2024年2月27日发(作者：卫凝丝)

１－磷酸鞘氨醇受体２（Ｓ１ＰＲ２）通过保护肠黏膜屏障功能缓解炎症性肠病的作用

作者：薛海波 宋冰欣 丁莉 马丽丽 潘贻飞 陈坛辀

来源：《中国现代医生》2021年第15期

[关键词] 1-磷酸鞘氨醇;1-磷酸鞘氨醇受体2;肠黏膜屏障功能;炎症性肠病

[中图分类号] R331.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）15-0032-05

Effect of 1-phosphossphingosine receptor 2（S1PR2） on relieving inflammatory bowel disease

by protecting intestinal mucosal barrier function

XUE Haibo1 SONG Bingxin1 DING Li1 MA Lili2 PAN Yifei3 CHEN Tanzhou1

ment of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical

University， Wenzhou 325000，China; ment of Rheumatology and Immunology， the First

Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China; ment of

Colorectal and Anal Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，

Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 1-phossphingosine receptor 2（S1PR2） on

relieving inflammatory bowel disease （IBD） by protecting the intestinal mucosal barrier. Methods

S1PR2 gene knockout mice were constructed. Dextran sulfate sodium salt （DSS） was used to

induce colitis. Serum fluorescein isothiocyanate （FITC） concentration was measured for intestinal

permeability of mice in vitro and in vivo. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α），

interleukin-6 （IL-6） and interferon-γ （IFN-γ） in cell suspensions were determined by enzyme-

linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The survival rate and body weights of wild-type（WT） mice were higher than those of S1PR2-/- mice， and the differences were statistically

significant（P

[Key words] 1-phosphossphingosine; 1-phosphossphingosine receptor 2 （S1PR2）; Intestinal

mucosal barrier function; Inflammatory bowel disease

炎癥性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一种胃肠黏膜存在持续性炎症反应导致胃肠结构和功能紊乱的特发性肠道炎症性疾病，临床表现为腹泻、腹痛，甚至可有血便，主要包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn′s disease，CD）。炎症性肠病的病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用，认为其是由多因素相互作用所致，主要包括遗传、免疫因素、环境和微生物[1]。其治疗手段有限，反复发作的特性和可能的恶变倾向给临床医师和患者带来很大困扰，急需研究其发病机制，为临床治疗提供依据。

肠黏膜屏障是机体抵御外环境侵袭的重要屏障。肠黏膜屏障主要由机械屏障、生物屏障、化学屏障及免疫屏障组成。其中机械屏障最为重要，机械屏障由肠上皮细胞及其连接构成，调控着水和溶质的跨上皮运输。肠上皮细胞间的连接方式有多种，包括紧密连接、粘附连接和缝隙连接及桥粒等[2]。肠上皮紧密连接的损伤参与了多种疾病的进展。因此，维持完整的肠上皮细胞紧密连接对保护肠屏障功能、防止细菌移位及毒性大分子进入人体有重要的意义。由细胞间连接变化引起的细胞通透性改变导致的肠黏膜屏障功能失调是IBD的发病机制中的一个关键因素。

1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1，S1P）是一种在生理和病理条件下参与调解多种细胞功能的活性鞘脂。S1P可以直接作为细胞内信号分子或细胞外通过激活5个G蛋白偶联受体（G

protein-coupled receptors，GPCRs）发挥作用[3]。过去二十年，对S1P及其受体在健康和疾病中的作用进行了大量的研究。研究已经表明S1P是多种类型的细胞增殖、迁移和存活的一个关键调节因子[4]。在不同的组织或器官中5种S1PRs的表达具有差异性[5]。在人肠道内，所有5种（Sphingosine-1-phosphate receptors，S1PRs）均能被检测到，但是S1PRs表达水平不一。前期已有文献报道，S1P通过激活S1PR1调节粘着连接蛋白E-cadherin的表达增强肠上皮细胞屏障功能[6]。同时也有文献报道，S1P通过Akt依赖途径防止肠上皮细胞凋亡[7]。这些研究表明，S1P及其受体能够促进肠上皮细胞增殖和增强上皮细胞屏障功能，对肠黏膜屏障起到保护作用。S1PR2在肠上皮细胞增殖和上皮细胞屏障中的作用未见报道，而笔者的前期研究发现，S1PR2在肠上皮细胞高表达，是S1P在肠上皮细胞的主要受体，因而S1PR2对肠黏膜屏障保护作用值得研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采用C57BL/6小鼠，8～12周，体重中位数22.5 g，雌雄不限，生活环境控温控湿，具有12 h昼夜循环，并提供充足食水，每周换笼2次。S1PR2基因敲除小鼠[实验动物许可证：SYXK（浙）2018-0017]如前制备[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 动物处理 繁殖并验证C57BL/6来源的S1PR2-/-小鼠品系。利用S1PR2-/-小鼠，并以野生型（Wild type，WT）鼠为对照。用含有2.5%的硫酸葡聚糖钠盐（Dextra sulfare sodium，DSS）的水喂养小鼠7 d，以诱导结肠炎。1周后更换正常不含DSS的水，继续喂养小鼠1周，并在第14天处死。本动物实验通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会。

1.2.2 小鼠一般状况观察 以喂食DSS开始算起，取0、4、7和14 d小鼠结肠和血，每个时间点各取WT和KO 6只，解剖小鼠并检测结肠长度。每天称量小鼠体重和收取粪便，记录小鼠体重变化和生存情况。

1.2.3 小鼠肠通透性检测 使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖，Sigma-Aldrich，，MO，USA）测量活体小鼠肠通透性。采小鼠外周血与磷酸缓冲液（Phosphatic buffer solution，PBS）溶液1∶3体积稀释，测血清中FITC含量，进而绘制标准曲线。简单来说，先将小鼠禁食6 h，然后给予50 mg/mL的FITC-葡聚糖灌胃处理（0.6 mg/g体重）。1 h后，经尾静脉采血120 μL。然后按照前述方案给予小鼠DSS。14 d后，在实验结束或处死小鼠前同样给予50 mg/mL FITC-葡聚糖灌胃（0.6 mg/g体重），后经心脏采血120 μL。将收集到的血液离心，用PBS溶液1∶1体积稀释血浆。使用多功能酶标仪（BioTek，Winooski，VT，USA）在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测FITC-葡聚糖浓度。

1.2.4 结肠组织学 10%福尔马林固定结肠切片组织，苏木精和伊红染色（H&E）。显微镜（Olympus IX70，Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan）下观察。

1.2.5 制备结肠组织细胞悬液 颈椎脱位法处死小鼠，取仰卧位，打开腹腔。切取结肠测量长度，清理肠道内容物，并用含1%胎牛血清（Foetal bovine serum，FBS）和不含钙镁离子的平衡盐溶液（Free of calcium and magnesium，CMF-HBSS）清洗肠道。将结肠切至2 mm大小，浸泡在含有3 mM[3]乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的CMF-HBSS中，置于台式恒温振荡器振荡，37℃，180 rpm/min。振荡30 min后离心，用含1 mg/mL

Ⅳ型胶原酶和DNA酶I的HBSS溶液消化沉淀1.5 h，300目网筛过滤去除杂质和未消化的组织块后，得到小鼠结肠组织的细胞悬浮液。

1.2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA） 将上述得到的小鼠结肠细胞悬液离心，用PBS液洗2次，然后用含10%FBS的无血清细胞冻存培养基（Roswell park memorial institute，RPMI）1640重悬。细胞计数后，接种细胞至24孔板（每孔4×105细胞），培养24 h。ELISA试剂盒

（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）測上清中肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）浓度。

1.3 统计学处理

所有实验至少重复3次，结果以均数±标准差表示。使用GraphPad Prism5.0（GraphPad，San Diego，CA），采取单因素方差分析（One-way ANOVA）和邓肯检验（Duncan′s test）分析数据。P

2 结果

2.1 S1PR2-/-小鼠易感DSS诱导的结肠炎

本研究构建了S1PR2基因敲除小鼠（S1PR2-/-），以正常小鼠作为对照，比较两者对DSS诱导的结肠炎的敏感性。给予小鼠2%DSS溶液共7 d以诱导结肠炎，最终在第14天处死小鼠。体重减轻30%可视为人道终点。图1A显示了小鼠结肠组织中S1PR2蛋白的表达，表明成功建立了S1PR2-/-小鼠。2%DSS处理7 d后，WT和S1PR2-/-小鼠的存活率分别为80%和40%，表明DSS处理后S1PR2-/-小鼠的存活率较低（图1B）。此外，WT小鼠的体重总是高于S1PR 2-/-小鼠，表明S1PR2-/-小鼠的体重下降比WT小鼠更显著（图1C）。

1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1，S1P）是一种在生理和病理条件下参与调解多种细胞功能的活性鞘脂。S1P可以直接作为细胞内信号分子或细胞外通过激活5个G蛋白偶联受体（G

protein-coupled receptors，GPCRs）发挥作用[3]。过去二十年，对S1P及其受体在健康和疾病中的作用进行了大量的研究。研究已经表明S1P是多种类型的细胞增殖、迁移和存活的一个关键调节因子[4]。在不同的组织或器官中5种S1PRs的表达具有差异性[5]。在人腸道内，所有5种（Sphingosine-1-phosphate receptors，S1PRs）均能被检测到，但是S1PRs表达水平不一。前期已有文献报道，S1P通过激活S1PR1调节粘着连接蛋白E-cadherin的表达增强肠上皮细胞屏障功能[6]。同时也有文献报道，S1P通过Akt依赖途径防止肠上皮细胞凋亡[7]。这些研究表明，S1P及其受体能够促进肠上皮细胞增殖和增强上皮细胞屏障功能，对肠黏膜屏障起到保护作用。S1PR2在肠上皮细胞增殖和上皮细胞屏障中的作用未见报道，而笔者的前期研究发现，S1PR2在肠上皮细胞高表达，是S1P在肠上皮细胞的主要受体，因而S1PR2对肠黏膜屏障保护作用值得研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采用C57BL/6小鼠，8～12周，体重中位数22.5 g，雌雄不限，生活环境控温控湿，具有12 h昼夜循环，并提供充足食水，每周换笼2次。S1PR2基因敲除小鼠[实验动物许可证：SYXK（浙）2018-0017]如前制备[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 动物处理 繁殖并验证C57BL/6来源的S1PR2-/-小鼠品系。利用S1PR2-/-小鼠，并以野生型（Wild type，WT）鼠为对照。用含有2.5%的硫酸葡聚糖钠盐（Dextra sulfare sodium，DSS）的水喂养小鼠7 d，以诱导结肠炎。1周后更换正常不含DSS的水，继续喂养小鼠1周，并在第14天处死。本动物实验通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会。

1.2.2 小鼠一般状况观察 以喂食DSS开始算起，取0、4、7和14 d小鼠结肠和血，每个时间点各取WT和KO 6只，解剖小鼠并检测结肠长度。每天称量小鼠体重和收取粪便，记录小鼠体重变化和生存情况。

1.2.3 小鼠肠通透性检测 使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖，Sigma-Aldrich，，MO，USA）测量活体小鼠肠通透性。采小鼠外周血与磷酸缓冲液（Phosphatic buffer solution，PBS）溶液1∶3体积稀释，测血清中FITC含量，进而绘制标准曲线。简单来说，先将小鼠禁食6 h，然后给予50 mg/mL的FITC-葡聚糖灌胃处理（0.6 mg/g体重）。1 h后，经尾静脉采血120 μL。然后按照前述方案给予小鼠DSS。14 d后，在实验结束或处死小鼠前同样给予50 mg/mL FITC-葡聚糖灌胃（0.6 mg/g体重），后经心脏采血120 μL。将收集到的血液离心，用PBS溶液1∶1体积稀释血浆。使用多功能酶标仪（BioTek，Winooski，VT，USA）在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测FITC-葡聚糖浓度。

1.2.4 结肠组织学 10%福尔马林固定结肠切片组织，苏木精和伊红染色（H&E）。显微镜（Olympus IX70，Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan）下观察。

1.2.5 制备结肠组织细胞悬液 颈椎脱位法处死小鼠，取仰卧位，打开腹腔。切取结肠测量长度，清理肠道内容物，并用含1%胎牛血清（Foetal bovine serum，FBS）和不含钙镁离子的平衡盐溶液（Free of calcium and magnesium，CMF-HBSS）清洗肠道。将结肠切至2 mm大小，浸泡在含有3 mM[3]乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的CMF-HBSS中，置于台式恒温振荡器振荡，37℃，180 rpm/min。振荡30 min后离心，用含1 mg/mL

Ⅳ型胶原酶和DNA酶I的HBSS溶液消化沉淀1.5 h，300目网筛过滤去除杂质和未消化的组织块后，得到小鼠结肠组织的细胞悬浮液。

1.2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA） 将上述得到的小鼠结肠细胞悬液离心，用PBS液洗2次，然后用含10%FBS的无血清细胞冻存培养基（Roswell park memorial institute，RPMI）1640重悬。细胞计数后，接种细胞至24孔板（每孔4×105细胞），培养24 h。ELISA试剂盒

（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）测上清中肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）浓度。

1.3 统计学处理

所有实验至少重复3次，结果以均数±标准差表示。使用GraphPad Prism5.0（GraphPad，San Diego，CA），采取单因素方差分析（One-way ANOVA）和邓肯检验（Duncan′s test）分析数据。P

2 结果

2.1 S1PR2-/-小鼠易感DSS诱导的结肠炎

本研究构建了S1PR2基因敲除小鼠（S1PR2-/-），以正常小鼠作为对照，比较两者对DSS诱导的结肠炎的敏感性。给予小鼠2%DSS溶液共7 d以诱导结肠炎，最终在第14天处死小鼠。体重减轻30%可视为人道终点。图1A显示了小鼠结肠组织中S1PR2蛋白的表达，表明成功建立了S1PR2-/-小鼠。2%DSS处理7 d后，WT和S1PR2-/-小鼠的存活率分别为80%和40%，表明DSS处理后S1PR2-/-小鼠的存活率较低（图1B）。此外，WT小鼠的体重总是高于S1PR 2-/-小鼠，表明S1PR2-/-小鼠的体重下降比WT小鼠更显著（图1C）。

1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1，S1P）是一种在生理和病理条件下参与调解多种细胞功能的活性鞘脂。S1P可以直接作为细胞内信号分子或细胞外通过激活5個G蛋白偶联受体（G

protein-coupled receptors，GPCRs）发挥作用[3]。过去二十年，对S1P及其受体在健康和疾病中的作用进行了大量的研究。研究已经表明S1P是多种类型的细胞增殖、迁移和存活的一个关键调节因子[4]。在不同的组织或器官中5种S1PRs的表达具有差异性[5]。在人肠道内，所有5种（Sphingosine-1-phosphate receptors，S1PRs）均能被检测到，但是S1PRs表达水平不一。前期已有文献报道，S1P通过激活S1PR1调节粘着连接蛋白E-cadherin的表达增强肠上皮细胞屏障功能[6]。同时也有文献报道，S1P通过Akt依赖途径防止肠上皮细胞凋亡[7]。这些研究表明，S1P及其受体能够促进肠上皮细胞增殖和增强上皮细胞屏障功能，对肠黏膜屏障起到保护作用。S1PR2在肠上皮细胞增殖和上皮细胞屏障中的作用未见报道，而笔者的前期研究发现，S1PR2在肠上皮细胞高表达，是S1P在肠上皮细胞的主要受体，因而S1PR2对肠黏膜屏障保护作用值得研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采用C57BL/6小鼠，8～12周，体重中位数22.5 g，雌雄不限，生活环境控温控湿，具有12 h昼夜循环，并提供充足食水，每周换笼2次。S1PR2基因敲除小鼠[实验动物许可证：SYXK（浙）2018-0017]如前制备[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 动物处理 繁殖并验证C57BL/6来源的S1PR2-/-小鼠品系。利用S1PR2-/-小鼠，并以野生型（Wild type，WT）鼠为对照。用含有2.5%的硫酸葡聚糖钠盐（Dextra sulfare sodium，DSS）的水喂养小鼠7 d，以诱导结肠炎。1周后更换正常不含DSS的水，继续喂养小鼠1周，并在第14天处死。本动物实验通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会。

1.2.2 小鼠一般状况观察 以喂食DSS开始算起，取0、4、7和14 d小鼠结肠和血，每个时间点各取WT和KO 6只，解剖小鼠并检测结肠长度。每天称量小鼠体重和收取粪便，记录小鼠体重变化和生存情况。

1.2.3 小鼠肠通透性检测 使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖，Sigma-Aldrich，，MO，USA）测量活体小鼠肠通透性。采小鼠外周血与磷酸缓冲液（Phosphatic buffer solution，PBS）溶液1∶3体积稀释，测血清中FITC含量，进而绘制标准曲线。简单来说，先将小鼠禁食6 h，然后给予50 mg/mL的FITC-葡聚糖灌胃处理（0.6 mg/g体重）。1 h后，经尾静脉采血120 μL。然后按照前述方案给予小鼠DSS。14 d后，在实验结束或处死小鼠前同样给予50 mg/mL FITC-葡聚糖灌胃（0.6 mg/g体重），后经心脏采血120 μL。将收集到的血液离心，用PBS溶液1∶1体积稀释血浆。使用多功能酶标仪（BioTek，Winooski，VT，USA）在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测FITC-葡聚糖浓度。

1.2.4 结肠组织学 10%福尔马林固定结肠切片组织，苏木精和伊红染色（H&E）。显微镜（Olympus IX70，Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan）下观察。

1.2.5 制备结肠组织细胞悬液 颈椎脱位法处死小鼠，取仰卧位，打开腹腔。切取结肠测量长度，清理肠道内容物，并用含1%胎牛血清（Foetal bovine serum，FBS）和不含钙镁离子的平衡盐溶液（Free of calcium and magnesium，CMF-HBSS）清洗肠道。将结肠切至2 mm大小，浸泡在含有3 mM[3]乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的CMF-HBSS中，置于台式恒温振荡器振荡，37℃，180 rpm/min。振荡30 min后离心，用含1 mg/mL

Ⅳ型胶原酶和DNA酶I的HBSS溶液消化沉淀1.5 h，300目网筛过滤去除杂质和未消化的组织块后，得到小鼠结肠组织的细胞悬浮液。

1.2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA） 将上述得到的小鼠结肠细胞悬液离心，用PBS液洗2次，然后用含10%FBS的无血清细胞冻存培养基（Roswell park memorial institute，RPMI）1640重悬。细胞计数后，接种细胞至24孔板（每孔4×105细胞），培养24 h。ELISA试剂盒

（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）测上清中肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）浓度。

1.3 统计学处理

所有实验至少重复3次，结果以均数±标准差表示。使用GraphPad Prism5.0（GraphPad，San Diego，CA），采取单因素方差分析（One-way ANOVA）和邓肯检验（Duncan′s test）分析数据。P

2 结果

2.1 S1PR2-/-小鼠易感DSS诱导的结肠炎

本研究构建了S1PR2基因敲除小鼠（S1PR2-/-），以正常小鼠作为对照，比较两者对DSS诱导的结肠炎的敏感性。给予小鼠2%DSS溶液共7 d以诱导结肠炎，最终在第14天处死小鼠。体重减轻30%可视为人道终点。图1A显示了小鼠结肠组织中S1PR2蛋白的表达，表明成功建立了S1PR2-/-小鼠。2%DSS处理7 d后，WT和S1PR2-/-小鼠的存活率分别为80%和40%，表明DSS处理后S1PR2-/-小鼠的存活率较低（图1B）。此外，WT小鼠的体重总是高于S1PR 2-/-小鼠，表明S1PR2-/-小鼠的体重下降比WT小鼠更显著（图1C）。

2024年2月27日发(作者：卫凝丝)

１－磷酸鞘氨醇受体２（Ｓ１ＰＲ２）通过保护肠黏膜屏障功能缓解炎症性肠病的作用

作者：薛海波 宋冰欣 丁莉 马丽丽 潘贻飞 陈坛辀

来源：《中国现代医生》2021年第15期

[关键词] 1-磷酸鞘氨醇;1-磷酸鞘氨醇受体2;肠黏膜屏障功能;炎症性肠病

[中图分类号] R331.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）15-0032-05

Effect of 1-phosphossphingosine receptor 2（S1PR2） on relieving inflammatory bowel disease

by protecting intestinal mucosal barrier function

XUE Haibo1 SONG Bingxin1 DING Li1 MA Lili2 PAN Yifei3 CHEN Tanzhou1

ment of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical

University， Wenzhou 325000，China; ment of Rheumatology and Immunology， the First

Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China; ment of

Colorectal and Anal Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，

Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 1-phossphingosine receptor 2（S1PR2） on

relieving inflammatory bowel disease （IBD） by protecting the intestinal mucosal barrier. Methods

S1PR2 gene knockout mice were constructed. Dextran sulfate sodium salt （DSS） was used to

induce colitis. Serum fluorescein isothiocyanate （FITC） concentration was measured for intestinal

permeability of mice in vitro and in vivo. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α），

interleukin-6 （IL-6） and interferon-γ （IFN-γ） in cell suspensions were determined by enzyme-

linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The survival rate and body weights of wild-type（WT） mice were higher than those of S1PR2-/- mice， and the differences were statistically

significant（P

[Key words] 1-phosphossphingosine; 1-phosphossphingosine receptor 2 （S1PR2）; Intestinal

mucosal barrier function; Inflammatory bowel disease

炎癥性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一种胃肠黏膜存在持续性炎症反应导致胃肠结构和功能紊乱的特发性肠道炎症性疾病，临床表现为腹泻、腹痛，甚至可有血便，主要包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn′s disease，CD）。炎症性肠病的病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用，认为其是由多因素相互作用所致，主要包括遗传、免疫因素、环境和微生物[1]。其治疗手段有限，反复发作的特性和可能的恶变倾向给临床医师和患者带来很大困扰，急需研究其发病机制，为临床治疗提供依据。

肠黏膜屏障是机体抵御外环境侵袭的重要屏障。肠黏膜屏障主要由机械屏障、生物屏障、化学屏障及免疫屏障组成。其中机械屏障最为重要，机械屏障由肠上皮细胞及其连接构成，调控着水和溶质的跨上皮运输。肠上皮细胞间的连接方式有多种，包括紧密连接、粘附连接和缝隙连接及桥粒等[2]。肠上皮紧密连接的损伤参与了多种疾病的进展。因此，维持完整的肠上皮细胞紧密连接对保护肠屏障功能、防止细菌移位及毒性大分子进入人体有重要的意义。由细胞间连接变化引起的细胞通透性改变导致的肠黏膜屏障功能失调是IBD的发病机制中的一个关键因素。

1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1，S1P）是一种在生理和病理条件下参与调解多种细胞功能的活性鞘脂。S1P可以直接作为细胞内信号分子或细胞外通过激活5个G蛋白偶联受体（G

protein-coupled receptors，GPCRs）发挥作用[3]。过去二十年，对S1P及其受体在健康和疾病中的作用进行了大量的研究。研究已经表明S1P是多种类型的细胞增殖、迁移和存活的一个关键调节因子[4]。在不同的组织或器官中5种S1PRs的表达具有差异性[5]。在人肠道内，所有5种（Sphingosine-1-phosphate receptors，S1PRs）均能被检测到，但是S1PRs表达水平不一。前期已有文献报道，S1P通过激活S1PR1调节粘着连接蛋白E-cadherin的表达增强肠上皮细胞屏障功能[6]。同时也有文献报道，S1P通过Akt依赖途径防止肠上皮细胞凋亡[7]。这些研究表明，S1P及其受体能够促进肠上皮细胞增殖和增强上皮细胞屏障功能，对肠黏膜屏障起到保护作用。S1PR2在肠上皮细胞增殖和上皮细胞屏障中的作用未见报道，而笔者的前期研究发现，S1PR2在肠上皮细胞高表达，是S1P在肠上皮细胞的主要受体，因而S1PR2对肠黏膜屏障保护作用值得研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采用C57BL/6小鼠，8～12周，体重中位数22.5 g，雌雄不限，生活环境控温控湿，具有12 h昼夜循环，并提供充足食水，每周换笼2次。S1PR2基因敲除小鼠[实验动物许可证：SYXK（浙）2018-0017]如前制备[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 动物处理 繁殖并验证C57BL/6来源的S1PR2-/-小鼠品系。利用S1PR2-/-小鼠，并以野生型（Wild type，WT）鼠为对照。用含有2.5%的硫酸葡聚糖钠盐（Dextra sulfare sodium，DSS）的水喂养小鼠7 d，以诱导结肠炎。1周后更换正常不含DSS的水，继续喂养小鼠1周，并在第14天处死。本动物实验通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会。

1.2.2 小鼠一般状况观察 以喂食DSS开始算起，取0、4、7和14 d小鼠结肠和血，每个时间点各取WT和KO 6只，解剖小鼠并检测结肠长度。每天称量小鼠体重和收取粪便，记录小鼠体重变化和生存情况。

1.2.3 小鼠肠通透性检测 使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖，Sigma-Aldrich，，MO，USA）测量活体小鼠肠通透性。采小鼠外周血与磷酸缓冲液（Phosphatic buffer solution，PBS）溶液1∶3体积稀释，测血清中FITC含量，进而绘制标准曲线。简单来说，先将小鼠禁食6 h，然后给予50 mg/mL的FITC-葡聚糖灌胃处理（0.6 mg/g体重）。1 h后，经尾静脉采血120 μL。然后按照前述方案给予小鼠DSS。14 d后，在实验结束或处死小鼠前同样给予50 mg/mL FITC-葡聚糖灌胃（0.6 mg/g体重），后经心脏采血120 μL。将收集到的血液离心，用PBS溶液1∶1体积稀释血浆。使用多功能酶标仪（BioTek，Winooski，VT，USA）在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测FITC-葡聚糖浓度。

1.2.4 结肠组织学 10%福尔马林固定结肠切片组织，苏木精和伊红染色（H&E）。显微镜（Olympus IX70，Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan）下观察。

1.2.5 制备结肠组织细胞悬液 颈椎脱位法处死小鼠，取仰卧位，打开腹腔。切取结肠测量长度，清理肠道内容物，并用含1%胎牛血清（Foetal bovine serum，FBS）和不含钙镁离子的平衡盐溶液（Free of calcium and magnesium，CMF-HBSS）清洗肠道。将结肠切至2 mm大小，浸泡在含有3 mM[3]乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的CMF-HBSS中，置于台式恒温振荡器振荡，37℃，180 rpm/min。振荡30 min后离心，用含1 mg/mL

Ⅳ型胶原酶和DNA酶I的HBSS溶液消化沉淀1.5 h，300目网筛过滤去除杂质和未消化的组织块后，得到小鼠结肠组织的细胞悬浮液。

1.2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA） 将上述得到的小鼠结肠细胞悬液离心，用PBS液洗2次，然后用含10%FBS的无血清细胞冻存培养基（Roswell park memorial institute，RPMI）1640重悬。细胞计数后，接种细胞至24孔板（每孔4×105细胞），培养24 h。ELISA试剂盒

（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）測上清中肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）浓度。

1.3 统计学处理

所有实验至少重复3次，结果以均数±标准差表示。使用GraphPad Prism5.0（GraphPad，San Diego，CA），采取单因素方差分析（One-way ANOVA）和邓肯检验（Duncan′s test）分析数据。P

2 结果

2.1 S1PR2-/-小鼠易感DSS诱导的结肠炎

本研究构建了S1PR2基因敲除小鼠（S1PR2-/-），以正常小鼠作为对照，比较两者对DSS诱导的结肠炎的敏感性。给予小鼠2%DSS溶液共7 d以诱导结肠炎，最终在第14天处死小鼠。体重减轻30%可视为人道终点。图1A显示了小鼠结肠组织中S1PR2蛋白的表达，表明成功建立了S1PR2-/-小鼠。2%DSS处理7 d后，WT和S1PR2-/-小鼠的存活率分别为80%和40%，表明DSS处理后S1PR2-/-小鼠的存活率较低（图1B）。此外，WT小鼠的体重总是高于S1PR 2-/-小鼠，表明S1PR2-/-小鼠的体重下降比WT小鼠更显著（图1C）。

1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1，S1P）是一种在生理和病理条件下参与调解多种细胞功能的活性鞘脂。S1P可以直接作为细胞内信号分子或细胞外通过激活5个G蛋白偶联受体（G

protein-coupled receptors，GPCRs）发挥作用[3]。过去二十年，对S1P及其受体在健康和疾病中的作用进行了大量的研究。研究已经表明S1P是多种类型的细胞增殖、迁移和存活的一个关键调节因子[4]。在不同的组织或器官中5种S1PRs的表达具有差异性[5]。在人腸道内，所有5种（Sphingosine-1-phosphate receptors，S1PRs）均能被检测到，但是S1PRs表达水平不一。前期已有文献报道，S1P通过激活S1PR1调节粘着连接蛋白E-cadherin的表达增强肠上皮细胞屏障功能[6]。同时也有文献报道，S1P通过Akt依赖途径防止肠上皮细胞凋亡[7]。这些研究表明，S1P及其受体能够促进肠上皮细胞增殖和增强上皮细胞屏障功能，对肠黏膜屏障起到保护作用。S1PR2在肠上皮细胞增殖和上皮细胞屏障中的作用未见报道，而笔者的前期研究发现，S1PR2在肠上皮细胞高表达，是S1P在肠上皮细胞的主要受体，因而S1PR2对肠黏膜屏障保护作用值得研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采用C57BL/6小鼠，8～12周，体重中位数22.5 g，雌雄不限，生活环境控温控湿，具有12 h昼夜循环，并提供充足食水，每周换笼2次。S1PR2基因敲除小鼠[实验动物许可证：SYXK（浙）2018-0017]如前制备[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 动物处理 繁殖并验证C57BL/6来源的S1PR2-/-小鼠品系。利用S1PR2-/-小鼠，并以野生型（Wild type，WT）鼠为对照。用含有2.5%的硫酸葡聚糖钠盐（Dextra sulfare sodium，DSS）的水喂养小鼠7 d，以诱导结肠炎。1周后更换正常不含DSS的水，继续喂养小鼠1周，并在第14天处死。本动物实验通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会。

1.2.2 小鼠一般状况观察 以喂食DSS开始算起，取0、4、7和14 d小鼠结肠和血，每个时间点各取WT和KO 6只，解剖小鼠并检测结肠长度。每天称量小鼠体重和收取粪便，记录小鼠体重变化和生存情况。

1.2.3 小鼠肠通透性检测 使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖，Sigma-Aldrich，，MO，USA）测量活体小鼠肠通透性。采小鼠外周血与磷酸缓冲液（Phosphatic buffer solution，PBS）溶液1∶3体积稀释，测血清中FITC含量，进而绘制标准曲线。简单来说，先将小鼠禁食6 h，然后给予50 mg/mL的FITC-葡聚糖灌胃处理（0.6 mg/g体重）。1 h后，经尾静脉采血120 μL。然后按照前述方案给予小鼠DSS。14 d后，在实验结束或处死小鼠前同样给予50 mg/mL FITC-葡聚糖灌胃（0.6 mg/g体重），后经心脏采血120 μL。将收集到的血液离心，用PBS溶液1∶1体积稀释血浆。使用多功能酶标仪（BioTek，Winooski，VT，USA）在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测FITC-葡聚糖浓度。

1.2.4 结肠组织学 10%福尔马林固定结肠切片组织，苏木精和伊红染色（H&E）。显微镜（Olympus IX70，Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan）下观察。

1.2.5 制备结肠组织细胞悬液 颈椎脱位法处死小鼠，取仰卧位，打开腹腔。切取结肠测量长度，清理肠道内容物，并用含1%胎牛血清（Foetal bovine serum，FBS）和不含钙镁离子的平衡盐溶液（Free of calcium and magnesium，CMF-HBSS）清洗肠道。将结肠切至2 mm大小，浸泡在含有3 mM[3]乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的CMF-HBSS中，置于台式恒温振荡器振荡，37℃，180 rpm/min。振荡30 min后离心，用含1 mg/mL

Ⅳ型胶原酶和DNA酶I的HBSS溶液消化沉淀1.5 h，300目网筛过滤去除杂质和未消化的组织块后，得到小鼠结肠组织的细胞悬浮液。

1.2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA） 将上述得到的小鼠结肠细胞悬液离心，用PBS液洗2次，然后用含10%FBS的无血清细胞冻存培养基（Roswell park memorial institute，RPMI）1640重悬。细胞计数后，接种细胞至24孔板（每孔4×105细胞），培养24 h。ELISA试剂盒

（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）测上清中肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）浓度。

1.3 统计学处理

所有实验至少重复3次，结果以均数±标准差表示。使用GraphPad Prism5.0（GraphPad，San Diego，CA），采取单因素方差分析（One-way ANOVA）和邓肯检验（Duncan′s test）分析数据。P

2 结果

2.1 S1PR2-/-小鼠易感DSS诱导的结肠炎

本研究构建了S1PR2基因敲除小鼠（S1PR2-/-），以正常小鼠作为对照，比较两者对DSS诱导的结肠炎的敏感性。给予小鼠2%DSS溶液共7 d以诱导结肠炎，最终在第14天处死小鼠。体重减轻30%可视为人道终点。图1A显示了小鼠结肠组织中S1PR2蛋白的表达，表明成功建立了S1PR2-/-小鼠。2%DSS处理7 d后，WT和S1PR2-/-小鼠的存活率分别为80%和40%，表明DSS处理后S1PR2-/-小鼠的存活率较低（图1B）。此外，WT小鼠的体重总是高于S1PR 2-/-小鼠，表明S1PR2-/-小鼠的体重下降比WT小鼠更显著（图1C）。

1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1，S1P）是一种在生理和病理条件下参与调解多种细胞功能的活性鞘脂。S1P可以直接作为细胞内信号分子或细胞外通过激活5個G蛋白偶联受体（G

protein-coupled receptors，GPCRs）发挥作用[3]。过去二十年，对S1P及其受体在健康和疾病中的作用进行了大量的研究。研究已经表明S1P是多种类型的细胞增殖、迁移和存活的一个关键调节因子[4]。在不同的组织或器官中5种S1PRs的表达具有差异性[5]。在人肠道内，所有5种（Sphingosine-1-phosphate receptors，S1PRs）均能被检测到，但是S1PRs表达水平不一。前期已有文献报道，S1P通过激活S1PR1调节粘着连接蛋白E-cadherin的表达增强肠上皮细胞屏障功能[6]。同时也有文献报道，S1P通过Akt依赖途径防止肠上皮细胞凋亡[7]。这些研究表明，S1P及其受体能够促进肠上皮细胞增殖和增强上皮细胞屏障功能，对肠黏膜屏障起到保护作用。S1PR2在肠上皮细胞增殖和上皮细胞屏障中的作用未见报道，而笔者的前期研究发现，S1PR2在肠上皮细胞高表达，是S1P在肠上皮细胞的主要受体，因而S1PR2对肠黏膜屏障保护作用值得研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采用C57BL/6小鼠，8～12周，体重中位数22.5 g，雌雄不限，生活环境控温控湿，具有12 h昼夜循环，并提供充足食水，每周换笼2次。S1PR2基因敲除小鼠[实验动物许可证：SYXK（浙）2018-0017]如前制备[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 动物处理 繁殖并验证C57BL/6来源的S1PR2-/-小鼠品系。利用S1PR2-/-小鼠，并以野生型（Wild type，WT）鼠为对照。用含有2.5%的硫酸葡聚糖钠盐（Dextra sulfare sodium，DSS）的水喂养小鼠7 d，以诱导结肠炎。1周后更换正常不含DSS的水，继续喂养小鼠1周，并在第14天处死。本动物实验通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会。

1.2.2 小鼠一般状况观察 以喂食DSS开始算起，取0、4、7和14 d小鼠结肠和血，每个时间点各取WT和KO 6只，解剖小鼠并检测结肠长度。每天称量小鼠体重和收取粪便，记录小鼠体重变化和生存情况。

1.2.3 小鼠肠通透性检测 使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖，Sigma-Aldrich，，MO，USA）测量活体小鼠肠通透性。采小鼠外周血与磷酸缓冲液（Phosphatic buffer solution，PBS）溶液1∶3体积稀释，测血清中FITC含量，进而绘制标准曲线。简单来说，先将小鼠禁食6 h，然后给予50 mg/mL的FITC-葡聚糖灌胃处理（0.6 mg/g体重）。1 h后，经尾静脉采血120 μL。然后按照前述方案给予小鼠DSS。14 d后，在实验结束或处死小鼠前同样给予50 mg/mL FITC-葡聚糖灌胃（0.6 mg/g体重），后经心脏采血120 μL。将收集到的血液离心，用PBS溶液1∶1体积稀释血浆。使用多功能酶标仪（BioTek，Winooski，VT，USA）在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测FITC-葡聚糖浓度。

1.2.4 结肠组织学 10%福尔马林固定结肠切片组织，苏木精和伊红染色（H&E）。显微镜（Olympus IX70，Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan）下观察。

1.2.5 制备结肠组织细胞悬液 颈椎脱位法处死小鼠，取仰卧位，打开腹腔。切取结肠测量长度，清理肠道内容物，并用含1%胎牛血清（Foetal bovine serum，FBS）和不含钙镁离子的平衡盐溶液（Free of calcium and magnesium，CMF-HBSS）清洗肠道。将结肠切至2 mm大小，浸泡在含有3 mM[3]乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的CMF-HBSS中，置于台式恒温振荡器振荡，37℃，180 rpm/min。振荡30 min后离心，用含1 mg/mL

Ⅳ型胶原酶和DNA酶I的HBSS溶液消化沉淀1.5 h，300目网筛过滤去除杂质和未消化的组织块后，得到小鼠结肠组织的细胞悬浮液。

1.2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA） 将上述得到的小鼠结肠细胞悬液离心，用PBS液洗2次，然后用含10%FBS的无血清细胞冻存培养基（Roswell park memorial institute，RPMI）1640重悬。细胞计数后，接种细胞至24孔板（每孔4×105细胞），培养24 h。ELISA试剂盒

（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）测上清中肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）浓度。

1.3 统计学处理

所有实验至少重复3次，结果以均数±标准差表示。使用GraphPad Prism5.0（GraphPad，San Diego，CA），采取单因素方差分析（One-way ANOVA）和邓肯检验（Duncan′s test）分析数据。P

2 结果

2.1 S1PR2-/-小鼠易感DSS诱导的结肠炎

本研究构建了S1PR2基因敲除小鼠（S1PR2-/-），以正常小鼠作为对照，比较两者对DSS诱导的结肠炎的敏感性。给予小鼠2%DSS溶液共7 d以诱导结肠炎，最终在第14天处死小鼠。体重减轻30%可视为人道终点。图1A显示了小鼠结肠组织中S1PR2蛋白的表达，表明成功建立了S1PR2-/-小鼠。2%DSS处理7 d后，WT和S1PR2-/-小鼠的存活率分别为80%和40%，表明DSS处理后S1PR2-/-小鼠的存活率较低（图1B）。此外，WT小鼠的体重总是高于S1PR 2-/-小鼠，表明S1PR2-/-小鼠的体重下降比WT小鼠更显著（图1C）。