2024年2月18日发(作者：功侬)
桉树根系共生真菌的分离与鉴定
王思佳;赖文珍;谢贤安;陈辉;唐明;胡文涛
【摘 要】南方土壤缺磷现象较为严重,菌根真菌等共生真菌对植物吸收磷等养分具有重要的促进作用.该研究采集尾叶桉(Eucalyptus urophylla)、窿缘桉(Eucalyptus exserta)和尾巨桉(lla×s)3种华南地区主要造林树种根系,采用组织分离法进行真菌分离,通过形态特征和核糖体18S rDNA基因ITS序列分析进行鉴定,经柯赫氏法则(Koch's Rule)确定桉树根系共生真菌,为桉树共生真菌理论研究和资源利用提供依据.结果表明:(1)3种桉树根系中,窿缘桉具有外生菌根(ectomycorrhizas,ECM)和丛枝菌根(arbuscular mycorrhizas,AM)结构,尾叶桉和尾巨桉同时具有AM结构、ECM结构和深色有隔内生真菌(dark septate
endophytes fungi,DSE)结构.(2)3种桉树根系中分离鉴定出6种真菌:三色小皮伞菌(Marasmius tricolor)、黑柄裸脚伞(Gymnopus melano-pus)、茎点霉属(Phoma sp.)、镰刀霉属(Fusarium sp.)、二型伞霉(Umbelopsis dimorpha)和芒弗里亚拟盘多毛孢(Pestalotiopsis mangifolia).(3)6种真菌回接巨桉(Eucalyptus
grandis)组培苗,三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞形成ECM结构,为ECM真菌;茎点霉属、镰刀霉属、二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢形成DSE典型的深色有隔菌丝和微菌核结构,推测为DSE;其中2种ECM真菌为桉树中首次报道.
【期刊名称】《西北植物学报》
【年(卷),期】2018(038)008
【总页数】9页(P1553-1561)
【关键词】桉树;外生菌根真菌;共生真菌;深色有隔内生真菌
【作 者】王思佳;赖文珍;谢贤安;陈辉;唐明;胡文涛
【作者单位】华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州
510642
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93-331;Q948.122.3
桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)植物的统称，属常绿高大乔木，具有生长速度快、树干通直、适应性强等特点，是中国南方主要的造林树种[1]。南方酸性红壤和砖红壤中磷成分主要为磷酸铝、磷酸铁和磷酸钙，有效磷含量低，引起桉树生长缓慢，某些组织发生畸变等现象[2]。为此，大多桉树栽培区通过施用化肥来提高桉树生长量，而化肥又会导致土壤理化性质不断加剧恶化，土壤质量下降。加之南方土壤呈酸性，磷肥很难被植物吸收，最终导致桉树缺磷现象严重，长期使用化学肥料，不仅会对周围环境造成污染，还会导致土壤肥力退化[1]。
菌根(mycorrhiza)是土壤中某些真菌与植物根系形成的共生体，具有促进植物吸收水分和磷素等矿质营养，提高植物生长量，增强植物抗逆能力和改良森林土壤结构特性等重要作用[3-5]。外生菌根(ectomycorrhizas，ECM)和丛枝菌根
(arbuscular mycorrhiza，AM)是林木菌根的主要类型[5]。深色有隔内生真菌(dark septate endophytic fungi，DSE)广泛存在于植物根围，是一类能够定殖在植物根系的真菌类群，被认为是“特殊的菌根菌”[6]，并且能够与菌根真菌共同存在于植物根系中[7-8]。
桉树是既可以形成AM，又可以形成ECM的树种[9]。AM真菌可以在一定程度上提高桉树对磷的高效利用，并且能够缓解桉树受到土壤中铝离子的毒害[5]。ECM真菌对桉树青枯病的生物防治有重要意义[10]。朱天辉等[11]对四川省范围内的巨桉(Eucalyptus grandis)、尾叶桉(Eucalyptus urophylla)、蓝桉(Eucalyptus
globulus)、大叶桉(Eucalyptus robusta)ECM真菌调查，发现9科11属17种ECM真菌，梁洪萍[12]在四川省内的巨桉发现7科、10属、17种ECM真菌，但这些ECM真菌多为野外调查发现，与桉树的共生效应研究很少。为发掘优良的桉树共生真菌资源，本研究通过对桉树根系真菌侵染率的测定和真菌的分离鉴定，将真菌回接桉树，经柯赫氏法则(Koch's Rule)确定桉树共生真菌，为进一步研究共生真菌促进桉树生长、增加磷素营养吸收的机制，以及应用共生真菌提高桉树造林成活率、生物量和木材产量提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 样品采集
尾叶桉、窿缘桉(Eucalyptus exserta)和尾巨桉(E. urophylla × E. grandis)采自华南农业大学树木园和增城教学科研基地，位于N23°09′10″～23°14′22″，E113°20′22″～113°37′56″，属于亚热带季风气候和亚热带海洋性气候，土壤为赤红壤。2017年11月采集样品，在树冠的投影区内取30～40 cm范围内土层的树木侧根作为根样，将根上的大块泥土轻轻抖掉，其余泥土连同根系一起装入密封袋中，同种桉树放入同一密封袋中，封口标记。根样带回实验室后，一部分用于立即观察根系的形态结构和共生真菌的分离，另一部分用于侵染率的测定。
1.2 试验方法
1.2.1 共生真菌的侵染率统计 将采集的根样冲洗干净，采用透明压片法对根系进行透明、酸化、台盼蓝染色和脱色后，在显微镜下统计菌根侵染情况[13]，参照Trouvelot 等[14]的方法统计AM真菌和ECM真菌的侵染率及侵染强度。
1.2.2 共生真菌的分离培养 采用组织分离法分离真菌。将根系洗去泥土，剪成1～2 cm根段，在体式显微镜下找出带有共生真菌结构的根尖，经3%次氯酸钠表面消毒2～3 min，无菌水中冲洗后，剪成0.5～1 cm的根段，置入PDA培养基内，25 ℃恒温倒置培养[5]。
待培养基内长出菌丝后进行纯化，经过纯化后的菌株一部分进行插片培养[15]，待菌丝长到玻片中部，用于真菌的形态学鉴定。另一部分纯化菌株接种到PDA斜面，4 ℃冰箱保存，用于分子鉴定。
1.2.3 真菌的形态学鉴定 观察菌落的表面特征、形状、颜色、大小、光滑度等菌落特征，记录其生长状况。显微镜下观察菌丝的颜色、是否分隔、分枝情况；观察分生孢子的形状、颜色、大小、细胞壁特征、有无子囊(担子)及子囊孢子(担孢子)等特征。根据真菌分类文献，并参阅近几年有关真菌鉴定的文献对分离菌株进行形态学鉴定[16-18]。
1.2.4 真菌的分子生物学鉴定 将纯化的真菌在25 ℃培养2周后，收集新鲜菌丝进行ITS序列分析。参照Zhou等[19]研究方法，采用真菌DNA微量提取试剂盒(Omega公司，D3195-01)提取DNA。ITS序列扩增引物选择真菌ITS区通用引物ITS1-F和ITS4(ITS1-F: CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4:
TCCTCCGCTTATTGATATGC)[20]，由生工生物技术有限公司合成。
通过PCR反应扩增真菌ITS rDNA基因。反应体系20 μL[10 μL Premix
Tap(Sangon Biotech)、0.5 μL ITS4、0.5 μL IFS1-F、1 μL PCR产物和8 μL
ddH2O]。反应条件为95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火25 s，
72 ℃延伸1 min，35个循环；最终72 ℃延伸5 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(100 V，40 min)，采用胶回收试剂盒(OMEGA公司，D2500)进行PCR产物回收。回收产物采用TaKaRa公司pMD18-T试剂盒进行T/A连接并克隆转化。连接反应体系5 μL(2 μL pMD18-T、0.5 μL Insert DNA和2.5 μL Solution
Ⅰ)，37 ℃培养过夜，送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。
将真菌测序所得的ITS序列在NCBI中运用BLAST工具进行比对分析，并从NCBI中下载已知同源序列，用软件MEGA(Version 5.1)进行比对，用Neighbor-Joining法构建系统发育树。使用Maximum Composite Likelihood 方法计算Bootstrap值，估测系统发育树的置信度。
1.2.5 共生真菌的回接 将沙子、蛭石(体积比为1∶1)在121 ℃灭菌60 min，装满体积为0.3 L的花盆中，参考刘茂军等[21]的方法并做适当修改，将分离出的共生真菌回接到巨桉组培苗(来自中国林业科学研究院热带林业研究所)，每株接种20个直径5 mm的菌饼，每组3个重复。将接种好的植株套袋，在组培室内培养(温度25 ℃，湿度60%，光强5 000 Lux)，半个月后取下套袋；定期浇水，2个月后，收获接种苗，检测根系共生真菌的定殖情况并测定侵染率。
2 结果与分析
2.1 共生真菌侵染率统计
观察到尾叶桉、窿缘桉和尾巨桉均能被菌根真菌侵染，其中窿缘桉的AM真菌侵染率最高，达到58.75%，侵染强度14.54%；其次是尾巨桉，AM真菌侵染率为51.33%，侵染强度15.74%；尾叶桉最低，侵染率为48.67%，侵染强度为11.03%(表1)。与AM真菌侵染率相比，ECM真菌的侵染率相对较低，尾叶桉、尾巨桉和窿缘桉3种桉树的ECM真菌侵染率依次为11.03%、13.02%和15.00%，侵染强度为1.64%、1.60%和0.81%(表1)。经方差分析，尾叶桉、窿缘桉和尾巨桉3种桉树AM真菌总侵染率差异不显著(P>0.05)，ECM真菌总侵染率差异也不
显著(P>0.05)。
对3种桉树共生真菌侵染特征观察，发现尾叶桉(图1，A～C)和尾巨桉(图1，D～F)都同时具有AM真菌结构、ECM真菌结构和DSE结构，窿缘桉具有AM真菌结构(图1，G)和ECM真菌结构(图1，H、I)。3种桉树的AM真菌结构和ECM真菌结构都比较明显，典型的深色有隔内生真菌结构在尾叶桉和尾巨桉都有观察到。
尾叶桉、窿缘桉和尾巨桉3种桉树根尖均存在外生菌根的菌套结构(图2)。但3种桉树的外生菌根形态不同，其中尾巨桉为单轴分枝状(图2，A)，窿缘桉为单轴分枝和二叉分枝(图2，B、C)，尾叶桉的菌根形态呈二叉分枝状(图2，D～F)。外生菌根的菌根形态特征是鉴定外生菌根真菌的依据之一，说明外界自然环境下，本研究采样点的尾巨桉和尾叶桉分别与1种外生菌根真菌形成菌根，窿缘桉与2种外生菌根真菌形成菌根。
表1 桉树根系菌根真菌侵染状况Table 1 The colonization status of
mycorrhizal fungi in Eucalyptus roots宿主植物Host speciesAM真菌 AM
fungiECM真菌 ECM fungi侵染率Fungal colonization/%侵染强度Colonization intensity/%侵染率Fungal colonization/%侵染强度Colonization
intensity/%尾叶桉Eucalyptus
urophylla48.67±9.8711.03±4.4114.00±2.651.64±0.81窿缘桉Eucalyptus
exserta58.75±13.1514.54±11.5215.00±0.000.81±0.67尾巨桉E. urophylla ×
E. grandis51.33±1.1515.74±4.5213.02±1.751.60±0.49
A～C.尾叶桉；D～F. 尾巨桉；G～I.窿缘桉；a. 菌套结构；b. 深色有隔内生真菌；c. 根内菌丝；d. 丛枝结构；e. 泡囊；f. 根外菌丝图1 桉树根系中的菌丝结构A-C.
Eucalyptus urophylla；D-F. E. urophylla × E. grandis；ptus
exserta; a. Mantle；b. Dark septate endophytes；c. Internal hyphae；d.
Arbuscule；e. Vesicle；f. External hyphaeFig.1 Mycelium structure in
Eucalyptus roots
图2 桉树根系外生菌根真菌的形态结构Fig.2 Ectomycorrhizas in Eucalyptus
roots
2.2 桉树共生真菌的形态特征
从3种桉树根系共分离出6株共生真菌，标记为WY1、WY3、WY9、LY1、WJ1、WJ5。在PDA培养基上培养20 d，形成的菌落颜色呈白色、淡黄色或者深灰色；形状为圆形或椭圆形；菌丝致密或稀疏(图3)；其中WY1生长速度最快，25℃恒温培养20 d菌落直径为9 cm，最快长满平板；其次为WY3、WJ5和LY1，菌落直径分别为8.5 cm、8.6 cm和9 cm；WY9和WJ1则生长比较缓慢，菌落直径为5.4 cm和4.4 cm。插片培养的盖玻片置于载玻片上，显微镜观察的菌丝形态(图4)，菌落特征和形态特征描述见表2。
从PDA培养基的菌落特征(图3)以及显微镜下的菌丝形态观察(图4)，可以看出WJ5、WY3、WY9和LY1的菌落颜色呈深色，菌丝有隔，都具有典型的深色有隔内生真菌的特征，初步推断为DSE。而WY1和WJ1的菌落呈白色，菌丝无色，推测属于担子菌亚门(Basidiomycotina)。参照真菌形态和分类描述的特征，鉴定出WY3为茎点霉属(Phoma sp.)，WY9为镰刀霉属(Fusarium sp.)，LY1为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)，WY1为小皮伞属(Marasmius sp.)，WJ1为裸脚伞属(Gymnopus sp.)，WJ5为伞状霉属(Umbelopsis sp.)。
A. WY1；B. WY3；C. WY9；D. WJ1；E. WJ5；F. LY1图3 分离菌株在PDA培养基上生长20 d后的菌落形态Fig.3 The isolated fungus colonies on PDA
medium after 20 days
A. WY1；B. WY3；C～D. WJ5；E～G. LY1；H. WJ1；I. WY9图4 分离的真菌的菌丝和孢子形态Fig.4 The mycelium and spore morphology of isolated
fungi
2.3 共生真菌的分子鉴定
提取根系共生真菌DNA后，利用引物ITS1-F和ITS4，对提取的DNA菌液进行PCR扩增，在凝胶成像系统中看到清晰的条带(图5)。将真菌测序所得的ITS序列提交到GenBank数据库后，在线运用BLAST工具进行比对，结果显示：WY1和WJ1与GenBank中的JN943601.1和MF100988.1菌株有95%以上的相似度，结合形态特征确定它们为担子菌亚门中不同属的2种外生菌根真菌，分别为三色小皮伞菌(M. tricolor)和黑柄裸脚伞(G. melanopus)；WY3、WY9、WJ5和LY1分别与GenBank中茎点霉属、镰刀霉属、二型伞霉(U. dimorpha)和芒弗里亚拟盘多毛孢(P. mangifolia)有94%以上的相似度(表3)。
将真菌测序所得的ITS序列提交到GenBank数据库，运用BLAST工具进行比对，并从NCBI下载GenBank数据库内已知同源序列，用软件MEGA(Version 5.1)进行对比分析，用Neighbor-Joining法构建系统发育树(图6)，可以看到，6株真菌(红色☆标出)分为3个类群，隶属于担子菌亚门、接合菌亚门(Zygomycotina)和半知菌亚门(Deuteromycotina)。其中担子菌亚门单独成一类群，包括WY1和WJ1；接合菌亚门包括WJ5；WY3、WY9和LY1同属半知菌亚门，其中LY1和WY9有极高的相似度。
表2 真菌菌落特征和形态特征Table 2 The characteristics of colonies and
morphology菌株编号Strain No.菌落特征Character of colonies培养20 d后菌落直径20 days old colony of isolated fungi/cm形态特征Character of
mycelium and sporeWY1菌落呈白色,绒毛状,生长速度快,菌落环纹不明显The
colony was white and villous. It grew fast and the colony rings were not
obvious9.0菌丝无色,无隔,直径约3 μm;孢子无色或近无色The mycelium was
colorless and aseptate. The di-ameter was about 3 μm; The spores were
nearly colorlessWY3菌落呈黄棕色,细绒状,生长速度较快,菌落环纹均匀The
colony was yellow-brown and villous. It grew a little fast and the colony
rings were uniform8.5菌丝通直,深色有隔,直径2～4 μm;孢子小,近球形The
mycelium was straight with dark septa. The diameter was about 2-4 μm;
The spores were small and nearly sphericalWY9菌落呈淡黄棕色,绒毛状,生长速度缓慢,菌落环纹不明显The colony was yellow-brown and villous. It grew
slowly and the colony rings were not obvious5.4菌丝细长而直,深色有隔,分枝,直径3～4 μm;分生孢子镰刀形或者梭形The mycelium was straight with dark
septa and branches. The diameter was about 3-4 μm; The spores were
sickle or spindleWJ1菌落白色,细绒状,生长速度缓慢,菌落环纹不明显The
colony was white and villous. It grew slowly and the colony rings were not
obvious4.4菌丝白色,直径2～3 μm;未见孢子The mycelium was white and
the diameter was a-bout 2-3 μm; The spores were not foundWJ5菌落土黄褐色,菌丝致密,生长速度快,外围菌落环纹明显The colony was yellow-brown
like soil with dense mycelium. It grew fast and the outer colony rings were
obvious9.0菌丝深色有隔,直径3～4 μm;孢子圆球形、椭圆形或不规则The
mycelium was dark and septate. The diame-ter was about 3-4 μm; The
spores were spheri-cal, elliptical or irregularLY1菌落呈深灰色,有粉状物,菌丝致密,菌落环纹密集The colony was dark gray with powder and dense
mycelium. The colony rings were dense9.0菌丝通直,深色有隔,直径3～5 μm;分生孢子纺锤形或圆球形,多孢The mycelium was straight with dark septa.
The diameter was about 3-5 μm; The spores were spindle or spherical
表3 桉树根系共生真菌rDNA ITS序列Blast比对结果Table 3 Blast results of
symbiotic fungus rDNA ITS in Eucalyptus roots菌株编号Strain k相似菌株Nearest type strain相似菌株GenBank登录号Accession No.相似度
Identity/%WY1三色小皮伞菌Marasmius tricolor三色小皮伞菌Marasmius
tricolorJN943601.1KX058070.19595WY3茎点霉属Phoma sp.茎点霉属Phoma 367549.1GU183116.19895WY9镰刀霉属Fusarium sp.镰刀霉属Fusarium 059845.1KM979804.19999WJ1黑柄裸脚伞Gymnopus
melanopus黑柄裸脚伞Gymnopus melanopusMF100988.1NR
137539.19999WJ5二型伞霉Umbelopsis dimorpha伞状霉属Umbelopsis
206664.1JQ912671.19999LY1芒弗里亚拟盘多毛孢Pestalotiopsis
mangifolia拟盘多毛孢属Pestalotiopsis 204660.1JQ905644.19496
图5 分离真菌DNA的PCR产物1%琼脂凝胶电泳Fig.5 PCR products of
isolated fungi on 1% agar gel electrophoresis
综合形态特征和ITS序列分析，确定6种真菌隶属3亚门5目6科6属。其中，半知菌亚门、瘤座孢菌目(Tuberculariales)、瘤座孢菌科(Tuberculariaceae)、镰刀霉属，分离自尾叶桉；球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科(Sphaerioidaceae)、茎点霉属，分离自尾叶桉；黑盘孢菌目(Melanconiales)、黑盘孢菌科(Melanconiaceae)、拟盘多毛孢属、芒弗里亚拟盘多毛孢，分离自窿缘桉。担子菌亚门、伞菌目(Agaricales)、小皮伞科(Marasmiaceae)、裸脚伞属、黑柄裸脚伞，分离自尾巨桉；白蘑科(Tricholomataceae)，小皮伞属、三色小皮伞菌，分离自尾叶桉。接合菌亚门、毛霉目(Mucorales)、伞状霉科(Mucoraceae)、伞状霉属、二型伞霉，分离自尾巨桉。
图6 基于18S rDNA ITS序列构建的系统发育树Fig.6 Neighbor-joining
phylogenetic tree based on 18S rDNA ITS sequences
A～B. 三色小皮伞菌；C～D. 芒弗里亚拟盘多毛孢；E～F. 二型伞霉；G. 镰刀霉属；H. 黑柄裸脚伞；I. 茎点霉属a. 根外菌丝；b. 深色有隔内生真菌；c. 微菌核；d. 根内菌丝图7 分离的真菌在回接根系上形成的菌丝结构A-B. M. tricolor；C-D. P.
mangifolia；E-F. U. dimorpha；G. Fusarium sp.；H. G. melanopus；I.
Phoma sp.a. External hyphae；b. Dark septate endophytes；c.
Microsclerotia；d. Internal hyphaeFig.7 Mycelium structures of isolated
fungi formed in re-inoculated roots after 60 days
A～D.三色小皮伞菌；E、F.黑柄裸脚伞图8 回接根系上的外生菌根形态A-D. M.
tricolor; E-F. G. melanopusFig.8 Ectomycorrhizas formed in re-inoculated
roots of Eucalyptus after 60 days
2.4 真菌回接桉树的侵染效应
2.4.1 真菌与桉树共生效应 6种真菌回接巨桉组培苗后菌丝侵染情况显示，茎点霉属、镰刀霉属、二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢4种真菌形成深色有隔菌丝和微菌核(microsclerotia)结构(图7)，推测它们为DSE，微菌核丰富度分别为46.8%、42.3%、56.7%和62.3%。三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞2种真菌形成外生菌丝及菌套结构，确定为桉树外生菌根真菌(图8)。
2.4.2 回接后侵染率统计 6种真菌回接无菌巨桉组培苗，测定侵染率发现，6种真菌均能在巨桉根内侵染，其中茎点霉属的侵染率最高(52.2%)，其次为黑柄裸脚伞(侵染率为45.3%)，三色小皮伞菌、镰刀霉属、二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢的侵染率分别为30%、32.2%、33.2%和22.1%。
3 讨 论
桉树是典型的既可以形成丛枝菌根(AM)，又可以形成外生菌根(ECM)的树种[5]，甚至外生菌根、丛枝菌根和两者混合菌根同时存在[22]，本研究在尾叶桉、窿缘桉和尾巨桉3种桉树除了观察到有ECM结构和AM真菌结构，同时，在尾叶桉和尾巨桉中还观察到典型的深色有隔内生真菌结构，说明桉树菌根真菌具有多样性，不仅是前人报道的可以与AM真菌、ECM真菌形成混合菌根，还可以和DSE形成共生体系。
本研究在桉树根系中首次报道2种ECM真菌，三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞。弓明钦等[23]对华南地区桉树ECM真菌的调查发现11种，优势菌为多根硬皮马勃(Scleroderma polyrhizum Pers)；朱天辉等[11]和梁洪萍[12]分别发现四川桉树有17种ECM真菌，都与本次分离到的2种ECM真菌不同，不同树种、不同生态环境会影响菌根真菌的种类和多样性。三色小皮伞菌具有产漆酶的特性，漆酶属于木质素降解酶类，可参与植物细胞壁的形成，还可去木质素，在环境修复、农业生产等领域用途广泛[24]；黑柄裸脚伞为中国新纪录种[25]，其生物学特性有待进一步研究。
在桉树根系中分离得到4种内生真菌，回接后均观察到DSE典型的深色有隔菌丝和微菌核结构，推测它们为桉树根系中的DSE，有待于进一步的研究。茎点霉属、拟盘多毛孢属和镰刀霉属是桉树中具有一定抗菌作用的内生真菌[26]，谢玲等[27]在甘蔗(Saccharum officinarum)根围发现深色有隔内生真菌茎点霉属，韦继光[28]从南山茶(Camellia semiserrata)和短叶罗汉松(Podocarpus macorphyllus)中分离出芒弗里亚拟盘多毛孢；格希格图等[29]在桉树根系中发现镰刀菌(Fusarium)的存在，徐超等[30]发现二型伞霉可提高铁皮石斛生长速度和增强抗旱能力。
参考文献:
【相关文献】
[1] 任忠秀, 包雪梅, 于家伊, 等. 中国桉树人工林施肥现状、存在问题及对策[J]. 桉树科技, 2013,
30(4): 52-59.
REN Z X, BAO X M, YU J Y, et al. Current status, problems and countermeasures of
Eucalyptus plantation fertilization practices in China[J]. Eucalypt Science and Technology,
2013, 30(4): 52-59.
[2] 苏英吾, 李向阳. 华南土壤肥力特征与桉树施肥[J]. 中南林业调查规划, 1997,(3): 35-38.
SU Y W, LI X Y. Characteristics of soil fertility in south China and fertilization of
Eucalyptus[J]. Central South Forest Inventory Planning, 1997,(3): 35-38.
[3] 张文泉, 闫 伟. 外生菌根菌对樟子松苗木生长的影响[J]. 西北植物学报, 2013, 33(5): 998-1 003.
ZHANG W Q, YAN W. Effect of ectomycorrhizae on the growth of Pinus sylvestris var.
mongolica seedlings[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2013, 33(5): 998-1 003.
[4] 徐 超, 吴小芹. 菌根化马尾松对干旱胁迫的响应及其内源多胺的变化[J]. 西北植物学报, 2009,
29(2): 296-301.
XU C, WU X Q. Drought responses and related endogenous polyamine changes in
mycorrhizaed Pinus massoniana[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2009, 29(2):
296-301.
[5] 弓明钦, 陈应龙, 仲崇禄. 菌根研究及应用[M]. 北京: 中国林业出版社, 1997.
[6] MARINS J F, CARRENHO R, THOMAZ S M. Occurrence and coexistence of AMF and
dark septate fungi in aquatic macrophytes in a tropical river-floodplain system[J]. Aquatic
Botany, 2009, 91: 13-19.
[7] WU L Q, LÜ Y L, MENG Z X, et al. The promoting role of an isolate of dark-septate
fungus on its host plant Saussurea involucrata Kar. et Kir[J]. Mycorrhiza, 2010, 20(2): 127-135.
[8] 胡玉金, 高春梅, 刘杏忠, 等. 保护地黄瓜根内和土壤中丛枝菌根真菌和深色有隔内生真菌多样性研究[J]. 菌物学报, 2017, 36(2): 164-176.
HU Y J, GAO C M, LIU X Z, et al. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and dark septate
endophytes in the greenhouse cucumber roots and soil[J]. Mycosystema, 2017, 36(2):
164-176.
[9] MALAJCZUK N, GARBAYE J. Infectivity of Pine and Eucalypt isolates of Pisolithus
tinctorius on roots of Eucalyptus urophylla in vitro. 1. mycorrhiza formation in model
systems[J]. New Phytologist, 1990, 114: 627-631.
[10] 弓明钦, 陈 羽, 王凤珍, 等. 外生菌根对桉树青枯病的防治效应[J]. 林业科学研究, 1999, 12(4):
339-345.
GONG M Q, CHEN Y, WANG F Z, et al. The control effect of ectomycorrhizal fungi on
Pseudomonas solanacearum of Eucalyptus[J]. Forest Research, 1999, 12(4): 339-345.
[11] 朱天辉, 张 健, 胡庭兴, 等. 四川桉树外生菌根真菌的研究[J]. 四川农业大学学报, 2001, 19(2):
137-140.
ZHU T H, ZHANG J, HU T X, et al. Study on ectomycorrhizal fungi of Eucalypt[J]. Journal of
Sichuan Agricultural University, 2001, 19(2): 137-140.
[12] 梁洪萍. 四川巨桉外生菌根研究[D]. 四川雅安: 四川农业大学, 2010.
[13] PHILLIPS J M, HAYMAN D S. Improved procedures for clearing and staining parasitic
and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J].
Transactions of the British Mycological Society, 1970, 55: 158-161.
[14] TROUVELOT A, KOUGH J L, GIANINAZZI-PEARSON V. Mesure du taux de
mycorhization VA d’un systeme radiculaire. Recherche de methodes d’estimation ayant
une signification fonctionnelle[M]. Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae.
Paris, France: INRA, 1986: 217-221.
[15] 杨 勇. 放线菌气生菌丝插片培养方法[J]. 生物学通报, 1987,(11): 41,27.
YANG Y, Cultivation method of aerial hyphae of actinomycetes[J]. Bulletin of Biology,
1987,(11): 29,43.
[16] 戴芳澜. 真菌的形态和分类[M]. 北京: 科学出版社, 1987.
[17] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1979.
[18] 邵力平, 沈瑞祥, 张素轩, 等. 真菌分类学[M]. 北京: 中国林业出版社, 1983.
[19] ZHOU J Z, BRUNS M A, TIEDJE J M. DNA recovery from soils of diverse composition[J].
Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(2): 3 216-3 221.
[20] WHITE T J, BRUNS T, LEE S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes for phylogenetics[J]. PCR Protocols: A guide to Methods and
Applications, 1990, 18: 315-322.
[21] 刘茂军, 李 涛, 赵之伟. 一种快速建立DSE与植物共生培养体系的方法及其应用, CN
101263778 A[P]. 2008.
[22] 朱天辉, 张 健, 胡庭兴, 等. 四川桉树菌根类型及林分密度对菌根真菌的影响[J]. 四川农业大学学报, 2001, 19(3): 222-224.
ZHU T H, ZHANG J, HU T X, et al. Effects of mycorrhiza types and stand density on
mycorrhizal fungi of Eucalyptus in Sichuan[J]. Journal of Sichuan Agricultural University,
2001, 19(3): 222-224.
[23] 弓明钦, 陈 羽. 华南地区松、桉树种外生菌根调查[J]. 林业科学研究, 1991,(3): 323-327.
GONG M Q, CHEN Y. Investigation of ectomycorrhiza species of Pine and Eucalyptus in
South China[J]. Forest Research, 1991,(3): 323-327.
[24] 芦光新, 陈秀蓉, 王军邦, 等. 高寒草地土壤三色小皮伞菌产漆酶特性的研究[J]. 草地学报, 2014,
22(5): 1 080-1 085.
LU G X, CHEN X R, WANG J B, et al. Producing laccase-characteristics of Maresmius
tricolor isolated from the soil of alpine meadow[J]. Acta Agrestia Sinica, 2014, 22(5): 1
080-1 085.
[25] 邓树方. 中国南方裸脚伞属分类暨小皮伞科真菌资源初步研究[D]. 广州: 华南农业大学, 2016.
[26] 单体江, 王小晴, 毛子翎, 等. 桉树内生真菌及其抗菌活性最新进展[C]// 中国植物保护学会第十二次全国会员代表大会暨学术年会, 2017.
[27] 谢 玲, 刘 斌, 覃丽萍, 等. 甘蔗根围深色有隔内生真菌(DSE)的分离及接种效应[J]. 西南农业学报,
2014, 27(2): 635-640.
XIE L, LIU B, QIN L P, et al. Isolation and inoculation effect of dark septate endophytes
(DSE) from sugarcane rhizosphere[J]. Southwest China Journal of Agricultural Science,
2014, 27(2): 635-640.
[28] 韦继光. 罗汉松科、山茶科和红豆杉科植物内生拟盘多毛孢的多样性及拟盘多毛孢属分子系统学研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2004.
[29] 格希格图, 胡鸢雷, 慈忠玲, 等. 桉树根部内生菌与青枯病相关关系研究[J]. 林业科技通讯,
2009,(8): 42-43.
GE X G T, HU Y L, CI Z L, et al. Study on the relationship between endophyte and
Pseudomonas solanacearum in Eucalyptus Root[J]. Journal of Forestry Science and
Technology, 2009,(8): 42-43.
[30] 徐 超, 史 俊, 席刚俊, 等. 一种二型伞霉及其在铁皮石斛促生与抗旱中的应用, CN 104195054
B[P]. 2016.
2024年2月18日发(作者：功侬)
桉树根系共生真菌的分离与鉴定
王思佳;赖文珍;谢贤安;陈辉;唐明;胡文涛
【摘 要】南方土壤缺磷现象较为严重,菌根真菌等共生真菌对植物吸收磷等养分具有重要的促进作用.该研究采集尾叶桉(Eucalyptus urophylla)、窿缘桉(Eucalyptus exserta)和尾巨桉(lla×s)3种华南地区主要造林树种根系,采用组织分离法进行真菌分离,通过形态特征和核糖体18S rDNA基因ITS序列分析进行鉴定,经柯赫氏法则(Koch's Rule)确定桉树根系共生真菌,为桉树共生真菌理论研究和资源利用提供依据.结果表明:(1)3种桉树根系中,窿缘桉具有外生菌根(ectomycorrhizas,ECM)和丛枝菌根(arbuscular mycorrhizas,AM)结构,尾叶桉和尾巨桉同时具有AM结构、ECM结构和深色有隔内生真菌(dark septate
endophytes fungi,DSE)结构.(2)3种桉树根系中分离鉴定出6种真菌:三色小皮伞菌(Marasmius tricolor)、黑柄裸脚伞(Gymnopus melano-pus)、茎点霉属(Phoma sp.)、镰刀霉属(Fusarium sp.)、二型伞霉(Umbelopsis dimorpha)和芒弗里亚拟盘多毛孢(Pestalotiopsis mangifolia).(3)6种真菌回接巨桉(Eucalyptus
grandis)组培苗,三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞形成ECM结构,为ECM真菌;茎点霉属、镰刀霉属、二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢形成DSE典型的深色有隔菌丝和微菌核结构,推测为DSE;其中2种ECM真菌为桉树中首次报道.
【期刊名称】《西北植物学报》
【年(卷),期】2018(038)008
【总页数】9页(P1553-1561)
【关键词】桉树;外生菌根真菌;共生真菌;深色有隔内生真菌
【作 者】王思佳;赖文珍;谢贤安;陈辉;唐明;胡文涛
【作者单位】华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州 510642;华南农业大学 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州
510642
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93-331;Q948.122.3
桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)植物的统称，属常绿高大乔木，具有生长速度快、树干通直、适应性强等特点，是中国南方主要的造林树种[1]。南方酸性红壤和砖红壤中磷成分主要为磷酸铝、磷酸铁和磷酸钙，有效磷含量低，引起桉树生长缓慢，某些组织发生畸变等现象[2]。为此，大多桉树栽培区通过施用化肥来提高桉树生长量，而化肥又会导致土壤理化性质不断加剧恶化，土壤质量下降。加之南方土壤呈酸性，磷肥很难被植物吸收，最终导致桉树缺磷现象严重，长期使用化学肥料，不仅会对周围环境造成污染，还会导致土壤肥力退化[1]。
菌根(mycorrhiza)是土壤中某些真菌与植物根系形成的共生体，具有促进植物吸收水分和磷素等矿质营养，提高植物生长量，增强植物抗逆能力和改良森林土壤结构特性等重要作用[3-5]。外生菌根(ectomycorrhizas，ECM)和丛枝菌根
(arbuscular mycorrhiza，AM)是林木菌根的主要类型[5]。深色有隔内生真菌(dark septate endophytic fungi，DSE)广泛存在于植物根围，是一类能够定殖在植物根系的真菌类群，被认为是“特殊的菌根菌”[6]，并且能够与菌根真菌共同存在于植物根系中[7-8]。
桉树是既可以形成AM，又可以形成ECM的树种[9]。AM真菌可以在一定程度上提高桉树对磷的高效利用，并且能够缓解桉树受到土壤中铝离子的毒害[5]。ECM真菌对桉树青枯病的生物防治有重要意义[10]。朱天辉等[11]对四川省范围内的巨桉(Eucalyptus grandis)、尾叶桉(Eucalyptus urophylla)、蓝桉(Eucalyptus
globulus)、大叶桉(Eucalyptus robusta)ECM真菌调查，发现9科11属17种ECM真菌，梁洪萍[12]在四川省内的巨桉发现7科、10属、17种ECM真菌，但这些ECM真菌多为野外调查发现，与桉树的共生效应研究很少。为发掘优良的桉树共生真菌资源，本研究通过对桉树根系真菌侵染率的测定和真菌的分离鉴定，将真菌回接桉树，经柯赫氏法则(Koch's Rule)确定桉树共生真菌，为进一步研究共生真菌促进桉树生长、增加磷素营养吸收的机制，以及应用共生真菌提高桉树造林成活率、生物量和木材产量提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 样品采集
尾叶桉、窿缘桉(Eucalyptus exserta)和尾巨桉(E. urophylla × E. grandis)采自华南农业大学树木园和增城教学科研基地，位于N23°09′10″～23°14′22″，E113°20′22″～113°37′56″，属于亚热带季风气候和亚热带海洋性气候，土壤为赤红壤。2017年11月采集样品，在树冠的投影区内取30～40 cm范围内土层的树木侧根作为根样，将根上的大块泥土轻轻抖掉，其余泥土连同根系一起装入密封袋中，同种桉树放入同一密封袋中，封口标记。根样带回实验室后，一部分用于立即观察根系的形态结构和共生真菌的分离，另一部分用于侵染率的测定。
1.2 试验方法
1.2.1 共生真菌的侵染率统计 将采集的根样冲洗干净，采用透明压片法对根系进行透明、酸化、台盼蓝染色和脱色后，在显微镜下统计菌根侵染情况[13]，参照Trouvelot 等[14]的方法统计AM真菌和ECM真菌的侵染率及侵染强度。
1.2.2 共生真菌的分离培养 采用组织分离法分离真菌。将根系洗去泥土，剪成1～2 cm根段，在体式显微镜下找出带有共生真菌结构的根尖，经3%次氯酸钠表面消毒2～3 min，无菌水中冲洗后，剪成0.5～1 cm的根段，置入PDA培养基内，25 ℃恒温倒置培养[5]。
待培养基内长出菌丝后进行纯化，经过纯化后的菌株一部分进行插片培养[15]，待菌丝长到玻片中部，用于真菌的形态学鉴定。另一部分纯化菌株接种到PDA斜面，4 ℃冰箱保存，用于分子鉴定。
1.2.3 真菌的形态学鉴定 观察菌落的表面特征、形状、颜色、大小、光滑度等菌落特征，记录其生长状况。显微镜下观察菌丝的颜色、是否分隔、分枝情况；观察分生孢子的形状、颜色、大小、细胞壁特征、有无子囊(担子)及子囊孢子(担孢子)等特征。根据真菌分类文献，并参阅近几年有关真菌鉴定的文献对分离菌株进行形态学鉴定[16-18]。
1.2.4 真菌的分子生物学鉴定 将纯化的真菌在25 ℃培养2周后，收集新鲜菌丝进行ITS序列分析。参照Zhou等[19]研究方法，采用真菌DNA微量提取试剂盒(Omega公司，D3195-01)提取DNA。ITS序列扩增引物选择真菌ITS区通用引物ITS1-F和ITS4(ITS1-F: CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4:
TCCTCCGCTTATTGATATGC)[20]，由生工生物技术有限公司合成。
通过PCR反应扩增真菌ITS rDNA基因。反应体系20 μL[10 μL Premix
Tap(Sangon Biotech)、0.5 μL ITS4、0.5 μL IFS1-F、1 μL PCR产物和8 μL
ddH2O]。反应条件为95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火25 s，
72 ℃延伸1 min，35个循环；最终72 ℃延伸5 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(100 V，40 min)，采用胶回收试剂盒(OMEGA公司，D2500)进行PCR产物回收。回收产物采用TaKaRa公司pMD18-T试剂盒进行T/A连接并克隆转化。连接反应体系5 μL(2 μL pMD18-T、0.5 μL Insert DNA和2.5 μL Solution
Ⅰ)，37 ℃培养过夜，送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。
将真菌测序所得的ITS序列在NCBI中运用BLAST工具进行比对分析，并从NCBI中下载已知同源序列，用软件MEGA(Version 5.1)进行比对，用Neighbor-Joining法构建系统发育树。使用Maximum Composite Likelihood 方法计算Bootstrap值，估测系统发育树的置信度。
1.2.5 共生真菌的回接 将沙子、蛭石(体积比为1∶1)在121 ℃灭菌60 min，装满体积为0.3 L的花盆中，参考刘茂军等[21]的方法并做适当修改，将分离出的共生真菌回接到巨桉组培苗(来自中国林业科学研究院热带林业研究所)，每株接种20个直径5 mm的菌饼，每组3个重复。将接种好的植株套袋，在组培室内培养(温度25 ℃，湿度60%，光强5 000 Lux)，半个月后取下套袋；定期浇水，2个月后，收获接种苗，检测根系共生真菌的定殖情况并测定侵染率。
2 结果与分析
2.1 共生真菌侵染率统计
观察到尾叶桉、窿缘桉和尾巨桉均能被菌根真菌侵染，其中窿缘桉的AM真菌侵染率最高，达到58.75%，侵染强度14.54%；其次是尾巨桉，AM真菌侵染率为51.33%，侵染强度15.74%；尾叶桉最低，侵染率为48.67%，侵染强度为11.03%(表1)。与AM真菌侵染率相比，ECM真菌的侵染率相对较低，尾叶桉、尾巨桉和窿缘桉3种桉树的ECM真菌侵染率依次为11.03%、13.02%和15.00%，侵染强度为1.64%、1.60%和0.81%(表1)。经方差分析，尾叶桉、窿缘桉和尾巨桉3种桉树AM真菌总侵染率差异不显著(P>0.05)，ECM真菌总侵染率差异也不
显著(P>0.05)。
对3种桉树共生真菌侵染特征观察，发现尾叶桉(图1，A～C)和尾巨桉(图1，D～F)都同时具有AM真菌结构、ECM真菌结构和DSE结构，窿缘桉具有AM真菌结构(图1，G)和ECM真菌结构(图1，H、I)。3种桉树的AM真菌结构和ECM真菌结构都比较明显，典型的深色有隔内生真菌结构在尾叶桉和尾巨桉都有观察到。
尾叶桉、窿缘桉和尾巨桉3种桉树根尖均存在外生菌根的菌套结构(图2)。但3种桉树的外生菌根形态不同，其中尾巨桉为单轴分枝状(图2，A)，窿缘桉为单轴分枝和二叉分枝(图2，B、C)，尾叶桉的菌根形态呈二叉分枝状(图2，D～F)。外生菌根的菌根形态特征是鉴定外生菌根真菌的依据之一，说明外界自然环境下，本研究采样点的尾巨桉和尾叶桉分别与1种外生菌根真菌形成菌根，窿缘桉与2种外生菌根真菌形成菌根。
表1 桉树根系菌根真菌侵染状况Table 1 The colonization status of
mycorrhizal fungi in Eucalyptus roots宿主植物Host speciesAM真菌 AM
fungiECM真菌 ECM fungi侵染率Fungal colonization/%侵染强度Colonization intensity/%侵染率Fungal colonization/%侵染强度Colonization
intensity/%尾叶桉Eucalyptus
urophylla48.67±9.8711.03±4.4114.00±2.651.64±0.81窿缘桉Eucalyptus
exserta58.75±13.1514.54±11.5215.00±0.000.81±0.67尾巨桉E. urophylla ×
E. grandis51.33±1.1515.74±4.5213.02±1.751.60±0.49
A～C.尾叶桉；D～F. 尾巨桉；G～I.窿缘桉；a. 菌套结构；b. 深色有隔内生真菌；c. 根内菌丝；d. 丛枝结构；e. 泡囊；f. 根外菌丝图1 桉树根系中的菌丝结构A-C.
Eucalyptus urophylla；D-F. E. urophylla × E. grandis；ptus
exserta; a. Mantle；b. Dark septate endophytes；c. Internal hyphae；d.
Arbuscule；e. Vesicle；f. External hyphaeFig.1 Mycelium structure in
Eucalyptus roots
图2 桉树根系外生菌根真菌的形态结构Fig.2 Ectomycorrhizas in Eucalyptus
roots
2.2 桉树共生真菌的形态特征
从3种桉树根系共分离出6株共生真菌，标记为WY1、WY3、WY9、LY1、WJ1、WJ5。在PDA培养基上培养20 d，形成的菌落颜色呈白色、淡黄色或者深灰色；形状为圆形或椭圆形；菌丝致密或稀疏(图3)；其中WY1生长速度最快，25℃恒温培养20 d菌落直径为9 cm，最快长满平板；其次为WY3、WJ5和LY1，菌落直径分别为8.5 cm、8.6 cm和9 cm；WY9和WJ1则生长比较缓慢，菌落直径为5.4 cm和4.4 cm。插片培养的盖玻片置于载玻片上，显微镜观察的菌丝形态(图4)，菌落特征和形态特征描述见表2。
从PDA培养基的菌落特征(图3)以及显微镜下的菌丝形态观察(图4)，可以看出WJ5、WY3、WY9和LY1的菌落颜色呈深色，菌丝有隔，都具有典型的深色有隔内生真菌的特征，初步推断为DSE。而WY1和WJ1的菌落呈白色，菌丝无色，推测属于担子菌亚门(Basidiomycotina)。参照真菌形态和分类描述的特征，鉴定出WY3为茎点霉属(Phoma sp.)，WY9为镰刀霉属(Fusarium sp.)，LY1为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)，WY1为小皮伞属(Marasmius sp.)，WJ1为裸脚伞属(Gymnopus sp.)，WJ5为伞状霉属(Umbelopsis sp.)。
A. WY1；B. WY3；C. WY9；D. WJ1；E. WJ5；F. LY1图3 分离菌株在PDA培养基上生长20 d后的菌落形态Fig.3 The isolated fungus colonies on PDA
medium after 20 days
A. WY1；B. WY3；C～D. WJ5；E～G. LY1；H. WJ1；I. WY9图4 分离的真菌的菌丝和孢子形态Fig.4 The mycelium and spore morphology of isolated
fungi
2.3 共生真菌的分子鉴定
提取根系共生真菌DNA后，利用引物ITS1-F和ITS4，对提取的DNA菌液进行PCR扩增，在凝胶成像系统中看到清晰的条带(图5)。将真菌测序所得的ITS序列提交到GenBank数据库后，在线运用BLAST工具进行比对，结果显示：WY1和WJ1与GenBank中的JN943601.1和MF100988.1菌株有95%以上的相似度，结合形态特征确定它们为担子菌亚门中不同属的2种外生菌根真菌，分别为三色小皮伞菌(M. tricolor)和黑柄裸脚伞(G. melanopus)；WY3、WY9、WJ5和LY1分别与GenBank中茎点霉属、镰刀霉属、二型伞霉(U. dimorpha)和芒弗里亚拟盘多毛孢(P. mangifolia)有94%以上的相似度(表3)。
将真菌测序所得的ITS序列提交到GenBank数据库，运用BLAST工具进行比对，并从NCBI下载GenBank数据库内已知同源序列，用软件MEGA(Version 5.1)进行对比分析，用Neighbor-Joining法构建系统发育树(图6)，可以看到，6株真菌(红色☆标出)分为3个类群，隶属于担子菌亚门、接合菌亚门(Zygomycotina)和半知菌亚门(Deuteromycotina)。其中担子菌亚门单独成一类群，包括WY1和WJ1；接合菌亚门包括WJ5；WY3、WY9和LY1同属半知菌亚门，其中LY1和WY9有极高的相似度。
表2 真菌菌落特征和形态特征Table 2 The characteristics of colonies and
morphology菌株编号Strain No.菌落特征Character of colonies培养20 d后菌落直径20 days old colony of isolated fungi/cm形态特征Character of
mycelium and sporeWY1菌落呈白色,绒毛状,生长速度快,菌落环纹不明显The
colony was white and villous. It grew fast and the colony rings were not
obvious9.0菌丝无色,无隔,直径约3 μm;孢子无色或近无色The mycelium was
colorless and aseptate. The di-ameter was about 3 μm; The spores were
nearly colorlessWY3菌落呈黄棕色,细绒状,生长速度较快,菌落环纹均匀The
colony was yellow-brown and villous. It grew a little fast and the colony
rings were uniform8.5菌丝通直,深色有隔,直径2～4 μm;孢子小,近球形The
mycelium was straight with dark septa. The diameter was about 2-4 μm;
The spores were small and nearly sphericalWY9菌落呈淡黄棕色,绒毛状,生长速度缓慢,菌落环纹不明显The colony was yellow-brown and villous. It grew
slowly and the colony rings were not obvious5.4菌丝细长而直,深色有隔,分枝,直径3～4 μm;分生孢子镰刀形或者梭形The mycelium was straight with dark
septa and branches. The diameter was about 3-4 μm; The spores were
sickle or spindleWJ1菌落白色,细绒状,生长速度缓慢,菌落环纹不明显The
colony was white and villous. It grew slowly and the colony rings were not
obvious4.4菌丝白色,直径2～3 μm;未见孢子The mycelium was white and
the diameter was a-bout 2-3 μm; The spores were not foundWJ5菌落土黄褐色,菌丝致密,生长速度快,外围菌落环纹明显The colony was yellow-brown
like soil with dense mycelium. It grew fast and the outer colony rings were
obvious9.0菌丝深色有隔,直径3～4 μm;孢子圆球形、椭圆形或不规则The
mycelium was dark and septate. The diame-ter was about 3-4 μm; The
spores were spheri-cal, elliptical or irregularLY1菌落呈深灰色,有粉状物,菌丝致密,菌落环纹密集The colony was dark gray with powder and dense
mycelium. The colony rings were dense9.0菌丝通直,深色有隔,直径3～5 μm;分生孢子纺锤形或圆球形,多孢The mycelium was straight with dark septa.
The diameter was about 3-5 μm; The spores were spindle or spherical
表3 桉树根系共生真菌rDNA ITS序列Blast比对结果Table 3 Blast results of
symbiotic fungus rDNA ITS in Eucalyptus roots菌株编号Strain k相似菌株Nearest type strain相似菌株GenBank登录号Accession No.相似度
Identity/%WY1三色小皮伞菌Marasmius tricolor三色小皮伞菌Marasmius
tricolorJN943601.1KX058070.19595WY3茎点霉属Phoma sp.茎点霉属Phoma 367549.1GU183116.19895WY9镰刀霉属Fusarium sp.镰刀霉属Fusarium 059845.1KM979804.19999WJ1黑柄裸脚伞Gymnopus
melanopus黑柄裸脚伞Gymnopus melanopusMF100988.1NR
137539.19999WJ5二型伞霉Umbelopsis dimorpha伞状霉属Umbelopsis
206664.1JQ912671.19999LY1芒弗里亚拟盘多毛孢Pestalotiopsis
mangifolia拟盘多毛孢属Pestalotiopsis 204660.1JQ905644.19496
图5 分离真菌DNA的PCR产物1%琼脂凝胶电泳Fig.5 PCR products of
isolated fungi on 1% agar gel electrophoresis
综合形态特征和ITS序列分析，确定6种真菌隶属3亚门5目6科6属。其中，半知菌亚门、瘤座孢菌目(Tuberculariales)、瘤座孢菌科(Tuberculariaceae)、镰刀霉属，分离自尾叶桉；球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科(Sphaerioidaceae)、茎点霉属，分离自尾叶桉；黑盘孢菌目(Melanconiales)、黑盘孢菌科(Melanconiaceae)、拟盘多毛孢属、芒弗里亚拟盘多毛孢，分离自窿缘桉。担子菌亚门、伞菌目(Agaricales)、小皮伞科(Marasmiaceae)、裸脚伞属、黑柄裸脚伞，分离自尾巨桉；白蘑科(Tricholomataceae)，小皮伞属、三色小皮伞菌，分离自尾叶桉。接合菌亚门、毛霉目(Mucorales)、伞状霉科(Mucoraceae)、伞状霉属、二型伞霉，分离自尾巨桉。
图6 基于18S rDNA ITS序列构建的系统发育树Fig.6 Neighbor-joining
phylogenetic tree based on 18S rDNA ITS sequences
A～B. 三色小皮伞菌；C～D. 芒弗里亚拟盘多毛孢；E～F. 二型伞霉；G. 镰刀霉属；H. 黑柄裸脚伞；I. 茎点霉属a. 根外菌丝；b. 深色有隔内生真菌；c. 微菌核；d. 根内菌丝图7 分离的真菌在回接根系上形成的菌丝结构A-B. M. tricolor；C-D. P.
mangifolia；E-F. U. dimorpha；G. Fusarium sp.；H. G. melanopus；I.
Phoma sp.a. External hyphae；b. Dark septate endophytes；c.
Microsclerotia；d. Internal hyphaeFig.7 Mycelium structures of isolated
fungi formed in re-inoculated roots after 60 days
A～D.三色小皮伞菌；E、F.黑柄裸脚伞图8 回接根系上的外生菌根形态A-D. M.
tricolor; E-F. G. melanopusFig.8 Ectomycorrhizas formed in re-inoculated
roots of Eucalyptus after 60 days
2.4 真菌回接桉树的侵染效应
2.4.1 真菌与桉树共生效应 6种真菌回接巨桉组培苗后菌丝侵染情况显示，茎点霉属、镰刀霉属、二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢4种真菌形成深色有隔菌丝和微菌核(microsclerotia)结构(图7)，推测它们为DSE，微菌核丰富度分别为46.8%、42.3%、56.7%和62.3%。三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞2种真菌形成外生菌丝及菌套结构，确定为桉树外生菌根真菌(图8)。
2.4.2 回接后侵染率统计 6种真菌回接无菌巨桉组培苗，测定侵染率发现，6种真菌均能在巨桉根内侵染，其中茎点霉属的侵染率最高(52.2%)，其次为黑柄裸脚伞(侵染率为45.3%)，三色小皮伞菌、镰刀霉属、二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢的侵染率分别为30%、32.2%、33.2%和22.1%。
3 讨 论
桉树是典型的既可以形成丛枝菌根(AM)，又可以形成外生菌根(ECM)的树种[5]，甚至外生菌根、丛枝菌根和两者混合菌根同时存在[22]，本研究在尾叶桉、窿缘桉和尾巨桉3种桉树除了观察到有ECM结构和AM真菌结构，同时，在尾叶桉和尾巨桉中还观察到典型的深色有隔内生真菌结构，说明桉树菌根真菌具有多样性，不仅是前人报道的可以与AM真菌、ECM真菌形成混合菌根，还可以和DSE形成共生体系。
本研究在桉树根系中首次报道2种ECM真菌，三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞。弓明钦等[23]对华南地区桉树ECM真菌的调查发现11种，优势菌为多根硬皮马勃(Scleroderma polyrhizum Pers)；朱天辉等[11]和梁洪萍[12]分别发现四川桉树有17种ECM真菌，都与本次分离到的2种ECM真菌不同，不同树种、不同生态环境会影响菌根真菌的种类和多样性。三色小皮伞菌具有产漆酶的特性，漆酶属于木质素降解酶类，可参与植物细胞壁的形成，还可去木质素，在环境修复、农业生产等领域用途广泛[24]；黑柄裸脚伞为中国新纪录种[25]，其生物学特性有待进一步研究。
在桉树根系中分离得到4种内生真菌，回接后均观察到DSE典型的深色有隔菌丝和微菌核结构，推测它们为桉树根系中的DSE，有待于进一步的研究。茎点霉属、拟盘多毛孢属和镰刀霉属是桉树中具有一定抗菌作用的内生真菌[26]，谢玲等[27]在甘蔗(Saccharum officinarum)根围发现深色有隔内生真菌茎点霉属，韦继光[28]从南山茶(Camellia semiserrata)和短叶罗汉松(Podocarpus macorphyllus)中分离出芒弗里亚拟盘多毛孢；格希格图等[29]在桉树根系中发现镰刀菌(Fusarium)的存在，徐超等[30]发现二型伞霉可提高铁皮石斛生长速度和增强抗旱能力。
参考文献:
【相关文献】
[1] 任忠秀, 包雪梅, 于家伊, 等. 中国桉树人工林施肥现状、存在问题及对策[J]. 桉树科技, 2013,
30(4): 52-59.
REN Z X, BAO X M, YU J Y, et al. Current status, problems and countermeasures of
Eucalyptus plantation fertilization practices in China[J]. Eucalypt Science and Technology,
2013, 30(4): 52-59.
[2] 苏英吾, 李向阳. 华南土壤肥力特征与桉树施肥[J]. 中南林业调查规划, 1997,(3): 35-38.
SU Y W, LI X Y. Characteristics of soil fertility in south China and fertilization of
Eucalyptus[J]. Central South Forest Inventory Planning, 1997,(3): 35-38.
[3] 张文泉, 闫 伟. 外生菌根菌对樟子松苗木生长的影响[J]. 西北植物学报, 2013, 33(5): 998-1 003.
ZHANG W Q, YAN W. Effect of ectomycorrhizae on the growth of Pinus sylvestris var.
mongolica seedlings[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2013, 33(5): 998-1 003.
[4] 徐 超, 吴小芹. 菌根化马尾松对干旱胁迫的响应及其内源多胺的变化[J]. 西北植物学报, 2009,
29(2): 296-301.
XU C, WU X Q. Drought responses and related endogenous polyamine changes in
mycorrhizaed Pinus massoniana[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2009, 29(2):
296-301.
[5] 弓明钦, 陈应龙, 仲崇禄. 菌根研究及应用[M]. 北京: 中国林业出版社, 1997.
[6] MARINS J F, CARRENHO R, THOMAZ S M. Occurrence and coexistence of AMF and
dark septate fungi in aquatic macrophytes in a tropical river-floodplain system[J]. Aquatic
Botany, 2009, 91: 13-19.
[7] WU L Q, LÜ Y L, MENG Z X, et al. The promoting role of an isolate of dark-septate
fungus on its host plant Saussurea involucrata Kar. et Kir[J]. Mycorrhiza, 2010, 20(2): 127-135.
[8] 胡玉金, 高春梅, 刘杏忠, 等. 保护地黄瓜根内和土壤中丛枝菌根真菌和深色有隔内生真菌多样性研究[J]. 菌物学报, 2017, 36(2): 164-176.
HU Y J, GAO C M, LIU X Z, et al. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and dark septate
endophytes in the greenhouse cucumber roots and soil[J]. Mycosystema, 2017, 36(2):
164-176.
[9] MALAJCZUK N, GARBAYE J. Infectivity of Pine and Eucalypt isolates of Pisolithus
tinctorius on roots of Eucalyptus urophylla in vitro. 1. mycorrhiza formation in model
systems[J]. New Phytologist, 1990, 114: 627-631.
[10] 弓明钦, 陈 羽, 王凤珍, 等. 外生菌根对桉树青枯病的防治效应[J]. 林业科学研究, 1999, 12(4):
339-345.
GONG M Q, CHEN Y, WANG F Z, et al. The control effect of ectomycorrhizal fungi on
Pseudomonas solanacearum of Eucalyptus[J]. Forest Research, 1999, 12(4): 339-345.
[11] 朱天辉, 张 健, 胡庭兴, 等. 四川桉树外生菌根真菌的研究[J]. 四川农业大学学报, 2001, 19(2):
137-140.
ZHU T H, ZHANG J, HU T X, et al. Study on ectomycorrhizal fungi of Eucalypt[J]. Journal of
Sichuan Agricultural University, 2001, 19(2): 137-140.
[12] 梁洪萍. 四川巨桉外生菌根研究[D]. 四川雅安: 四川农业大学, 2010.
[13] PHILLIPS J M, HAYMAN D S. Improved procedures for clearing and staining parasitic
and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J].
Transactions of the British Mycological Society, 1970, 55: 158-161.
[14] TROUVELOT A, KOUGH J L, GIANINAZZI-PEARSON V. Mesure du taux de
mycorhization VA d’un systeme radiculaire. Recherche de methodes d’estimation ayant
une signification fonctionnelle[M]. Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae.
Paris, France: INRA, 1986: 217-221.
[15] 杨 勇. 放线菌气生菌丝插片培养方法[J]. 生物学通报, 1987,(11): 41,27.
YANG Y, Cultivation method of aerial hyphae of actinomycetes[J]. Bulletin of Biology,
1987,(11): 29,43.
[16] 戴芳澜. 真菌的形态和分类[M]. 北京: 科学出版社, 1987.
[17] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1979.
[18] 邵力平, 沈瑞祥, 张素轩, 等. 真菌分类学[M]. 北京: 中国林业出版社, 1983.
[19] ZHOU J Z, BRUNS M A, TIEDJE J M. DNA recovery from soils of diverse composition[J].
Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(2): 3 216-3 221.
[20] WHITE T J, BRUNS T, LEE S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes for phylogenetics[J]. PCR Protocols: A guide to Methods and
Applications, 1990, 18: 315-322.
[21] 刘茂军, 李 涛, 赵之伟. 一种快速建立DSE与植物共生培养体系的方法及其应用, CN
101263778 A[P]. 2008.
[22] 朱天辉, 张 健, 胡庭兴, 等. 四川桉树菌根类型及林分密度对菌根真菌的影响[J]. 四川农业大学学报, 2001, 19(3): 222-224.
ZHU T H, ZHANG J, HU T X, et al. Effects of mycorrhiza types and stand density on
mycorrhizal fungi of Eucalyptus in Sichuan[J]. Journal of Sichuan Agricultural University,
2001, 19(3): 222-224.
[23] 弓明钦, 陈 羽. 华南地区松、桉树种外生菌根调查[J]. 林业科学研究, 1991,(3): 323-327.
GONG M Q, CHEN Y. Investigation of ectomycorrhiza species of Pine and Eucalyptus in
South China[J]. Forest Research, 1991,(3): 323-327.
[24] 芦光新, 陈秀蓉, 王军邦, 等. 高寒草地土壤三色小皮伞菌产漆酶特性的研究[J]. 草地学报, 2014,
22(5): 1 080-1 085.
LU G X, CHEN X R, WANG J B, et al. Producing laccase-characteristics of Maresmius
tricolor isolated from the soil of alpine meadow[J]. Acta Agrestia Sinica, 2014, 22(5): 1
080-1 085.
[25] 邓树方. 中国南方裸脚伞属分类暨小皮伞科真菌资源初步研究[D]. 广州: 华南农业大学, 2016.
[26] 单体江, 王小晴, 毛子翎, 等. 桉树内生真菌及其抗菌活性最新进展[C]// 中国植物保护学会第十二次全国会员代表大会暨学术年会, 2017.
[27] 谢 玲, 刘 斌, 覃丽萍, 等. 甘蔗根围深色有隔内生真菌(DSE)的分离及接种效应[J]. 西南农业学报,
2014, 27(2): 635-640.
XIE L, LIU B, QIN L P, et al. Isolation and inoculation effect of dark septate endophytes
(DSE) from sugarcane rhizosphere[J]. Southwest China Journal of Agricultural Science,
2014, 27(2): 635-640.
[28] 韦继光. 罗汉松科、山茶科和红豆杉科植物内生拟盘多毛孢的多样性及拟盘多毛孢属分子系统学研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2004.
[29] 格希格图, 胡鸢雷, 慈忠玲, 等. 桉树根部内生菌与青枯病相关关系研究[J]. 林业科技通讯,
2009,(8): 42-43.
GE X G T, HU Y L, CI Z L, et al. Study on the relationship between endophyte and
Pseudomonas solanacearum in Eucalyptus Root[J]. Journal of Forestry Science and
Technology, 2009,(8): 42-43.
[30] 徐 超, 史 俊, 席刚俊, 等. 一种二型伞霉及其在铁皮石斛促生与抗旱中的应用, CN 104195054
B[P]. 2016.