2024年4月13日发(作者：昌承德)
乙酸与丙酸比对体外瘤胃液挥发性脂肪酸发酵模式和微生物群
体多样性的影响
尹召华;王梦芝;王洪荣;张洁;喻礼怀
【摘 要】本文主要研究乙酸与丙酸比(乙/丙)对体外瘤胃液挥发性脂肪酸发酵模式
及微生物群体多样性的影响.试验以4头瘤胃瘘管山羊提供瘤胃液,设4个处理,培养
底物乙/丙分别为30:70、50:50、70:30和100:0.测定培养液中挥发性脂肪酸的浓
度的变化,并通过单链构象多态性(SSCP)图谱检测细菌和原虫的群体多样性.结果表
明:培养液乙酸浓度以100:0组最高,显著高于其他3组(P＜0.05),50:50组最低；
丙酸浓度以30:70组最高,显著高于50:50和70:30组(P＜0.05)；丁酸的浓度
30:70组显著高于70:30组(P＜0.05)；各组培养液乙/丙均接近3:1,30:70组显著
低于70:30和100:0组(P＜0.05).细菌SSCP图谱显示,50:50组条带数最多,100:0
组条带数最少；原虫的SSCP图谱以100:0组条带数最多,30:70组条带数最少.细
菌、原虫的SSCP图谱皆以50:50和70:30组图谱间相似性指数为高.总之,乙/丙
对培养液挥发性脂肪酸模式、细菌或原虫的群体多样性都存在影响.%This paper
was conducted to investigate the effects of acetate to propionate ratio on
the pattern of volatile fatty acid (VFA) fermentation and diversities of
rumen microorganisms. Four goats fitted with permanent ruminal cannulas
were used to provide rumen fluid for the in vitro study. The four
treatments were set according to the acetate to propionate ratio in culture
substrates, which were 30:70, 50:0, 70:30, and 100:0, respectively. Variation
of VFA concentration was recorded, and diversities of bacteria and
protozoa were investigated by SSCP fingerprint technique. The results
showed as follows: acetate concentration of 100:0 group was the highest
and was significantly higher than that of the other three groups (P < 0. 05) ,
while that of 50:50 group was the lowest. Propionate concentration of
30:70 group was the highest and was significantly higher than that of
groups 50:50 and 70:30 (P <0. 05). Butyrate concentration of 30:70 group
was significantly higher than that of 70:30 group (P <0. 05). Acetate to
propionate ratios in culture medium of all the treatments were close to 3:1,
while that of 30:70 group was significantly lower than that of groups 70:30
and 100:0 ( P <0.05). Bacterial SSCP fingerprint showed that bands number
of 50:50 group was the most, while that of 100:0 group was the least;
protozoa SSCP fingerprint showed that bands number of 100:0 group was
the most, while that of 30:70 group was the least. Similarity index was the
highest between 50:50 group and 70:30 group on both bacteria and
protozoa fingerprints. In conclusion, the VFA pattern and diversities of
rumen bacterial or protozoal community can be modified by acetate to
propionate ratio in vitro.
【期刊名称】《动物营养学报》
【年(卷),期】2011(023)012
【总页数】7页(P2129-2135)
【关键词】瘤胃;细菌;原虫;乙酸、丙酸比;多样性
【作 者】尹召华;王梦芝;王洪荣;张洁;喻礼怀
【作者单位】扬州大学实验农牧场,扬州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬
州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009;扬州大学动物科学与技术
学院,扬州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009
【正文语种】中 文
【中图分类】S826
瘤胃微生物在反刍动物消化生理中至关重要。碳水化合物在反刍动物瘤胃中被微生
物降解为挥发性脂肪酸(VFA)，VFA可提供机体可消化能的70% ～80%［1］。
VFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸等。乙酸、丙
酸和丁酸约占瘤胃发酵VFA总产量的95%，也是机体代谢最为重要的几种VFA。
丁酸在瘤胃液中含量相对较低(10%左右)，而且可由乙酸转化;乙酸和丙酸是饲料在
瘤胃内发酵产生的两大主要有机酸，饲料的种类和微生物的区系不同，发酵产生乙
酸与丙酸比(乙/丙)也不同，如非结构性碳水化合物在瘤胃中的发酵率很高，产生
VFA总量也较多，但乙/丙较低，而粗饲料则相反。因此，瘤胃液乙/丙可反映饲
料在瘤胃中的发酵模式;同时，VFA又为微生物发酵底物和合成微生物蛋白质(MCP)
提供能量和碳架。鉴于微生物生长对底物的选择性［1］，乙/丙也会影响微生物
蛋白质的合成以及不同区系瘤胃微生物(细菌、原虫等)的群体结构，进而影响整个
机体的消化与营养代谢［2］。迄今为止，国内外尚未见通过体外培养研究乙/丙
影响瘤胃微生物VFA发酵模式以及原虫、细菌群体多样性的报道。为此，本研究
设置4种乙/丙进行人工模拟瘤胃体外发酵试验，旨在研究瘤胃液乙/丙对微生物发
酵模式及群体多样性的影响，以期为反刍动物瘤胃微生物营养代谢调控的研究提供
基础性资料。
1 材料与方法
1.1 供瘤胃液动物及瘤胃液的采集
试验在扬州大学实验农牧场进行。选用4只健康、体重(37.6 ±1.3)kg、安装有永
久性瘤胃瘘管的徐淮山羊羯羊作为瘤胃液供体。单圈饲养，以(玉米+豆粕)∶羊草
为30∶70作为饲粮，日给料干物质质量为体重的2%，08:00和20:00分2次等
量饲喂，自由饮水。
通过瘤胃瘘管，利用自制真空负压装置，在晨饲前从4头山羊瘤胃内各采约150
mL瘤胃液，过4层纱布，滤液装于预先通有CO2并39℃预热的灭菌生理盐水瓶
中，将所有瘤胃液混合均匀，39℃水浴保温送回实验室待用。
1.2 试验设计
试验按培养底物乙/丙不同分为4组，A、B、C和 D 组乙/丙分别为 30∶70、
50∶50、70∶30、100∶0，各组能量水平一致。
1.3 体外培养
培养底物配制方法如下:体外培养试验开始前30 min，按表1的体积取乙酸和丙酸
溶于20 mL水中，用1 mol/L NaOH调pH为7.0，再加人工唾液盐(配制参考
Menke等［3］的方法)至80 mL为乙酸、丙酸混合液，39℃水浴待用。
三角瓶经紫外线灭菌30 min后加入1 g酪蛋白;再在各瓶中分别加入按不同比例
混合好的乙酸、丙酸混合液80 mL(预先通CO2至饱和、39℃预热);而后加入瘤胃
液40 mL;塞好橡皮塞，通CO2、39℃、震荡(50 r/min)培养。每组各设3个重复，
另设1个不加底物的(仅含瘤胃液、人工唾液盐)空白对照。体外培养方法参照
Menke等［3］的方法进行。
表1 培养底物的组成及能量水平Table 1 Composition and energy levels of
cultural substrates项目Items 组别Groups A B C D Acetate/propionate
30∶70 50∶50 70∶30 100∶0原料Ingredients乙酸 Acetate/mL 0.283 0.500
0.744 1.174丙酸 Propionate/mL 0.661 0.500 0.319 0.000酪蛋白 Casein
1.000 1.000 1.000 1.000能量水平Energy levels能值 Energy/kJ 17.86 17.85
17.83 17.80能氮比Energy/nitrogen/(g/MJ)乙/丙8.51 8.52 8.53 8.54
1.4 样品采集
分别在培养后 2、4、6、8、10、12、16 和 24 h 各采集2 mL培养液，并－20℃
冷冻保存，用于培养液VFA浓度的测定。培养结束后，取10 mL培养液分装2个
离心管，其中1管用于分离培养液的原虫与细菌，分离后采用二苯胺显色法测定
细菌、原虫的DNA含量;另1管用于微生物DNA的提取，提取得到的DNA进行
群体多样性检测。
1.5 VFA 浓度测定
采用日本岛津GC－14B气相色谱仪按文献［4］的方法进行测定。
色谱条件:毛细管柱CP-WAX(30 m×0.53 mm ×1 μm);气化室 200 ℃，FID 检测
器200℃;柱温采用程序升温法，初温100℃，末温150℃，升温速率3℃/min，
灵敏度为10，衰减为25;以巴豆酸为内标物。
培养液处理:培养液经15 000×g离心10 min后取上清液1 mL，加0.2 mL 20%
含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混匀后高速离心取上清液0.4 μL进样分析。
1.6 微生物分离及其DNA浓度测定
培养液微生物采用文献［5］的方法进行分离。1)原虫:取培养液加等体积生理盐水
39℃水浴震荡(125 r/min)培养60 min，并辅以搅拌;再经4层纱布过滤，滤液离
心(150×g、10 min)，收集沉淀为原虫，用生理盐水洗涤2次后用生理盐水悬浮，
－20℃贮存待测。2)细菌:收集离心后的上清液，再高速离心(15 000×g、15 min)，
收集沉淀为细菌，其余处理同原虫。
微生物DNA浓度测定采用二苯胺显色法、参照赵亚华［6］的步骤。制备小牛胸
腺DNA钠盐(上海生工生物工程技术服务有限公司)标准溶液，绘制以DNA浓度
为横坐标、吸光度值为纵坐标的标准曲线。取分离后的原虫或细菌样品，调整至线
性范围浓度后，2 mL样品加4 mL二苯胺试剂于60℃水浴中保温1 h，使用
722N型分光光度计(上海精科)测定OD595 nm。计算公式:
DNA浓度(mg/mL)=根据标准曲线测得样品
DNA浓度×稀释倍数×10－3。
1.7 微生物遗传指纹分析
1.7.1 DNA 的提取
采用Zhou等［7］的冻融法提取细菌、原虫的DNA。采用756型紫外分析仪(天
津普瑞斯)测定所提取DNA的浓度和纯度，0.7%琼脂糖电泳检测DNA片段大小。
1.7.2 PCR
细菌用细菌16S rDNA的V3区兼并引物F338与 R518进行 PCR 扩增［8］;原
虫用纤毛虫rDNA的 ITS1区兼并引物 F1738与 R1951进行PCR扩增［9］，2%
琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小，引物由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
表2 瘤胃微生物引物序列及参数Table 2 Sequences and parameters of
primers of rumen microbes项目Items产物大小Product size/bp细菌16S
rDNA V3 Bacterial 16S rDNA V3序列Sequences(5'―3')位置Location版本
Version上游:CCTACGGGAGGCAGCAG下游:ATTACCGCGGCTGCTGG 338
518 S-D-B-338-a-S-17 S-D-B-518-b-A-17 181原虫rDNA ITS1 Protozoal
rDNA ITS1上游:AACAAGGTTTCCGTAGGT下游:ACTTCGCTGCGTTCTTCA 1
738 1 951 S-D-P-1738-a-S-18 S-D-P-1951-b-A-18214
1.7.3 单链构象多态性(SSCP)检测与图谱分析
SSCP检测参考 Schmalenberger等［10］的方法，图谱分析参照 Carriqo等
［11］的方法。将 SSCP图谱数字化，计算泳道(底物)间Jaccard相似性指数(Cj)，
公式为:
式中:j为2个泳道共有条带数;a和b为2个泳道各自特有的带数。Cj反映了群落
间物种组成的相似性，本文中用Cj代表2个泳道(样品)的组带分布(即微生物群体
结构)的相似程度。
1.8 统计分析
试验数据采用Excel软件进行整理，用SPSS 16.0软件中的One-way ANOVA过
程进行分析和Tukey法进行多重比较。
2 结果
2.1 底物乙/丙对培养液VFA浓度的影响
由表3可见，A、B、C和D组乙酸浓度平均值分别为 12.02、11.41、13.76 和
17.81 mmol/L。D组乙酸浓度最高(P＜0.05)，显著高于其他3组。其次为C、A
组，B组最低。A、B、C和D组丙酸浓度平均值分别为6.50、4.36、4.40 和
5.62 mmol/L，可见A组丙酸浓度最高、B组最低(P＜0.05)。A、B、C 和 D 组
丁酸浓度平均值分别为 3.33、2.26、1.88和2.18 mmol/L，其中A和C组间差
异显著(P ＜0.05)。
从动态变化来看，各种VFA浓度变化趋势相似，随时间延长基本都呈上升趋势。
C、D组中乙酸浓度明显随培养时间延长而不断增加，而A、B组则变化较为平缓，
A组在16～24 h阶段有所下降。B组的丙酸浓度在培养后2 h时高于其他3组，
而后与其他组一样，基本呈现上升趋势;A组丙酸浓度除2 h外基本持续在较高水
平变化，但在16～24 h阶段也有所下降。丁酸浓度随培养时间的变化规律和丙酸
的变化趋势类似。
2.2 底物乙/丙对培养液该比例及原虫和细菌DNA浓度的影响
由表4可见，各组培养液乙/丙平均值在3∶1左右，大致呈现出随底物乙/丙升高
而升高的规律，而且A组显著低于C和D组(P＜0.05)。从动态变化来看，培养液
乙/丙随时间的波动变化较为平缓。细菌DNA浓度以B组最高、C和D组次之，
A组最低;原虫DNA浓度以B组最高、A组次之，均显著高于C和D组(P＜0.05)。
表3 底物乙/丙对培养液VFA浓度的影响Table 3 Effects of acetate to
propionate ratio of substrates on concentrations of volatile fatty acids in
the culture medium mmol/L同行数据肩标相邻字母表示差异显著(P＜0.05)，相
间字母表示差异极显著(P＜0.01)，相同或无字母肩标表示差异不显著(P＞0.05)。
下表同。In the same row，values with adjacent letter superscripts mean
significant difference(P＜0.05)，and with alternate letter superscripts mean
significant difference(P ＜0.01)，but with the same or no letter superscripts
mean no significant difference(P ＞0.05).The same as below.项目Items时间
Time/h组别Groups A B C D 2乙酸Acetate 5.88 ±1.11 8.25 ±2.14 7.61
±0.55 6.40 ±0.38 4 7.15 ±1.06 6.89 ±0.66 8.47 ±0.38 8.93 ±0.08 6 9.92
±0.71 10.46 ±2.59 8.55 ±1.48 11.87 ±0.64 8 12.00 ±1.65 11.33 ±1.33 14.70
±4.25 15.77 ±0.92 10 13.66 ±4.28 10.27 ±2.81 13.87 ±0.94 16.00 ±3.64 12
17.53 ±4.28 13.26 ±2.48 17.39 ±0.93 20.83 ±0.70 16 20.98 ±0.58 18.28
±4.01 18.64 ±0.33 28.89 ±2.18 24 17.51 ±3.67 19.56 ±2.30 30.73 ±5.15
47.25 ±4.11平均值 Mean 12.02 ±1.98b11.41 ±1.66b13.76 ±2.68b17.81
±4.46a 1.54 ±0.22 4.16 ±2.67 1.94 ±0.30 1.83 ±0.35 4 1.86 ±0.34 1.76
±0.07 1.86 ±0.19 2.36 ±0.21 6 3.14 ±0.69 2.80 ±0.92 2.35 ±0.38 3.22 ±0.20
8 5.70 ±2.93 4.36 ±1.07 4.46 ±1.38 5.32 ±0.59 10 7.08 ±1.78 2.88 ±1.26
4.31 ±0.13 5.27 ±1.69 12 9.51 ±1.08 4.84 ±1.78 5.71 ±0.77 6.87 ±0.85 16
15.23 ±1.80 7.62 ±0.86 6.36 ±0.12 10.69 ±1.16 24 12.81 ±0.45 9.27 ±0.13
10.86 ±2.38 13.31 ±1.82平均值 Mean 6.50 ±1.69a4.36 ±0.87b4.40
±0.99b5.62 ±1.36ab 2丙酸Propionate 2丁酸Butyrate 0.91 ±0.12 2.78
±1.78 1.25 ±0.21 0.93 ±0.01 4 1.10 ±0.05 1.03 ±0.10 1.03 ±0.21 1.11 ±0.07
6 1.82 ±0.02 1.55 ±0.22 1.30 ±0.15 1.35 ±0.16 8 3.41 ±0.89 2.30 ±0.68 1.87
±0.26 2.10 ±0.26 10 3.94 ±0.21 1.88 ±0.42 1.93 ±0.04 1.97 ±0.55 12 4.77
±1.50 2.86 ±0.42 2.52 ±0.16 2.66 ±0.23 16 7.43 ±2.09 3.37 ±0.19 2.62
±0.07 3.72 ±0.23 24 5.45 ±0.81 3.45 ±0.02 3.52 ±0.53 4.92 ±0.98平均值
Mean 3.33 ±0.76a2.26 ±0.34ab1.88 ±0.29b2.18 ±0.46ab
2.3 细菌和原虫SSCP图谱分析
图1为瘤胃细菌、原虫区系的SSCP图谱，图谱上的条带反映了不同底物下培养
液中的优势菌群，条带的数量和位置的复杂性说明了菌群的多样性。由细菌SSCP
图谱可见，B组条带数最多为16条，D组条带数最少为5条，A、B、C和D组
都有2条共有的优势条带a和b;另外的2条优势带c和d为B和C组共有，而A
和D组没有。Jaccard相似性指数表明，B和C组的细菌图谱相似性较高(0.52)，
图谱中有10条共有条带。
由原虫的SSCP图谱可见，D组条带数最多为17条，A组条带数最少为10条。B
和C组分别为12、11条，但B和C组条带灰度明显高于 D组。A、B、C和D
组共有2条优势条带 e和f。原虫SSCP指纹图谱也以B和C组间相似性指数较
高(0.50)。
表4 底物乙/丙对培养液该比例和微生物DNA浓度的影响Table 4 Effects of
acetate to propionate ratio of substrates on the ratio and microbes DNA
concentration of culture medium项目Items时间Time/h组别Groups A B C
D 2乙/丙Acetate/propionate 3.79 ±0.19 2.81 ±1.29 3.97 ±0.33 3.59 ±0.48
4 3.86 ±0.14 3.93 ±0.52 4.59 ±0.27 3.82 ±0.37 6 3.37 ±0.96 3.85 ±0.35 3.63
±0.04 3.69 ±0.03 8 3.06 ±1.86 2.68 ±0.35 3.32 ±0.08 2.98 ±0.16 10 2.03
±1.16 3.88 ±0.72 3.21 ±0.12 3.14 ±0.31 12 1.88 ±0.67 2.95 ±0.58 3.08
±0.25 3.09 ±0.49 16 1.40 ±0.13 2.37 ±0.26 2.93 ±0.11 2.71 ±0.09 24 1.37
±0.24 2.11 ±0.21 2.86 ±0.15 3.66 ±0.81平均值 Mean 2.54 ±0.33b3.04
±0.23ab3.32 ±0.23a3.25 ±0.15a细菌 DNA Bacteria DNA/(ng/mL) 8.10
±0.70c15.40 ±1.70a9.80 ±0.20b11.00 ±1.40ab原虫 DNA Protozoa
DNA/(ng/mL) 9.60 ±1.30b25.40 ±2.60a4.30 ±0.40c2.70 ±0.40c
表5 瘤胃细菌、原虫的相似性指数矩阵Table 5 The matrix of kindred index
for rumen bacteria and protozoa项目Items 组别Groups B组Group B C组
Group C D组Group D A组细菌Bacteria Group A 0.37 0.47 0.33 B 组 Group
B 0.52 0.39 C组Group C 0.41原虫Protozoa A 组 Group A 0.25 0.29 0.27 B
组 Group B 0.50 0.47 C组Group C 0.33
3 讨论
乙酸是反刍动物代谢所需能量的主要来源。丙酸则是反刍动物重要的葡萄糖前体，
丙酸型发酵能为机体提供更多的能量，因而乙/丙影响能量的利用率［12］;同时，
乙酸通过葡萄糖经磷酸戊糖途径代谢和葡萄糖存在依赖关系。因此，通过调整乙/
丙可提高能量利用率。VFA既是碳水化合物在瘤胃的终产物，也是瘤胃微生物生
长所需的重要碳架和能量来源。乙酸和丙酸通过不同的代谢途径提供瘤胃微生物生
长所需要的营养物质和能量，乙/丙不同，瘤胃微生物的群体结构也可能不同，进
而又导致发酵模式的不同，改变发酵产物乙/丙。可见，底物与微生物间存在复杂
的互作关系。
本研究表明，培养液乙酸浓度以100∶0组最高、丙酸浓度以30∶70组最高，这
可能是由于100∶0组底物中乙酸浓度较高、而30∶70组底物中丙酸较高，进而
导致利用和代谢相应酸的某些种类微生物增加，而使培养液中相应酸的比例较高所
致。而培养液乙酸和丙酸浓度皆以50∶50组最低，这可能是由于该组微生物活性
较高，生长繁殖较快对底物的利用较多所致。这与本文所测定的细菌、原虫DNA
浓度在50∶50组最高相一致。另外，该结果也与反映微生物多样性的图谱有一定
的一致性。例如50∶50组细菌SSCP图谱条带数最多;50∶50组原虫的条带数仅
次于100∶0组，而且该组图谱中的条带灰度明显高于100∶0组。这些结果表明
50∶50组细菌、原虫群体较为多样，而且群体量也较大［13］。进一步检测发现，
细菌、原虫的 SSCP图谱组间相似程度各有差异，但都以50∶50和70∶30组图
谱间相似性指数较高，表明了在一定的比例范围内，底物接近则微生物的群体结构
也相近。以上结果说明底物对微生物有一定的影响，可以通过底物或饲粮的改变来
调控微生物的代谢，进而调控机体消化代谢，与前人的研究有一定的一致性［14
－15］。例如 Tajima 等［16］曾研究发现，荷斯坦奶牛的饲粮从粗饲料突然转
变为高精料情况下，瘤胃球菌消失，而乳酸利用菌成为优势菌群;王梦芝等［9］报
道的蛋白源不同微生物的种群结构也不同。
图1 瘤胃细菌和原虫区系的SSCP分析Fig.1 SSCP analysis of rumen bacteria
and protozoa
动物采食饲料后，淀粉以及可溶性碳水化合物在瘤胃中发酵产生VFA的速度较快，
VFA的浓度增加。随着发酵的进行，瘤胃上皮对VFA吸收的增加及向后部消化道
流出速度的加快，引起瘤胃中VFA的浓度又开始下降。而与体内研究不同的是，
本批次培养为不连续培养，作为不连续发酵装置，其产生的VFA不能够被瘤胃壁
吸收和通过后部消化道排出，因此随培养时间的延长，本试验记录的VFA的产量
逐渐升高。但在一定的范围内，培养液具有一定的缓冲能力，不影响微生物的正常
发酵［17］。而且除了VFA被吸收或排出，培养液乙酸、丙酸的浓度也反映了发
酵和微生物对VFA的利用情况，所以常常被用来进行机理研究。至于乙/丙对瘤胃
中微生物群体结构等影响还需要进一步研究。
4 结论
①底物乙/丙为100∶0时培养液乙酸浓度最高，30∶70 时丙酸浓度最高，50∶50
时乙酸、丙酸浓度均为最低。
②细菌、原虫SSCP图谱组间相似程度不同，底物乙/丙为50∶50和70∶30时图
谱间相似程度最高。
参考文献:
［1］冯仰廉.反刍动物营养学［M］.北京:科学出版社，2004.
［2］熊本海，卢德勋，张子仪.瘤胃乙酸与丙酸摩尔比例的改变对瘤胃发酵及血液
指标的影响［J］.畜牧兽医学报，2002，33(6):537 －543.
［3］MENKE K H，STEINGASS tion of the energetic feed value
obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen
fluid［J］.Animal Research and Development，1988，28:7 －55.
［4］熊本海，卢德勋，高俊.绵羊瘤胃VFA吸收效率及模型参数的研究［J］.动物
营养学报，1999，11:248－255.
［5］王梦芝.山羊瘤胃原虫与细菌吞噬关系和微生物AA变化机制的研究［D］.博
士学位论文.扬州:扬州大学，2008.
［6］赵亚华.生物化学与分子生物学实验技术教程［M］.北京:高等教育出版社，
2005.
［7］ZHOUJ，BRUNSM A，TIEDJE J recovery from soils of diverse
composition［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，
62(2):316－322.
［8］MUYZER G，DE WAAL E C，UITTERLINDEN A ing of complex
microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis
of polymerase chain reaction-amplified genes encoding for 16S rRNA
［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59:695－700.
［9］王梦芝，喻礼怀，王洪荣，等.不同蛋白饲料对瘤胃微生物体外发酵和群体结
构的影响［J］.动物营养学报，2009，21(5):673 －679.
［10］SCHMALENBERGER A，TEBBE C ial diversity in maize
rhizospheres:conclusions on the use of genetic profiles based on PCR-
amplified partial small subunit rRNA genes in ecological studies
［J］.Molecular Ecology，2003，12:251－262.
［11］CARRIQO J A，PINTO F R，SIMAS C，et ment of band-
based similarity coefficients for automatic type and subtype classification
of microbial isolates analyzed by pulsed-field gel electrophoresis
［J］.Journal of Clinical Microbiology，2005，43(11):5483－5490.
［12］ΦRSKOV，E R，GRUBB D A，SMITH J ency of utilization of
volatile fatty acids for maintenance and energy retention by sheep
［J］.British Journal of Nutrition，1979，41:541－552.
［13］朱伟云，姚文，毛胜勇.变性梯度凝胶电泳法研究断奶仔猪粪样细菌区系变
化［J］.微生物学报，2003，8:503－508.
［14］CALSAMIGLIA S，STERN M D，FIRKINS J s of protein source
on nitrogen metabolism in continuous culture and intestinal digestion in
vitro［J］.Journal of Animal Science，1995，73:1819－1827.
［15］TAJIIMA K，AMINOV R I，NAGAMINE T，et -dependent
shifts in the bacterial population of the rumen revealed with real-time PCR
［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(6):2766－2774.
［16］TAJIMA K，ARAI S，OGATA K，et bacterial community
transition during adaptation to high-grain diet［J］.Environmental
Microbiology，2000(6):273－284.
［17］PREVOT S，SENAUD J，BOHATIER J，et ion in the
composition of the ruminal bacterial microflora during the adaptation
phase in an artificial fermentor(Rusitec)［J］.Zoological Science Tokyo，
1994，11:871－878.
2024年4月13日发(作者：昌承德)
乙酸与丙酸比对体外瘤胃液挥发性脂肪酸发酵模式和微生物群
体多样性的影响
尹召华;王梦芝;王洪荣;张洁;喻礼怀
【摘 要】本文主要研究乙酸与丙酸比(乙/丙)对体外瘤胃液挥发性脂肪酸发酵模式
及微生物群体多样性的影响.试验以4头瘤胃瘘管山羊提供瘤胃液,设4个处理,培养
底物乙/丙分别为30:70、50:50、70:30和100:0.测定培养液中挥发性脂肪酸的浓
度的变化,并通过单链构象多态性(SSCP)图谱检测细菌和原虫的群体多样性.结果表
明:培养液乙酸浓度以100:0组最高,显著高于其他3组(P＜0.05),50:50组最低；
丙酸浓度以30:70组最高,显著高于50:50和70:30组(P＜0.05)；丁酸的浓度
30:70组显著高于70:30组(P＜0.05)；各组培养液乙/丙均接近3:1,30:70组显著
低于70:30和100:0组(P＜0.05).细菌SSCP图谱显示,50:50组条带数最多,100:0
组条带数最少；原虫的SSCP图谱以100:0组条带数最多,30:70组条带数最少.细
菌、原虫的SSCP图谱皆以50:50和70:30组图谱间相似性指数为高.总之,乙/丙
对培养液挥发性脂肪酸模式、细菌或原虫的群体多样性都存在影响.%This paper
was conducted to investigate the effects of acetate to propionate ratio on
the pattern of volatile fatty acid (VFA) fermentation and diversities of
rumen microorganisms. Four goats fitted with permanent ruminal cannulas
were used to provide rumen fluid for the in vitro study. The four
treatments were set according to the acetate to propionate ratio in culture
substrates, which were 30:70, 50:0, 70:30, and 100:0, respectively. Variation
of VFA concentration was recorded, and diversities of bacteria and
protozoa were investigated by SSCP fingerprint technique. The results
showed as follows: acetate concentration of 100:0 group was the highest
and was significantly higher than that of the other three groups (P < 0. 05) ,
while that of 50:50 group was the lowest. Propionate concentration of
30:70 group was the highest and was significantly higher than that of
groups 50:50 and 70:30 (P <0. 05). Butyrate concentration of 30:70 group
was significantly higher than that of 70:30 group (P <0. 05). Acetate to
propionate ratios in culture medium of all the treatments were close to 3:1,
while that of 30:70 group was significantly lower than that of groups 70:30
and 100:0 ( P <0.05). Bacterial SSCP fingerprint showed that bands number
of 50:50 group was the most, while that of 100:0 group was the least;
protozoa SSCP fingerprint showed that bands number of 100:0 group was
the most, while that of 30:70 group was the least. Similarity index was the
highest between 50:50 group and 70:30 group on both bacteria and
protozoa fingerprints. In conclusion, the VFA pattern and diversities of
rumen bacterial or protozoal community can be modified by acetate to
propionate ratio in vitro.
【期刊名称】《动物营养学报》
【年(卷),期】2011(023)012
【总页数】7页(P2129-2135)
【关键词】瘤胃;细菌;原虫;乙酸、丙酸比;多样性
【作 者】尹召华;王梦芝;王洪荣;张洁;喻礼怀
【作者单位】扬州大学实验农牧场,扬州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬
州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009;扬州大学动物科学与技术
学院,扬州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009
【正文语种】中 文
【中图分类】S826
瘤胃微生物在反刍动物消化生理中至关重要。碳水化合物在反刍动物瘤胃中被微生
物降解为挥发性脂肪酸(VFA)，VFA可提供机体可消化能的70% ～80%［1］。
VFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸等。乙酸、丙
酸和丁酸约占瘤胃发酵VFA总产量的95%，也是机体代谢最为重要的几种VFA。
丁酸在瘤胃液中含量相对较低(10%左右)，而且可由乙酸转化;乙酸和丙酸是饲料在
瘤胃内发酵产生的两大主要有机酸，饲料的种类和微生物的区系不同，发酵产生乙
酸与丙酸比(乙/丙)也不同，如非结构性碳水化合物在瘤胃中的发酵率很高，产生
VFA总量也较多，但乙/丙较低，而粗饲料则相反。因此，瘤胃液乙/丙可反映饲
料在瘤胃中的发酵模式;同时，VFA又为微生物发酵底物和合成微生物蛋白质(MCP)
提供能量和碳架。鉴于微生物生长对底物的选择性［1］，乙/丙也会影响微生物
蛋白质的合成以及不同区系瘤胃微生物(细菌、原虫等)的群体结构，进而影响整个
机体的消化与营养代谢［2］。迄今为止，国内外尚未见通过体外培养研究乙/丙
影响瘤胃微生物VFA发酵模式以及原虫、细菌群体多样性的报道。为此，本研究
设置4种乙/丙进行人工模拟瘤胃体外发酵试验，旨在研究瘤胃液乙/丙对微生物发
酵模式及群体多样性的影响，以期为反刍动物瘤胃微生物营养代谢调控的研究提供
基础性资料。
1 材料与方法
1.1 供瘤胃液动物及瘤胃液的采集
试验在扬州大学实验农牧场进行。选用4只健康、体重(37.6 ±1.3)kg、安装有永
久性瘤胃瘘管的徐淮山羊羯羊作为瘤胃液供体。单圈饲养，以(玉米+豆粕)∶羊草
为30∶70作为饲粮，日给料干物质质量为体重的2%，08:00和20:00分2次等
量饲喂，自由饮水。
通过瘤胃瘘管，利用自制真空负压装置，在晨饲前从4头山羊瘤胃内各采约150
mL瘤胃液，过4层纱布，滤液装于预先通有CO2并39℃预热的灭菌生理盐水瓶
中，将所有瘤胃液混合均匀，39℃水浴保温送回实验室待用。
1.2 试验设计
试验按培养底物乙/丙不同分为4组，A、B、C和 D 组乙/丙分别为 30∶70、
50∶50、70∶30、100∶0，各组能量水平一致。
1.3 体外培养
培养底物配制方法如下:体外培养试验开始前30 min，按表1的体积取乙酸和丙酸
溶于20 mL水中，用1 mol/L NaOH调pH为7.0，再加人工唾液盐(配制参考
Menke等［3］的方法)至80 mL为乙酸、丙酸混合液，39℃水浴待用。
三角瓶经紫外线灭菌30 min后加入1 g酪蛋白;再在各瓶中分别加入按不同比例
混合好的乙酸、丙酸混合液80 mL(预先通CO2至饱和、39℃预热);而后加入瘤胃
液40 mL;塞好橡皮塞，通CO2、39℃、震荡(50 r/min)培养。每组各设3个重复，
另设1个不加底物的(仅含瘤胃液、人工唾液盐)空白对照。体外培养方法参照
Menke等［3］的方法进行。
表1 培养底物的组成及能量水平Table 1 Composition and energy levels of
cultural substrates项目Items 组别Groups A B C D Acetate/propionate
30∶70 50∶50 70∶30 100∶0原料Ingredients乙酸 Acetate/mL 0.283 0.500
0.744 1.174丙酸 Propionate/mL 0.661 0.500 0.319 0.000酪蛋白 Casein
1.000 1.000 1.000 1.000能量水平Energy levels能值 Energy/kJ 17.86 17.85
17.83 17.80能氮比Energy/nitrogen/(g/MJ)乙/丙8.51 8.52 8.53 8.54
1.4 样品采集
分别在培养后 2、4、6、8、10、12、16 和 24 h 各采集2 mL培养液，并－20℃
冷冻保存，用于培养液VFA浓度的测定。培养结束后，取10 mL培养液分装2个
离心管，其中1管用于分离培养液的原虫与细菌，分离后采用二苯胺显色法测定
细菌、原虫的DNA含量;另1管用于微生物DNA的提取，提取得到的DNA进行
群体多样性检测。
1.5 VFA 浓度测定
采用日本岛津GC－14B气相色谱仪按文献［4］的方法进行测定。
色谱条件:毛细管柱CP-WAX(30 m×0.53 mm ×1 μm);气化室 200 ℃，FID 检测
器200℃;柱温采用程序升温法，初温100℃，末温150℃，升温速率3℃/min，
灵敏度为10，衰减为25;以巴豆酸为内标物。
培养液处理:培养液经15 000×g离心10 min后取上清液1 mL，加0.2 mL 20%
含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混匀后高速离心取上清液0.4 μL进样分析。
1.6 微生物分离及其DNA浓度测定
培养液微生物采用文献［5］的方法进行分离。1)原虫:取培养液加等体积生理盐水
39℃水浴震荡(125 r/min)培养60 min，并辅以搅拌;再经4层纱布过滤，滤液离
心(150×g、10 min)，收集沉淀为原虫，用生理盐水洗涤2次后用生理盐水悬浮，
－20℃贮存待测。2)细菌:收集离心后的上清液，再高速离心(15 000×g、15 min)，
收集沉淀为细菌，其余处理同原虫。
微生物DNA浓度测定采用二苯胺显色法、参照赵亚华［6］的步骤。制备小牛胸
腺DNA钠盐(上海生工生物工程技术服务有限公司)标准溶液，绘制以DNA浓度
为横坐标、吸光度值为纵坐标的标准曲线。取分离后的原虫或细菌样品，调整至线
性范围浓度后，2 mL样品加4 mL二苯胺试剂于60℃水浴中保温1 h，使用
722N型分光光度计(上海精科)测定OD595 nm。计算公式:
DNA浓度(mg/mL)=根据标准曲线测得样品
DNA浓度×稀释倍数×10－3。
1.7 微生物遗传指纹分析
1.7.1 DNA 的提取
采用Zhou等［7］的冻融法提取细菌、原虫的DNA。采用756型紫外分析仪(天
津普瑞斯)测定所提取DNA的浓度和纯度，0.7%琼脂糖电泳检测DNA片段大小。
1.7.2 PCR
细菌用细菌16S rDNA的V3区兼并引物F338与 R518进行 PCR 扩增［8］;原
虫用纤毛虫rDNA的 ITS1区兼并引物 F1738与 R1951进行PCR扩增［9］，2%
琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小，引物由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
表2 瘤胃微生物引物序列及参数Table 2 Sequences and parameters of
primers of rumen microbes项目Items产物大小Product size/bp细菌16S
rDNA V3 Bacterial 16S rDNA V3序列Sequences(5'―3')位置Location版本
Version上游:CCTACGGGAGGCAGCAG下游:ATTACCGCGGCTGCTGG 338
518 S-D-B-338-a-S-17 S-D-B-518-b-A-17 181原虫rDNA ITS1 Protozoal
rDNA ITS1上游:AACAAGGTTTCCGTAGGT下游:ACTTCGCTGCGTTCTTCA 1
738 1 951 S-D-P-1738-a-S-18 S-D-P-1951-b-A-18214
1.7.3 单链构象多态性(SSCP)检测与图谱分析
SSCP检测参考 Schmalenberger等［10］的方法，图谱分析参照 Carriqo等
［11］的方法。将 SSCP图谱数字化，计算泳道(底物)间Jaccard相似性指数(Cj)，
公式为:
式中:j为2个泳道共有条带数;a和b为2个泳道各自特有的带数。Cj反映了群落
间物种组成的相似性，本文中用Cj代表2个泳道(样品)的组带分布(即微生物群体
结构)的相似程度。
1.8 统计分析
试验数据采用Excel软件进行整理，用SPSS 16.0软件中的One-way ANOVA过
程进行分析和Tukey法进行多重比较。
2 结果
2.1 底物乙/丙对培养液VFA浓度的影响
由表3可见，A、B、C和D组乙酸浓度平均值分别为 12.02、11.41、13.76 和
17.81 mmol/L。D组乙酸浓度最高(P＜0.05)，显著高于其他3组。其次为C、A
组，B组最低。A、B、C和D组丙酸浓度平均值分别为6.50、4.36、4.40 和
5.62 mmol/L，可见A组丙酸浓度最高、B组最低(P＜0.05)。A、B、C 和 D 组
丁酸浓度平均值分别为 3.33、2.26、1.88和2.18 mmol/L，其中A和C组间差
异显著(P ＜0.05)。
从动态变化来看，各种VFA浓度变化趋势相似，随时间延长基本都呈上升趋势。
C、D组中乙酸浓度明显随培养时间延长而不断增加，而A、B组则变化较为平缓，
A组在16～24 h阶段有所下降。B组的丙酸浓度在培养后2 h时高于其他3组，
而后与其他组一样，基本呈现上升趋势;A组丙酸浓度除2 h外基本持续在较高水
平变化，但在16～24 h阶段也有所下降。丁酸浓度随培养时间的变化规律和丙酸
的变化趋势类似。
2.2 底物乙/丙对培养液该比例及原虫和细菌DNA浓度的影响
由表4可见，各组培养液乙/丙平均值在3∶1左右，大致呈现出随底物乙/丙升高
而升高的规律，而且A组显著低于C和D组(P＜0.05)。从动态变化来看，培养液
乙/丙随时间的波动变化较为平缓。细菌DNA浓度以B组最高、C和D组次之，
A组最低;原虫DNA浓度以B组最高、A组次之，均显著高于C和D组(P＜0.05)。
表3 底物乙/丙对培养液VFA浓度的影响Table 3 Effects of acetate to
propionate ratio of substrates on concentrations of volatile fatty acids in
the culture medium mmol/L同行数据肩标相邻字母表示差异显著(P＜0.05)，相
间字母表示差异极显著(P＜0.01)，相同或无字母肩标表示差异不显著(P＞0.05)。
下表同。In the same row，values with adjacent letter superscripts mean
significant difference(P＜0.05)，and with alternate letter superscripts mean
significant difference(P ＜0.01)，but with the same or no letter superscripts
mean no significant difference(P ＞0.05).The same as below.项目Items时间
Time/h组别Groups A B C D 2乙酸Acetate 5.88 ±1.11 8.25 ±2.14 7.61
±0.55 6.40 ±0.38 4 7.15 ±1.06 6.89 ±0.66 8.47 ±0.38 8.93 ±0.08 6 9.92
±0.71 10.46 ±2.59 8.55 ±1.48 11.87 ±0.64 8 12.00 ±1.65 11.33 ±1.33 14.70
±4.25 15.77 ±0.92 10 13.66 ±4.28 10.27 ±2.81 13.87 ±0.94 16.00 ±3.64 12
17.53 ±4.28 13.26 ±2.48 17.39 ±0.93 20.83 ±0.70 16 20.98 ±0.58 18.28
±4.01 18.64 ±0.33 28.89 ±2.18 24 17.51 ±3.67 19.56 ±2.30 30.73 ±5.15
47.25 ±4.11平均值 Mean 12.02 ±1.98b11.41 ±1.66b13.76 ±2.68b17.81
±4.46a 1.54 ±0.22 4.16 ±2.67 1.94 ±0.30 1.83 ±0.35 4 1.86 ±0.34 1.76
±0.07 1.86 ±0.19 2.36 ±0.21 6 3.14 ±0.69 2.80 ±0.92 2.35 ±0.38 3.22 ±0.20
8 5.70 ±2.93 4.36 ±1.07 4.46 ±1.38 5.32 ±0.59 10 7.08 ±1.78 2.88 ±1.26
4.31 ±0.13 5.27 ±1.69 12 9.51 ±1.08 4.84 ±1.78 5.71 ±0.77 6.87 ±0.85 16
15.23 ±1.80 7.62 ±0.86 6.36 ±0.12 10.69 ±1.16 24 12.81 ±0.45 9.27 ±0.13
10.86 ±2.38 13.31 ±1.82平均值 Mean 6.50 ±1.69a4.36 ±0.87b4.40
±0.99b5.62 ±1.36ab 2丙酸Propionate 2丁酸Butyrate 0.91 ±0.12 2.78
±1.78 1.25 ±0.21 0.93 ±0.01 4 1.10 ±0.05 1.03 ±0.10 1.03 ±0.21 1.11 ±0.07
6 1.82 ±0.02 1.55 ±0.22 1.30 ±0.15 1.35 ±0.16 8 3.41 ±0.89 2.30 ±0.68 1.87
±0.26 2.10 ±0.26 10 3.94 ±0.21 1.88 ±0.42 1.93 ±0.04 1.97 ±0.55 12 4.77
±1.50 2.86 ±0.42 2.52 ±0.16 2.66 ±0.23 16 7.43 ±2.09 3.37 ±0.19 2.62
±0.07 3.72 ±0.23 24 5.45 ±0.81 3.45 ±0.02 3.52 ±0.53 4.92 ±0.98平均值
Mean 3.33 ±0.76a2.26 ±0.34ab1.88 ±0.29b2.18 ±0.46ab
2.3 细菌和原虫SSCP图谱分析
图1为瘤胃细菌、原虫区系的SSCP图谱，图谱上的条带反映了不同底物下培养
液中的优势菌群，条带的数量和位置的复杂性说明了菌群的多样性。由细菌SSCP
图谱可见，B组条带数最多为16条，D组条带数最少为5条，A、B、C和D组
都有2条共有的优势条带a和b;另外的2条优势带c和d为B和C组共有，而A
和D组没有。Jaccard相似性指数表明，B和C组的细菌图谱相似性较高(0.52)，
图谱中有10条共有条带。
由原虫的SSCP图谱可见，D组条带数最多为17条，A组条带数最少为10条。B
和C组分别为12、11条，但B和C组条带灰度明显高于 D组。A、B、C和D
组共有2条优势条带 e和f。原虫SSCP指纹图谱也以B和C组间相似性指数较
高(0.50)。
表4 底物乙/丙对培养液该比例和微生物DNA浓度的影响Table 4 Effects of
acetate to propionate ratio of substrates on the ratio and microbes DNA
concentration of culture medium项目Items时间Time/h组别Groups A B C
D 2乙/丙Acetate/propionate 3.79 ±0.19 2.81 ±1.29 3.97 ±0.33 3.59 ±0.48
4 3.86 ±0.14 3.93 ±0.52 4.59 ±0.27 3.82 ±0.37 6 3.37 ±0.96 3.85 ±0.35 3.63
±0.04 3.69 ±0.03 8 3.06 ±1.86 2.68 ±0.35 3.32 ±0.08 2.98 ±0.16 10 2.03
±1.16 3.88 ±0.72 3.21 ±0.12 3.14 ±0.31 12 1.88 ±0.67 2.95 ±0.58 3.08
±0.25 3.09 ±0.49 16 1.40 ±0.13 2.37 ±0.26 2.93 ±0.11 2.71 ±0.09 24 1.37
±0.24 2.11 ±0.21 2.86 ±0.15 3.66 ±0.81平均值 Mean 2.54 ±0.33b3.04
±0.23ab3.32 ±0.23a3.25 ±0.15a细菌 DNA Bacteria DNA/(ng/mL) 8.10
±0.70c15.40 ±1.70a9.80 ±0.20b11.00 ±1.40ab原虫 DNA Protozoa
DNA/(ng/mL) 9.60 ±1.30b25.40 ±2.60a4.30 ±0.40c2.70 ±0.40c
表5 瘤胃细菌、原虫的相似性指数矩阵Table 5 The matrix of kindred index
for rumen bacteria and protozoa项目Items 组别Groups B组Group B C组
Group C D组Group D A组细菌Bacteria Group A 0.37 0.47 0.33 B 组 Group
B 0.52 0.39 C组Group C 0.41原虫Protozoa A 组 Group A 0.25 0.29 0.27 B
组 Group B 0.50 0.47 C组Group C 0.33
3 讨论
乙酸是反刍动物代谢所需能量的主要来源。丙酸则是反刍动物重要的葡萄糖前体，
丙酸型发酵能为机体提供更多的能量，因而乙/丙影响能量的利用率［12］;同时，
乙酸通过葡萄糖经磷酸戊糖途径代谢和葡萄糖存在依赖关系。因此，通过调整乙/
丙可提高能量利用率。VFA既是碳水化合物在瘤胃的终产物，也是瘤胃微生物生
长所需的重要碳架和能量来源。乙酸和丙酸通过不同的代谢途径提供瘤胃微生物生
长所需要的营养物质和能量，乙/丙不同，瘤胃微生物的群体结构也可能不同，进
而又导致发酵模式的不同，改变发酵产物乙/丙。可见，底物与微生物间存在复杂
的互作关系。
本研究表明，培养液乙酸浓度以100∶0组最高、丙酸浓度以30∶70组最高，这
可能是由于100∶0组底物中乙酸浓度较高、而30∶70组底物中丙酸较高，进而
导致利用和代谢相应酸的某些种类微生物增加，而使培养液中相应酸的比例较高所
致。而培养液乙酸和丙酸浓度皆以50∶50组最低，这可能是由于该组微生物活性
较高，生长繁殖较快对底物的利用较多所致。这与本文所测定的细菌、原虫DNA
浓度在50∶50组最高相一致。另外，该结果也与反映微生物多样性的图谱有一定
的一致性。例如50∶50组细菌SSCP图谱条带数最多;50∶50组原虫的条带数仅
次于100∶0组，而且该组图谱中的条带灰度明显高于100∶0组。这些结果表明
50∶50组细菌、原虫群体较为多样，而且群体量也较大［13］。进一步检测发现，
细菌、原虫的 SSCP图谱组间相似程度各有差异，但都以50∶50和70∶30组图
谱间相似性指数较高，表明了在一定的比例范围内，底物接近则微生物的群体结构
也相近。以上结果说明底物对微生物有一定的影响，可以通过底物或饲粮的改变来
调控微生物的代谢，进而调控机体消化代谢，与前人的研究有一定的一致性［14
－15］。例如 Tajima 等［16］曾研究发现，荷斯坦奶牛的饲粮从粗饲料突然转
变为高精料情况下，瘤胃球菌消失，而乳酸利用菌成为优势菌群;王梦芝等［9］报
道的蛋白源不同微生物的种群结构也不同。
图1 瘤胃细菌和原虫区系的SSCP分析Fig.1 SSCP analysis of rumen bacteria
and protozoa
动物采食饲料后，淀粉以及可溶性碳水化合物在瘤胃中发酵产生VFA的速度较快，
VFA的浓度增加。随着发酵的进行，瘤胃上皮对VFA吸收的增加及向后部消化道
流出速度的加快，引起瘤胃中VFA的浓度又开始下降。而与体内研究不同的是，
本批次培养为不连续培养，作为不连续发酵装置，其产生的VFA不能够被瘤胃壁
吸收和通过后部消化道排出，因此随培养时间的延长，本试验记录的VFA的产量
逐渐升高。但在一定的范围内，培养液具有一定的缓冲能力，不影响微生物的正常
发酵［17］。而且除了VFA被吸收或排出，培养液乙酸、丙酸的浓度也反映了发
酵和微生物对VFA的利用情况，所以常常被用来进行机理研究。至于乙/丙对瘤胃
中微生物群体结构等影响还需要进一步研究。
4 结论
①底物乙/丙为100∶0时培养液乙酸浓度最高，30∶70 时丙酸浓度最高，50∶50
时乙酸、丙酸浓度均为最低。
②细菌、原虫SSCP图谱组间相似程度不同，底物乙/丙为50∶50和70∶30时图
谱间相似程度最高。
参考文献:
［1］冯仰廉.反刍动物营养学［M］.北京:科学出版社，2004.
［2］熊本海，卢德勋，张子仪.瘤胃乙酸与丙酸摩尔比例的改变对瘤胃发酵及血液
指标的影响［J］.畜牧兽医学报，2002，33(6):537 －543.
［3］MENKE K H，STEINGASS tion of the energetic feed value
obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen
fluid［J］.Animal Research and Development，1988，28:7 －55.
［4］熊本海，卢德勋，高俊.绵羊瘤胃VFA吸收效率及模型参数的研究［J］.动物
营养学报，1999，11:248－255.
［5］王梦芝.山羊瘤胃原虫与细菌吞噬关系和微生物AA变化机制的研究［D］.博
士学位论文.扬州:扬州大学，2008.
［6］赵亚华.生物化学与分子生物学实验技术教程［M］.北京:高等教育出版社，
2005.
［7］ZHOUJ，BRUNSM A，TIEDJE J recovery from soils of diverse
composition［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，
62(2):316－322.
［8］MUYZER G，DE WAAL E C，UITTERLINDEN A ing of complex
microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis
of polymerase chain reaction-amplified genes encoding for 16S rRNA
［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59:695－700.
［9］王梦芝，喻礼怀，王洪荣，等.不同蛋白饲料对瘤胃微生物体外发酵和群体结
构的影响［J］.动物营养学报，2009，21(5):673 －679.
［10］SCHMALENBERGER A，TEBBE C ial diversity in maize
rhizospheres:conclusions on the use of genetic profiles based on PCR-
amplified partial small subunit rRNA genes in ecological studies
［J］.Molecular Ecology，2003，12:251－262.
［11］CARRIQO J A，PINTO F R，SIMAS C，et ment of band-
based similarity coefficients for automatic type and subtype classification
of microbial isolates analyzed by pulsed-field gel electrophoresis
［J］.Journal of Clinical Microbiology，2005，43(11):5483－5490.
［12］ΦRSKOV，E R，GRUBB D A，SMITH J ency of utilization of
volatile fatty acids for maintenance and energy retention by sheep
［J］.British Journal of Nutrition，1979，41:541－552.
［13］朱伟云，姚文，毛胜勇.变性梯度凝胶电泳法研究断奶仔猪粪样细菌区系变
化［J］.微生物学报，2003，8:503－508.
［14］CALSAMIGLIA S，STERN M D，FIRKINS J s of protein source
on nitrogen metabolism in continuous culture and intestinal digestion in
vitro［J］.Journal of Animal Science，1995，73:1819－1827.
［15］TAJIIMA K，AMINOV R I，NAGAMINE T，et -dependent
shifts in the bacterial population of the rumen revealed with real-time PCR
［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(6):2766－2774.
［16］TAJIMA K，ARAI S，OGATA K，et bacterial community
transition during adaptation to high-grain diet［J］.Environmental
Microbiology，2000(6):273－284.
［17］PREVOT S，SENAUD J，BOHATIER J，et ion in the
composition of the ruminal bacterial microflora during the adaptation
phase in an artificial fermentor(Rusitec)［J］.Zoological Science Tokyo，
1994，11:871－878.