAid

First

Strand

cDNA

Synthesis

Kit

(

Thermo

Scientific™

,美

国)将2憾总RNA反转录为cDNA。对于miR-

107

的表达分析，使用miDETECT

A

Track™

qRT-

PCR

试剂盒(广州日博生物有限公司冲国)将2憾

总RNA反转录为cDNA。使用SYBR

Green

PCR试

剂盒(Takara

Bio,

Otsu,

Japan

)在

StepOne

实时

PCR

系统(Thermo

Fisher

Scientific

)上进行

qRT-PCR。

2-

at方法用于计算通过GAPDH和U6标准化的相

对基因表达。弓I物序列在表2中列出。表2

qRT-PCR的引物序列geneForwward(5,-3,)Reverse(5'

-3')DSCR8CGTCTOCCACTCGHTCTTGGGTCCAGGCTCCTTCGAPDHCCCATCACCATCTTCCAGGAGCTTCTCCATGGTGGTGAAGACGmiR-107TGTGTAGTAGTITGTrrATAGTGCCAACTCTACAACTACTAAATCU6CTCGCITCGGCAGCACAAACGCTTCACGAAHTGCGT1.4

荧光原位杂交(FISH)使用Ribobio合成的FISH探针进行FISH,并

根据制造商的说明使用FISH试剂盒(RiboBio

Co.,中国广州)进行操作。将盖玻片上的细胞用

PBS洗涤并在室温下用4%多聚甲醛固定lOmin,

然后在4弋下用含0.5%

Triton

X-100的磷酸盐缓

冲盐水(PBS)渗透细胞5min。在添加探针之前，

将细胞在杂交混合物中预杂交30mino与DSCR8-

Fish

Probe

Mix在37弋下孵育过夜后，细胞用4

X

含0.

l%Tween-20

的柠檬酸钠(SSC)

,2xSSC

和

1

X

SSC

于

42弋洗涤

5min,用

4Z

jb-diamidino-Z-phe-

nylindole

(

DAPI

)染色10mino最后通过荧光显微

镜观察图像。1.5

CCK-8

分析使用

Cell

Counting

Kit-8

试剂盒(Beyotime,中

国上海)检测细胞增殖。将细胞以5

x

103个细

胞/孔的细胞浓度接种到96孔板中。细胞分别孵

育0、24、48、72、96h后，向每个孔中加入lO^L

CCK-8溶液，并在37弋下再培养2ho用酶标仪测

量每个孔在

450nm

(

Bio-Rad,

Hercules,

CA,

USA

)

波长处的吸光度。1.6克隆形成实验转染后48h,将细胞(每孔1

X103)接种到6

孔板中，并用完全培养基培养2周直到明显的克

隆形成。细胞集落用4%多聚甲醛固定30min,并

14湖北科技学傥学报(医学版)2021

年第35卷第

1

期[Journal

of

Hubei

University

of

Science

and

Technology

(Medical

Sciences)]在室温下用0.5%结晶紫染色30mino用无菌水

清洗每个孔,去除残留的结晶紫。将细胞数超过

50个的定义为克隆,计算每孔的克隆数。1.7

细胞迁移和侵袭实验使用

Transwell

inserts

（

8（jiM

pore

size,

Costar,

Cambridge,MA,USA）进行迁移和侵袭测定。将细

胞接种到没有或预先涂有基质胶（BD,

Franklin

Lakes,USA）的顶室中分别进行迁移或侵袭分析,

将600mL含10%

FBS的培养基置于下腔室中。

在37弋、5%C（）2的条件下孵育24h后，用棉签擦

拭上室中未迁移或侵袭的细胞,并用甲醇固定迁

移或侵袭的细胞，用0.5%结晶紫染色并用PBS

洗涤。然后在显微镜下以200

x的放大倍数计数。

1.8双荧光素酶实验从人基因组DNA中扩增了

DSCR8的3-UTR

序列。然后将这些序列分别亚克隆到PGL3荧光

素酶报告载体（Promega,

Madison,

WI,USA

）中。

潜在的miR-107结合位点通过Quick-change定点

诱变试剂盒（Agilent

Technologies,

Santa

Clara, CA,

USA）突变。将

DSCR8

模拟物的

wt（mut）3-UTR

共转染到GC细胞中。转染48h后，通过Dual-Lu-

cy

Assay

Kit

（

Progema,

Madison,

WI,

USA

）测量萤

火虫和海肾荧光素酶的活性荧光素酶活性。1.9

RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）使用

Magna

RIP

kit

（

Millipore, Billerica,

USA

）

进行RIP检测。用DSCR8和miR-107转染细胞，

并将其重悬于裂解缓冲液中。将lOO^L全细胞提

取物与

Ago2

抗体（Abeam, Cambridge,

UK

）或

IgG

（Abeam,

Cambridge,

UK）缀合的

Protein

G

琼脂糖

微珠在4弋孵育过夜。在室温下用DNA酶I和蛋

白酶K处理免疫沉淀物20

mino回收共沉淀的

RNA,并进行qRT-PCR分析。1.10统计学方法使用

SPSS22.

0

和

GraphPad

Prism

8. 0

Soft­ware

进行统计分析。所有测量数据均以（无土

s

）表

示,两组间比较为Z检验。P<0.05表示差异具有

统计学意义。2结果2.1

DSCR8在GC组织的表达通过

starBase

数据库（starbase.

sysu.

edu.

cn/），我们发现DSCR8在GC组织中为高表

达（图1A,封二）。进一步利用qRT-PCR检测

DSCR8在GC细胞中的表达，结果显示，与GES-1

纟田胞木目比，DSCR8在GC纟田胞系

IH、NCI-N87和SNU-1中的表达显著上调（图1B,

封二）。接下来，我们选择HGC-27细胞和NCI-

N87细胞进行实验。由于IncRNA的亚细胞定位

与其生物学功能和潜在的分子机制密切相关⑼。

因此，我们通过RNA-FISH检测DSCR8的亚细胞

定位。结果表明，大多数阳性细胞主要定位于细

胞质中，少数分布在细胞核中（图1C,封二）。2.2

敲低DSCR8抑制GC细胞的增殖、迁

移和侵袭为了评估DSCR8在GC中的生物学作用，我

们通过将sh-DSCR8转染到HGC-27细胞和NCI-

N87细胞中抑制DSCR8的表达（图2A,封二）。

通过CCK-8和克隆形成实验验证细胞的增殖变

化,结果表明敲低DSCR8能抑制细胞的增殖和集

落形成（图2B、2C,封二）。接着，我们通过Tran-

swell

检测DSCR8的抑制对细胞的迁移和侵袭的

影响，结果发现,DSCR8敲低后的细胞的迁移和侵

袭能力显著降低（图2D,封二）。因此，敲低

DSCR8抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭。2.

3

DSCR8充当miR-107的分子海绵为了进一步验证DSCR8在GC中的调控机

制，我们通过NCBI查询DSCR8和miR-107的核

昔酸序列,然后在DNAMAN软件上进行结合位点

分析，发现DSCR8和miR-107具有互补的结合位

点（图3A,封二）。为了证实DSCR8充当了

miR-

107

的分子海绵，我们首先将sh-DSCR8转染到

HGC-27和NCI-N87细胞中，检查miR-107水平是

否受sh-DSCR8影响。qRT-PCR结果显示，转染

sh-DSCR8后,miR-107的表达显著上调（图3B,封

二）O构建了

DSCR8-Wt和DSCR8-mut报告载体

并进行双荧光素酶实验，结果发现DSCR8-wt的荧

光素酶活性显著下调，含有DSCR8-mut载体的细

胞其萤光素酶活性则未受影响（图3C,封二）。

RIP实验显示，使用Ago2抗体进行免疫沉淀后,

miR-107

和

DSCR8

在

HGC-27

和

NCI-N87

细胞中

富集（图3D,封二），表明miR-107和DSCR8存在

结合关系。因此，在GC中DSCR8与miR-107之

间存在直接相互作用。2.

4

miR-107逆转DSCR8对GC细胞增殖、迁移和侵袭产生的影响为了研究DSCR8是否通过miR-107依赖性

方式调节GC细胞的恶性表型，我们将sh-NC

+

妣科技学傥学报(医学版)2021

年第35

卷第

1

期[Journal

of

Hubei

University

of

Science

and

Technology

(Medical

Sciences)]15NC

inhibitorAsh-DSCR8

+

NC

inhibitor,sh-DSCR8

+

miR-107

inhibitor分别转染到HGC-27细胞和

NCI-N87细胞中，并评估了细胞的增殖、迁移和侵

袭。我们发现DSCR8的敲低能抑制HGC-27和

NCI-N87细胞的增殖、迁移和侵袭，而miR-107

in­hibitor

的转染可以逆转sh-DSCR8对HGC-27和

NCI-N87细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用（图4A

~

4D,封三）。因此，抑制miR-107逆转了敲低

DSCR8对GC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。3讨论IncRNA是近年来出现的最大且具有显著多样

性的RNA家族之一何。随着人类转录组测序的发

展，已鉴定出一些与GC发展相关的IncRNA,例如

IncRNA

MEG3［11］

A

IncRNA

AK023391［9

IncRNA

HOXC-AS3［⑵等。除了特征明确的IncRNA,在控

制GC进程中潜在的IncRNA及其相关调节机制仍

然值得研究。在本研究中，我们基于基因表达谱分

析鉴定出在GC中被上调的DSCR8,并通过qRT-

PCR、CCK8、克隆形成和Transwell等一系列的细胞

实验研究DSCR8表达量下调对GC细胞生物学功

能产生的影响。我们发现DSCR8表达量的下调会

对GC细胞的增殖、迁移和侵袭能力产生抑制作用,

这与其在子宫癌［⑶、黑素瘤［⑷和肝癌⑻的功能一

致。在这些癌症中,DSCR8可能是潜在的预后指标

和治疗靶点。总之,DSCR8在GC细胞中发挥了促

癌基因的作用。IncRNA在生物学上的作用和功能目前大部分

尚不清楚。它们在microRNAs

±的海绵功能最近

几年被发现后受到广泛研究。miRNAs是一类非编

码RNA,通过作用于mRNA来调控细胞，在蛋白编

码基因的转录后调控中发挥核心作用。IncRNA可

以作为miRNA海绵，降低其对mRNA的调控作

用［⑸。由于DSCR8很可能作为ceRNAs发挥作

用，因此，在本研究中，我们进行了生物信息学分析、

双荧光素酶实验以及RIP分析,确定了

DSCR8与在

GC中显著低表达的miR-107存在靶向结合位点,

DSCR8是miR-107的分子海绵。已有研究表明⑻，

DSCR8

能够靶向

miR485-5p/Wnt/catenin

轴调控肝

癌进程。同时，我们也在GC细胞中通过CCK8、克隆

形成、Transwell等实验验证了低表达miR-107对

DSCR8所发挥功能的抑制作用。因此，我们认为

DSCR8海绵吸附miR-107促进了

GC的发展。总之，我们确定DSCR8在GC中作为一种癌基

因在中起重要作用。我们的研究首次证实了

DSCR8通过吸附miR-107促进GC的发展。该调控

网络可能为阐明GC的肿瘤发生提供线索，并可能

为开发GC的新型诊断和治疗方法提供理论依据。参考文献：[1]

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Cancer

Res,2007,13(6)

:

1713[14]

DE

WIT

N

J,WEIDLE

U

H,RUITER

D

J,et

al.

Expres­sion

profiling

of

MMA-la

and

splice

variant

MMA-lb：new

cancer/testis

antigens

identified

in

human

melanomaf

J].

Int

J

Cancer,2002,98(4)

：547[15]

WANG

J,

LIU

X,WU

H,et

al.

CREB

up-regulates

long

non-coding

RNA,

HULC

expression

through

interaction

with

microRNA-372

in

liver

cancer

[

J ].

Nucleic

Acids

Res,2010,38(16)

：5366(收稿日期：2020-10-28)

（接第10页）（接第18页）A

BSurvivinx

100D

100@i

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（

x4oo）（接第14页）BDSCR8Merg.4aA：

D$CR酗表迦|U,馳箱秫表示iE常屛，业需秫表秫解本；B： qRT-PCRM!D$CR8在人瑞胃觥魏利GC觥糸朋表也C:皿$臓黠魏系申D$CR8緘他仰〈0.05；

»p<0.01）*El

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HGC-27NCI-N87Sh-NC

HGC-27»h-DSCR8*h-MC

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A：

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D：

TmnsweT】號湖解潮h-D$CR8£GC细躺时械翹力仰〈0.闿A：

IncBdse教耕中预測曲DSCR8和miR-107的乳向结合序列；B：转變sh-DSCR8后HGC-27细胞和NCI-N87毓申miR-107的表达水平；C：双英光素酶实验

測定監证HGC-27细胞和NCI-N87细胞tmiR-107和DSCR8之间的现向结合关系；D：通过RIP检測miR-107和DSCR8在Ago2免赛汎淀申曲富集（*p〈0.05；

**p〈0.01）

B3

DSCR8tSmiR-107W子赭uosowquJnNB2啟低皿删制GC魏的黠、辻齡驟，OOtAAUGCUGCU2UACGACGAI

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miR-107

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miR-107

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Transwellft*蜩刊祁帥觥縣敝仰〈0.05）S4抑術R-107辫/D$CR8时GC虢騒、辻務械制黠（接第22页）S1给觀触卿（左）驟鹤（右）免删傾达CD3飆（CD3主翳迟珂龜,X100）噩當劳缺（左）驟黔（右）:U酬隸CD56飙（CD56主肺记恼船X100）S3券直號蒯紅左）驟财（方）緘卿隸CD21常员他21主殊记DC魁,X100）

（接第60页）S3瘠理驟（旺X40）