2024年5月11日发(作者：夏颉)
产铁载体PGPR菌筛选及其对病原菌的拮抗作用
荣良燕;姚拓;赵桂琴;柴强;席琳乔;王小利
【摘 要】By adopting improved CAS methods, the strains antagonistic
against plant pathogens were firstly screened from the 16 PGPR strains,
and the antagonistic experiments were then conducted by using 5 PGPR
strains to 3 types of plant pathogens using plate results
showed that LHS11 had the best inhibitory effects on Fusarium oxysporum
rinum and rum , vith the inhibition ratio
over 80％; the inhibition ratio of 191 against rum
rinum was 74％.The inhibitory effects of LHS11 and 191 on
Rhizoctonia solani were similar ( 64％ and 65％, respectively).Both 191 and
LHS11 could be used as PGPR biocontrol agents with good inhibitory
effects and high application potential.%采用改进的CAS定性、定量方法,从
16株PGPR菌株中初步筛选出具有抗病原真菌作用的菌株,再利用平板对峙法将筛
选出的5株PGPR菌与3种病原真菌进行拮抗试验.结果表明,LHSll对黄瓜枯萎病
菌(Fusarium oxysporUTh rinum),西瓜枯萎病菌(Fusarium
oxysporum )的抑制效果最好,抑菌率达到80%以上;其次是191对黄
瓜枯萎病菌,抑菌率为74%,LHSll、191对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抑制
效果相近,抑菌率分别为64%和65%.191和LHSll是抑菌效果较好的生防PGPR
菌株,具有较好的应用潜力.
【期刊名称】《植物保护》
【年(卷),期】2011(037)001
【总页数】6页(P59-64)
【关键词】产铁载体菌;CAS检测;拮抗作用;病原真菌;PGPR菌株
【作 者】荣良燕;姚拓;赵桂琴;柴强;席琳乔;王小利
【作者单位】甘肃农业大学草业学院,兰州,730070;草业生态系统教育部重点实验
室,兰州,730070;甘肃农业大学草业学院,兰州,730070;草业生态系统教育部重点实
验室,兰州,730070;甘肃农业大学草业学院,兰州,730070;草业生态系统教育部重点
实验室,兰州,730070;甘肃农业大学农学院,兰州,730070;塔里木大学动物科技学院,
阿拉尔,843300;贵州省草业研究所,独山,558200
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93
促进植物生长菌(plant growth promoting rhizobacteria,简称PGPR)是指自由生
活在土壤或附生于植物根、茎、叶的一类可促进植物生长及其对矿质营养吸收和利
用,并能抑制有害微生物的有益菌类[1]。铁元素虽在地壳中含量较高,但由于地球的
富氧环境,铁的氧化物以溶解度极低的形式存在,不易直接被植物吸收利用。铁载体
(siderophores)是一类具有很强的特异螯合Fe3+(螯合系数可达1 020～1 030)的
小分子(1～2 ku)化合物[2-3],许多植物根际微生物可通过合成这类物质来摄取环境
中的铁,并将多余的铁提供给植物利用,可以与植物根际铁载体产量很小的有害病原
菌竞争铁元素,进而抑制有害微生物的生长和繁殖[4]。目前应用最为普遍的细菌铁
载体检测方法是Schwyn与Neilands于1987年建立的CAS检测体系
(chromeazurol sulfonate assay),适用于许多不同类型铁载体的检测[5],且CAS
染液对G-细菌毒性较小,还能用于G-细菌铁载体固体平板检测[6]。本研究利用改
进的CAS检测方法[6]从16株PGPR菌株中选出具有铁载体分泌能力的菌株,并与
植物病原真菌进行拮抗作用测定,以期筛选出较强抗病的促生菌株,服务于农业生产。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 LB培养基配方
1 L培养基中含：葡萄糖10 g,酵母膏5 g,NaCl 5～10 g,琼脂 15～20 g,pH7.0。
1.1.2 SA液体培养基配方
1 L培养基中含：蔗糖 20.0 g、L-天门冬酰胺2.0 g、K2HPO40.5 g、
MgSO4◦7H2O 0.5 g;8-羟基喹啉除铁后,无外加铁离子,其本底铁离子浓度约为
0.16 μ mol/L,pH7.0[7] 。
1.1.3 CAS检测平板配方
CAS染液配制：1 mmol/L CAS(铬天青),0.1 mmol/L FeCl3,4 mmol/L十六烷基
三甲基溴化胺(HDTMA)[5,8],0.1 mol/L磷酸盐缓冲液,pH6.8[6]。
0.1 mol/L磷酸盐缓冲液pH6.8的配制：每100 mL含Na2HPO4◦12H2O 2.427
g,NaH2PO4◦2H2O 0.590 5 g,KH2PO40.075 g,NH4Cl 0.250 g,NaCl 0.125 g,
使用时10倍稀释[6]。
CAS检测平板的配制：每100 mL含20%蔗糖溶液1 mL,10%酸水解酪素3 mL,1
mmol/L CaCl2 100 μ L,1 mmol/L MgSO42 mL,琼脂 1.8 g[6] 。
在约60℃时缓慢加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液和CAS染液各5 mL,混合均匀即得
蓝色检测平板[6]。所有溶液均用去离子水配制,具体用量视所需制备平板个数及所
需药品含量换算后添加,可以将用量少的溶液先制成母液而后在使用时定容至所需
浓度。定性定量试验中所用玻璃器皿均用6 mol/L的HCl浸泡并用蒸馏水冲洗数
遍进行脱铁处理。
1.1.4 PDA固体培养基配方
1 L培养基中含：马铃薯200 g,葡萄糖15～20 g,琼脂17～20 g。
1.1.5 PGPR菌株
从兰州三叶草、苜蓿和燕麦根际筛选出具溶磷、固氮和分泌植物生长激素特性的细
菌。编号为191,92,170,LS1-1,LS1-2,LS3,LS13,LHS4-1,LHS4-
2,LHS8,LHS9,LHS11,LHS14,LH11,LH13-3,LM4-3,由甘肃农业大学草业学院草地
微生物多样性实验室提供。
1.1.6 病原真菌
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum
rinum),西瓜枯萎病菌(rum ),由甘肃农业大学草
业学院植病系徐秉良教授、陈秀蓉教授提供。
1.2 方法
1.2.1 铁载体定性检测方法
将保存在LB斜面上的PGPR菌株转接到LB平板上培养24～48 h后,采用点接种
法,用灭菌的牙签将菌种接在CAS固体检测平板上,一皿4个点,一个菌3个重复,28℃
培养48 h,并在培养箱中放盛有水的烧杯2个以保持一定的湿度。经过培养的CAS
检测平板上,分泌铁载体的细菌菌落周围会出现明显的橙色铁载体晕圈。经观察后
每个平板上菌落形态有差别,晕圈大小和颜色深浅不同,观察平板上橙黄色透明圈的
产生和大小、颜色,并记录。同时,通过计算晕圈比例,即可溶性指数[9],来对其分泌
铁载体能力进行比较分析,以判断产铁载体能力强的菌株。
图1 可溶性指数的计算方法
1.2.2 定量检测方法
用铂金丝接种新鲜菌种于限铁SA液体(0.16 μ mol/L FeCl3)培养基中,28 ℃摇床
培养(150 r/min)48 h;菌悬液经10 000 r/min离心15 min,取上清液,菌液和CAS
检测液1∶1的体积充分混匀,静止1 h后,测定630 nm[10]波长处的吸光值(As),取
双蒸水作为对照调零,以同法测定的未接种的SA液体培养基的吸光值作为参比值
(Ar),并按Machuca和Miliagres的方法[11]计算铁载体活性单位([(Ar-
As)/Ar]×100)。
1.2.3 产铁载体菌与病原真菌拮抗作用测定
将定性和定量检测筛选出的优良菌株,采用平板对峙法测定其与病原真菌的拮抗作
用。将保存在PDA斜面上的病原真菌接种到PDA平板上,25℃培养5～7 d。细菌
接种在LB液体培养基中,150 r/min,培养48 h,细菌菌液浓度 106μ g/mL备用。
再将真菌与细菌同时接种在PDA平板上,平板中心接种真菌,菌饼直径为6 mm;距
中心1.7～1.8 cm处接种细菌,采用滴下法(即用加液枪,将菌液垂直滴加在培养基平
面上),每种组合3个重复。25℃培养6 d,测量真菌距细菌远端和近端的半径。
2 结果与分析
2.1 产铁载体PGPR菌初选
固体CAS培养基呈现天蓝色的固态胶状,通过点接种培养得到菌落,当细菌分泌铁载
体时会在菌落周围形成黄色晕圈(图2),与蓝色形成对比,其产生黄色晕圈越大,说明
该菌株产铁载体能力越强。本研究的16株PGPR菌株在CAS检测平板上菌落大
小及产铁载体情况见表1。
图2 PGPR菌产铁载体的初选(图为菌株LHS11)
表1 CAS检测平板上菌落大小、晕圈直径及其他特征1)1)“-”代表细菌在蓝色定
性培养基上不生长,无明显特征。编号 菌株号 菌落直径/mm 晕圈直径/mm 颜色
可溶性指数 特征1 191 2.98 7.97 淡橘黄色 2.67 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较
明显2 92 2.26 9.63 淡橘黄色 3.68 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较明显3 170
3.49 7.23 淡橘黄色 2.07 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色不加深4 LS1-1 2.28 4.23 淡
橘黄色 1.86 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色不加深5 LS1-2 6.08 13.70 橘黄色 2.25 生
长旺盛,橘黄圈周围蓝色不加深6 LS3 - - - - -7 LS13 8.10 12.15 橘黄色 1.50 生长
旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较明显8 LHS4-1 - - - - -9 LHS4-2 - - - - -10 LHS8 - -
- - -11 LHS9 5.37 9.97 橘黄色 1.86 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较明显12
LHS11 3.00 9.00 橘黄色 3.00 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较明显13 LHS14 - -
- - -14 LH11 - - - - -15 LH12-3 3.18 7.50 橘黄色 2.36 生长旺盛,橘黄圈周围蓝
色不加深16 LM4-3 - - - - -
从表1可看出,16株被测菌株中有9株在CAS检测平板上可以生长并产生橘黄色
晕圈,晕圈从大到小分别为 LS1-2、LS13、LHS9、92、LHS11、191、LH12-3、
170 和 LS1-1。晕圈颜色深浅不一,橘黄圈周围的蓝色也深浅不同。同时计算可溶
性指数,值越大,其分泌的铁载体在培养基中的分布范围越大,即其在相同培养条件和
时间下产生铁载体能力越强。本研究供试菌株中可溶性指数＞2,从大到小依次为
92,LHS11,191,LH12-3,LS1-2和170(表1)。
2.2 产铁载体PGPR菌复选
由于定性测定是根据晕圈直径、可溶性指数和晕圈颜色等指标进行的,该方法存在
一定的局限性,如有的菌株的菌落较小但是其产生的变色晕圈的范围大,具有在相对
较短的时间内产生较多铁载体的能力,如：92、LHS11。有的菌落大小与一般产铁
载体细菌菌落无明显差异但是其分泌能力稍强于该样中其他各菌,如 191、LH12-3、
LS1-2、170。因此 ,为了较为准确测定其产铁载体的能力,对可溶性指数＞2的菌
株进行了定量复选,其结果见表2。
表2 各离心菌样在630 nm波长处的吸光值及铁载体活性单位编号 菌株号 630
nm吸光值 (Ar-As)/Ar 1 191 0.349 -0.048 2 92 0.359 -0.078 3 170 0.235
0.294 5 LS1-2 1.106 -2.321 12 LHS11 0.446 -0.339 15 LH12-3 0.403 -0.210
CK CK 0.333 -
细菌分泌的铁载体用CAS检测液检测时,在630 nm处的光吸收值最大,因此测定
A630 nm值的大小可以很好地反映溶液中铁载体的含量,A630 nm值越大则铁载
体含量越高,反之亦然。根据所测数据的大小可判断出各个菌分泌铁载体能力的大
小,其顺序为 LS1-2＞LHS11＞LH12-3＞92＞191＞170(表2)。但是CAS检测液
的吸收值在不同pH条件下极易产生偏差[12],而细菌培养液样品pH变化较大,所
以使得所测数据偏差较大。该种检测方法对铁载体的定量可以通过 A/Ar值的降低
来衡量。A/Ar代表样品中铁载体的相对含量,该值越低,表明铁载体含量越高,从小
到大依次为 LS1-2＞LHS11＞LH12-3＞92＞191＞170(表2)。
2.3 产铁载体菌与病原真菌拮抗作用测定
将5株经过定性、定量检测产铁载体量较高的PGPR菌株与3株供试病原真菌分
别进行拮抗作用测定,第3、6天测量真菌距细菌远端和近端的半径,细菌对病原真
菌的抑菌率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100%,抑菌率越高,细
菌对真菌的抑制作用越高。进一步计算PGPR菌对3种病原菌的抑菌率,结果见图
3、表3。
图3 PGPR菌与真菌拮抗
表3 PGPR菌与真菌拮抗及抑菌率细菌号 真菌3 d处理菌落半径/mm对照菌落半
径/mm 抑菌率/%6 d处理菌落半径/mm对照菌落半径/mm 抑菌率/%191 立枯
丝核菌 9.7 16.7 42 10.3 29.3 65黄瓜枯萎病菌 8.3 14.0 41 10.0 38.5 74西瓜枯
萎病菌 9.5 9.6 - - 细菌菌落与真菌接触 -92 立枯丝核菌 15.8 15.8 - - 真菌覆盖细
菌菌落 -黄瓜枯萎病菌 14.0 14.0 - - 细菌菌落与真菌接触 -西瓜枯萎病菌 9.5 9.5
- - 细菌菌落与真菌接触 -LS1-2 立枯丝核菌 16.0 16.1 - - 真菌覆盖细菌菌落 -黄
瓜枯萎病菌 13.6 13.6 - - 细菌菌落与真菌接触 -西瓜枯萎病菌 10.5 10.7 - - 细菌
菌落与真菌接触 -LHS11 立枯丝核菌 9.6 17.0 44 10.0 28 64黄瓜枯萎病菌 6.6
13.7 52 7.0 43 84西瓜枯萎病菌 6.3 9.8 36 6.7 36.7 81 LH12-3 立枯丝核菌
16.5 16.5 - - 真菌覆盖细菌菌落 -黄瓜枯萎病菌 13.5 13.5 - - 细菌菌落与真菌接
触 -西瓜枯萎病菌 9.0 9.2 - - 细菌菌落与真菌接触 -
从表3可以看出,供试PGPR菌株191对立枯丝核菌和黄瓜枯萎病菌、LHS11对立
枯丝核菌、黄瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌均有较好的抑制作用。在3 d时,LHS11
对黄瓜枯萎病菌的抑制作用最好,抑菌率为53%,191对棉花立枯丝核菌、黄瓜枯萎
病菌,LHS11对棉花立枯丝核菌的抑制作用相差不多,在41%～44%之间。5种组合
中,除菌株191和LHS11外,其他3株PGPR对病原菌几乎没有抑制作用。在6 d
时,LHS11对黄瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌的抑制作用最好,达到了 80%以上,其中
LHS11对黄瓜枯萎病菌的抑菌率最高,达到84%。其次是191对黄瓜枯萎病菌,抑
菌率为74%,191和LHS11对立枯丝核菌的抑制作用相差不多,抑菌率为64%～
65%。LHS11对黄瓜枯萎病菌的抑制效果在3 d和6 d时都最好,LHS11对西瓜枯
萎病菌的抑制效果在3 d较低,但到6 d时效果加强,191和LHS11对立枯丝核菌
的抑制作用在3 d时较好,随时间推后作用降低。其余PGPR菌落的边缘与真菌菌
丝接触或真菌菌丝覆盖了其菌落,说明这3株PGPR菌对提供的3株病原真菌无拮
抗作用。
3 结论
3.1 铁载体分泌能力
16株被测菌株中有9株在CAS检测平板上可以生长并产生橘黄色晕圈,为 LS1-2、
LS13、LHS9、92、LHS11、191、LH12-3 、170 和 LS1-1,初步确定这些PGPR
菌株可以产生铁载体。结合可溶性指数及定量检测中630 nm波长处的吸光值和
铁载体活性单位,测定及计算出产铁载体的能力从大到小的菌株依次为 LS1-2 、
LHS11、LH12-3、92、191。
3.2 产铁载体菌对病原真菌拮抗作用
在平板对峙拮抗试验中菌株191和LHS11对供试的病原真菌均有较好的抑制作用,
其中LHS11对黄瓜枯萎病菌,西瓜枯萎病菌的抑制作用最好,LHS11对黄瓜枯萎病
菌的抑菌率达到了84%。其次是191对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用,抑菌率为74%。
191和LHS11对棉花立枯丝核菌的抑制作用相近,抑菌率在64%～65%之间。
4 讨论
试验中选用了指示性较强的CAS培养基作为产铁载体鉴定、菌筛的首选,当高铁螯
合能力的铁载体从有络天青、铁离子和十六氨基烷基溴化铵形成的CAS蓝色检测
液中夺取了铁离子时,检测液即会发生明显的由蓝到橙的颜色改变,但是络天青在不
同pH条件下会显示出不同的颜色,所以配置的固体培养基选用了改进后的CAS固
体检测培养基,即采用了pH 6.8的磷酸缓冲液代替了原来的MM9缓冲体系
[6],1994年王平[13]采用通用的CAS检测方法检测到了小麦根圈细菌的铁载体分
泌。作者运用类似的方法进行了产铁载体菌的筛选,并对其中效果好的菌株与植物
病原真菌进行拮抗试验,筛选出2株对3种植物病原真菌有抑制作用的生防菌。
某些荧光假单胞杆菌及其产生的拮抗物质可抑制一些植物病原真菌,国内外研究证
实假单胞菌产生的铁载体在防治土传真菌病害方面发挥着重要作用[14]。本试验从
已筛选出的具溶磷、固氮及分泌植物生长激素能力的细菌中继续进行产铁载体能力
的筛选。在定性、定量试验中筛选出5株,将其分别与病原真菌进行拮抗试验。在
定量试验中菌株 LS1-2的效果最好,菌株191的效果列最后,但在与病原真菌拮抗试
验中LS1-2的优势却没有显示出来,LHS11和191成为对病原真菌抑制作用最好的
菌株。实际上,细菌对病原真菌的拮抗作用是由其产生的拮抗物质来决定的,铁载体
只是其中可能的一类拮抗物质。从本研究的结果来看,菌株 LS1-2、LH12-3、92
均产生铁载体,但是其无抗病原菌的活性,可以初步得出菌株LS1-2产生铁载体与其
抗菌活性没有必然关系。这一研究结果与Laine等人测定了CAS法对细菌产铁载
体量和拮抗病原菌能力的相关性,发现两者之间并不是正相关,有的细菌产铁载体量
虽然较多,但并非在实际中可以很好地抑制某种病原真菌[15]的结果相似。因此,本
研究中对病原真菌抑制作用最好的菌株(如LHS11和191)其抑菌机理跟产生铁载
体是存在必然联系,还是偶然巧合,抑或另有其他抗菌物质产生尚需做进一步的研究
来证实,相关研究正在进行中。
参考文献
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2024年5月11日发(作者：夏颉)
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【摘 要】By adopting improved CAS methods, the strains antagonistic
against plant pathogens were firstly screened from the 16 PGPR strains,
and the antagonistic experiments were then conducted by using 5 PGPR
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showed that LHS11 had the best inhibitory effects on Fusarium oxysporum
rinum and rum , vith the inhibition ratio
over 80％; the inhibition ratio of 191 against rum
rinum was 74％.The inhibitory effects of LHS11 and 191 on
Rhizoctonia solani were similar ( 64％ and 65％, respectively).Both 191 and
LHS11 could be used as PGPR biocontrol agents with good inhibitory
effects and high application potential.%采用改进的CAS定性、定量方法,从
16株PGPR菌株中初步筛选出具有抗病原真菌作用的菌株,再利用平板对峙法将筛
选出的5株PGPR菌与3种病原真菌进行拮抗试验.结果表明,LHSll对黄瓜枯萎病
菌(Fusarium oxysporUTh rinum),西瓜枯萎病菌(Fusarium
oxysporum )的抑制效果最好,抑菌率达到80%以上;其次是191对黄
瓜枯萎病菌,抑菌率为74%,LHSll、191对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抑制
效果相近,抑菌率分别为64%和65%.191和LHSll是抑菌效果较好的生防PGPR
菌株,具有较好的应用潜力.
【期刊名称】《植物保护》
【年(卷),期】2011(037)001
【总页数】6页(P59-64)
【关键词】产铁载体菌;CAS检测;拮抗作用;病原真菌;PGPR菌株
【作 者】荣良燕;姚拓;赵桂琴;柴强;席琳乔;王小利
【作者单位】甘肃农业大学草业学院,兰州,730070;草业生态系统教育部重点实验
室,兰州,730070;甘肃农业大学草业学院,兰州,730070;草业生态系统教育部重点实
验室,兰州,730070;甘肃农业大学草业学院,兰州,730070;草业生态系统教育部重点
实验室,兰州,730070;甘肃农业大学农学院,兰州,730070;塔里木大学动物科技学院,
阿拉尔,843300;贵州省草业研究所,独山,558200
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93
促进植物生长菌(plant growth promoting rhizobacteria,简称PGPR)是指自由生
活在土壤或附生于植物根、茎、叶的一类可促进植物生长及其对矿质营养吸收和利
用,并能抑制有害微生物的有益菌类[1]。铁元素虽在地壳中含量较高,但由于地球的
富氧环境,铁的氧化物以溶解度极低的形式存在,不易直接被植物吸收利用。铁载体
(siderophores)是一类具有很强的特异螯合Fe3+(螯合系数可达1 020～1 030)的
小分子(1～2 ku)化合物[2-3],许多植物根际微生物可通过合成这类物质来摄取环境
中的铁,并将多余的铁提供给植物利用,可以与植物根际铁载体产量很小的有害病原
菌竞争铁元素,进而抑制有害微生物的生长和繁殖[4]。目前应用最为普遍的细菌铁
载体检测方法是Schwyn与Neilands于1987年建立的CAS检测体系
(chromeazurol sulfonate assay),适用于许多不同类型铁载体的检测[5],且CAS
染液对G-细菌毒性较小,还能用于G-细菌铁载体固体平板检测[6]。本研究利用改
进的CAS检测方法[6]从16株PGPR菌株中选出具有铁载体分泌能力的菌株,并与
植物病原真菌进行拮抗作用测定,以期筛选出较强抗病的促生菌株,服务于农业生产。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 LB培养基配方
1 L培养基中含：葡萄糖10 g,酵母膏5 g,NaCl 5～10 g,琼脂 15～20 g,pH7.0。
1.1.2 SA液体培养基配方
1 L培养基中含：蔗糖 20.0 g、L-天门冬酰胺2.0 g、K2HPO40.5 g、
MgSO4◦7H2O 0.5 g;8-羟基喹啉除铁后,无外加铁离子,其本底铁离子浓度约为
0.16 μ mol/L,pH7.0[7] 。
1.1.3 CAS检测平板配方
CAS染液配制：1 mmol/L CAS(铬天青),0.1 mmol/L FeCl3,4 mmol/L十六烷基
三甲基溴化胺(HDTMA)[5,8],0.1 mol/L磷酸盐缓冲液,pH6.8[6]。
0.1 mol/L磷酸盐缓冲液pH6.8的配制：每100 mL含Na2HPO4◦12H2O 2.427
g,NaH2PO4◦2H2O 0.590 5 g,KH2PO40.075 g,NH4Cl 0.250 g,NaCl 0.125 g,
使用时10倍稀释[6]。
CAS检测平板的配制：每100 mL含20%蔗糖溶液1 mL,10%酸水解酪素3 mL,1
mmol/L CaCl2 100 μ L,1 mmol/L MgSO42 mL,琼脂 1.8 g[6] 。
在约60℃时缓慢加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液和CAS染液各5 mL,混合均匀即得
蓝色检测平板[6]。所有溶液均用去离子水配制,具体用量视所需制备平板个数及所
需药品含量换算后添加,可以将用量少的溶液先制成母液而后在使用时定容至所需
浓度。定性定量试验中所用玻璃器皿均用6 mol/L的HCl浸泡并用蒸馏水冲洗数
遍进行脱铁处理。
1.1.4 PDA固体培养基配方
1 L培养基中含：马铃薯200 g,葡萄糖15～20 g,琼脂17～20 g。
1.1.5 PGPR菌株
从兰州三叶草、苜蓿和燕麦根际筛选出具溶磷、固氮和分泌植物生长激素特性的细
菌。编号为191,92,170,LS1-1,LS1-2,LS3,LS13,LHS4-1,LHS4-
2,LHS8,LHS9,LHS11,LHS14,LH11,LH13-3,LM4-3,由甘肃农业大学草业学院草地
微生物多样性实验室提供。
1.1.6 病原真菌
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum
rinum),西瓜枯萎病菌(rum ),由甘肃农业大学草
业学院植病系徐秉良教授、陈秀蓉教授提供。
1.2 方法
1.2.1 铁载体定性检测方法
将保存在LB斜面上的PGPR菌株转接到LB平板上培养24～48 h后,采用点接种
法,用灭菌的牙签将菌种接在CAS固体检测平板上,一皿4个点,一个菌3个重复,28℃
培养48 h,并在培养箱中放盛有水的烧杯2个以保持一定的湿度。经过培养的CAS
检测平板上,分泌铁载体的细菌菌落周围会出现明显的橙色铁载体晕圈。经观察后
每个平板上菌落形态有差别,晕圈大小和颜色深浅不同,观察平板上橙黄色透明圈的
产生和大小、颜色,并记录。同时,通过计算晕圈比例,即可溶性指数[9],来对其分泌
铁载体能力进行比较分析,以判断产铁载体能力强的菌株。
图1 可溶性指数的计算方法
1.2.2 定量检测方法
用铂金丝接种新鲜菌种于限铁SA液体(0.16 μ mol/L FeCl3)培养基中,28 ℃摇床
培养(150 r/min)48 h;菌悬液经10 000 r/min离心15 min,取上清液,菌液和CAS
检测液1∶1的体积充分混匀,静止1 h后,测定630 nm[10]波长处的吸光值(As),取
双蒸水作为对照调零,以同法测定的未接种的SA液体培养基的吸光值作为参比值
(Ar),并按Machuca和Miliagres的方法[11]计算铁载体活性单位([(Ar-
As)/Ar]×100)。
1.2.3 产铁载体菌与病原真菌拮抗作用测定
将定性和定量检测筛选出的优良菌株,采用平板对峙法测定其与病原真菌的拮抗作
用。将保存在PDA斜面上的病原真菌接种到PDA平板上,25℃培养5～7 d。细菌
接种在LB液体培养基中,150 r/min,培养48 h,细菌菌液浓度 106μ g/mL备用。
再将真菌与细菌同时接种在PDA平板上,平板中心接种真菌,菌饼直径为6 mm;距
中心1.7～1.8 cm处接种细菌,采用滴下法(即用加液枪,将菌液垂直滴加在培养基平
面上),每种组合3个重复。25℃培养6 d,测量真菌距细菌远端和近端的半径。
2 结果与分析
2.1 产铁载体PGPR菌初选
固体CAS培养基呈现天蓝色的固态胶状,通过点接种培养得到菌落,当细菌分泌铁载
体时会在菌落周围形成黄色晕圈(图2),与蓝色形成对比,其产生黄色晕圈越大,说明
该菌株产铁载体能力越强。本研究的16株PGPR菌株在CAS检测平板上菌落大
小及产铁载体情况见表1。
图2 PGPR菌产铁载体的初选(图为菌株LHS11)
表1 CAS检测平板上菌落大小、晕圈直径及其他特征1)1)“-”代表细菌在蓝色定
性培养基上不生长,无明显特征。编号 菌株号 菌落直径/mm 晕圈直径/mm 颜色
可溶性指数 特征1 191 2.98 7.97 淡橘黄色 2.67 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较
明显2 92 2.26 9.63 淡橘黄色 3.68 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较明显3 170
3.49 7.23 淡橘黄色 2.07 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色不加深4 LS1-1 2.28 4.23 淡
橘黄色 1.86 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色不加深5 LS1-2 6.08 13.70 橘黄色 2.25 生
长旺盛,橘黄圈周围蓝色不加深6 LS3 - - - - -7 LS13 8.10 12.15 橘黄色 1.50 生长
旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较明显8 LHS4-1 - - - - -9 LHS4-2 - - - - -10 LHS8 - -
- - -11 LHS9 5.37 9.97 橘黄色 1.86 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较明显12
LHS11 3.00 9.00 橘黄色 3.00 生长旺盛,橘黄圈周围蓝色加深较明显13 LHS14 - -
- - -14 LH11 - - - - -15 LH12-3 3.18 7.50 橘黄色 2.36 生长旺盛,橘黄圈周围蓝
色不加深16 LM4-3 - - - - -
从表1可看出,16株被测菌株中有9株在CAS检测平板上可以生长并产生橘黄色
晕圈,晕圈从大到小分别为 LS1-2、LS13、LHS9、92、LHS11、191、LH12-3、
170 和 LS1-1。晕圈颜色深浅不一,橘黄圈周围的蓝色也深浅不同。同时计算可溶
性指数,值越大,其分泌的铁载体在培养基中的分布范围越大,即其在相同培养条件和
时间下产生铁载体能力越强。本研究供试菌株中可溶性指数＞2,从大到小依次为
92,LHS11,191,LH12-3,LS1-2和170(表1)。
2.2 产铁载体PGPR菌复选
由于定性测定是根据晕圈直径、可溶性指数和晕圈颜色等指标进行的,该方法存在
一定的局限性,如有的菌株的菌落较小但是其产生的变色晕圈的范围大,具有在相对
较短的时间内产生较多铁载体的能力,如：92、LHS11。有的菌落大小与一般产铁
载体细菌菌落无明显差异但是其分泌能力稍强于该样中其他各菌,如 191、LH12-3、
LS1-2、170。因此 ,为了较为准确测定其产铁载体的能力,对可溶性指数＞2的菌
株进行了定量复选,其结果见表2。
表2 各离心菌样在630 nm波长处的吸光值及铁载体活性单位编号 菌株号 630
nm吸光值 (Ar-As)/Ar 1 191 0.349 -0.048 2 92 0.359 -0.078 3 170 0.235
0.294 5 LS1-2 1.106 -2.321 12 LHS11 0.446 -0.339 15 LH12-3 0.403 -0.210
CK CK 0.333 -
细菌分泌的铁载体用CAS检测液检测时,在630 nm处的光吸收值最大,因此测定
A630 nm值的大小可以很好地反映溶液中铁载体的含量,A630 nm值越大则铁载
体含量越高,反之亦然。根据所测数据的大小可判断出各个菌分泌铁载体能力的大
小,其顺序为 LS1-2＞LHS11＞LH12-3＞92＞191＞170(表2)。但是CAS检测液
的吸收值在不同pH条件下极易产生偏差[12],而细菌培养液样品pH变化较大,所
以使得所测数据偏差较大。该种检测方法对铁载体的定量可以通过 A/Ar值的降低
来衡量。A/Ar代表样品中铁载体的相对含量,该值越低,表明铁载体含量越高,从小
到大依次为 LS1-2＞LHS11＞LH12-3＞92＞191＞170(表2)。
2.3 产铁载体菌与病原真菌拮抗作用测定
将5株经过定性、定量检测产铁载体量较高的PGPR菌株与3株供试病原真菌分
别进行拮抗作用测定,第3、6天测量真菌距细菌远端和近端的半径,细菌对病原真
菌的抑菌率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100%,抑菌率越高,细
菌对真菌的抑制作用越高。进一步计算PGPR菌对3种病原菌的抑菌率,结果见图
3、表3。
图3 PGPR菌与真菌拮抗
表3 PGPR菌与真菌拮抗及抑菌率细菌号 真菌3 d处理菌落半径/mm对照菌落半
径/mm 抑菌率/%6 d处理菌落半径/mm对照菌落半径/mm 抑菌率/%191 立枯
丝核菌 9.7 16.7 42 10.3 29.3 65黄瓜枯萎病菌 8.3 14.0 41 10.0 38.5 74西瓜枯
萎病菌 9.5 9.6 - - 细菌菌落与真菌接触 -92 立枯丝核菌 15.8 15.8 - - 真菌覆盖细
菌菌落 -黄瓜枯萎病菌 14.0 14.0 - - 细菌菌落与真菌接触 -西瓜枯萎病菌 9.5 9.5
- - 细菌菌落与真菌接触 -LS1-2 立枯丝核菌 16.0 16.1 - - 真菌覆盖细菌菌落 -黄
瓜枯萎病菌 13.6 13.6 - - 细菌菌落与真菌接触 -西瓜枯萎病菌 10.5 10.7 - - 细菌
菌落与真菌接触 -LHS11 立枯丝核菌 9.6 17.0 44 10.0 28 64黄瓜枯萎病菌 6.6
13.7 52 7.0 43 84西瓜枯萎病菌 6.3 9.8 36 6.7 36.7 81 LH12-3 立枯丝核菌
16.5 16.5 - - 真菌覆盖细菌菌落 -黄瓜枯萎病菌 13.5 13.5 - - 细菌菌落与真菌接
触 -西瓜枯萎病菌 9.0 9.2 - - 细菌菌落与真菌接触 -
从表3可以看出,供试PGPR菌株191对立枯丝核菌和黄瓜枯萎病菌、LHS11对立
枯丝核菌、黄瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌均有较好的抑制作用。在3 d时,LHS11
对黄瓜枯萎病菌的抑制作用最好,抑菌率为53%,191对棉花立枯丝核菌、黄瓜枯萎
病菌,LHS11对棉花立枯丝核菌的抑制作用相差不多,在41%～44%之间。5种组合
中,除菌株191和LHS11外,其他3株PGPR对病原菌几乎没有抑制作用。在6 d
时,LHS11对黄瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌的抑制作用最好,达到了 80%以上,其中
LHS11对黄瓜枯萎病菌的抑菌率最高,达到84%。其次是191对黄瓜枯萎病菌,抑
菌率为74%,191和LHS11对立枯丝核菌的抑制作用相差不多,抑菌率为64%～
65%。LHS11对黄瓜枯萎病菌的抑制效果在3 d和6 d时都最好,LHS11对西瓜枯
萎病菌的抑制效果在3 d较低,但到6 d时效果加强,191和LHS11对立枯丝核菌
的抑制作用在3 d时较好,随时间推后作用降低。其余PGPR菌落的边缘与真菌菌
丝接触或真菌菌丝覆盖了其菌落,说明这3株PGPR菌对提供的3株病原真菌无拮
抗作用。
3 结论
3.1 铁载体分泌能力
16株被测菌株中有9株在CAS检测平板上可以生长并产生橘黄色晕圈,为 LS1-2、
LS13、LHS9、92、LHS11、191、LH12-3 、170 和 LS1-1,初步确定这些PGPR
菌株可以产生铁载体。结合可溶性指数及定量检测中630 nm波长处的吸光值和
铁载体活性单位,测定及计算出产铁载体的能力从大到小的菌株依次为 LS1-2 、
LHS11、LH12-3、92、191。
3.2 产铁载体菌对病原真菌拮抗作用
在平板对峙拮抗试验中菌株191和LHS11对供试的病原真菌均有较好的抑制作用,
其中LHS11对黄瓜枯萎病菌,西瓜枯萎病菌的抑制作用最好,LHS11对黄瓜枯萎病
菌的抑菌率达到了84%。其次是191对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用,抑菌率为74%。
191和LHS11对棉花立枯丝核菌的抑制作用相近,抑菌率在64%～65%之间。
4 讨论
试验中选用了指示性较强的CAS培养基作为产铁载体鉴定、菌筛的首选,当高铁螯
合能力的铁载体从有络天青、铁离子和十六氨基烷基溴化铵形成的CAS蓝色检测
液中夺取了铁离子时,检测液即会发生明显的由蓝到橙的颜色改变,但是络天青在不
同pH条件下会显示出不同的颜色,所以配置的固体培养基选用了改进后的CAS固
体检测培养基,即采用了pH 6.8的磷酸缓冲液代替了原来的MM9缓冲体系
[6],1994年王平[13]采用通用的CAS检测方法检测到了小麦根圈细菌的铁载体分
泌。作者运用类似的方法进行了产铁载体菌的筛选,并对其中效果好的菌株与植物
病原真菌进行拮抗试验,筛选出2株对3种植物病原真菌有抑制作用的生防菌。
某些荧光假单胞杆菌及其产生的拮抗物质可抑制一些植物病原真菌,国内外研究证
实假单胞菌产生的铁载体在防治土传真菌病害方面发挥着重要作用[14]。本试验从
已筛选出的具溶磷、固氮及分泌植物生长激素能力的细菌中继续进行产铁载体能力
的筛选。在定性、定量试验中筛选出5株,将其分别与病原真菌进行拮抗试验。在
定量试验中菌株 LS1-2的效果最好,菌株191的效果列最后,但在与病原真菌拮抗试
验中LS1-2的优势却没有显示出来,LHS11和191成为对病原真菌抑制作用最好的
菌株。实际上,细菌对病原真菌的拮抗作用是由其产生的拮抗物质来决定的,铁载体
只是其中可能的一类拮抗物质。从本研究的结果来看,菌株 LS1-2、LH12-3、92
均产生铁载体,但是其无抗病原菌的活性,可以初步得出菌株LS1-2产生铁载体与其
抗菌活性没有必然关系。这一研究结果与Laine等人测定了CAS法对细菌产铁载
体量和拮抗病原菌能力的相关性,发现两者之间并不是正相关,有的细菌产铁载体量
虽然较多,但并非在实际中可以很好地抑制某种病原真菌[15]的结果相似。因此,本
研究中对病原真菌抑制作用最好的菌株(如LHS11和191)其抑菌机理跟产生铁载
体是存在必然联系,还是偶然巧合,抑或另有其他抗菌物质产生尚需做进一步的研究
来证实,相关研究正在进行中。
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