2024年3月9日发(作者：佘子怡)
生物技术 世界生命科学与实验研究羊水亲子鉴定中STR基因座D5S818二步突变1例杨璐瑜1 张核子1 张付瑶1 叶宗博1 张茵1 胡利平2(1.广东华曦法医物证司法鉴定所 广东深圳 518000;2.昆明医科大学 云南昆明 650500)中图分类号:R89文献标识码:A文章编号:1674-2060(2015)05-0009-01短串联重复序列(short tandem repeats,STR)是人类的一类重要遗传标记,因其多态性丰富,扩增片断长度短,广泛地应用于亲子鉴定中。但是,STR 基因座在遗传的过程中发生突变的概率较高,因此在鉴定过程中是个不容忽视的问题,要值得注意。笔者在工作中遇一例较罕见的母亲发生二步突变的羊水检材鉴定,现报道如下。同时应用PowerPlex21和AGCU EX22复合扩增系统,胎儿与孕妇在D5S818位点的分型结果一致,不符合遗传规律。结果见表1。R2.2 12个位点X-STR基因座分型结果分析12位点X-STR基因座检测结果,胎儿的X-STR分型均能从孕妇及可疑父的分型中找到来源,符合X染色体遗传规律,结果见表2。1 案例资料1.1 案情简介李某(孕17周+),自然受孕,未确定腹中胎儿父亲是否为其老公,特委托本鉴定所鉴定是否存在亲子关系。2.3 STR亲权指数,累计亲权指数及亲权概率的计算亲权指数(paternity index,PI)、累积亲权指数(cumulativepaternity index,CPI)及相对父权概率(relative chance of paternity,RCP)的计算按文献报道的方法计算,计算所使用的相关等位基因分［1-2］布频率数据来自文献和司法部司法鉴定科学技术研究所2014年亲权鉴定能力验证资料中的相关数据,以及无锡中德美联生物技术有限公司所提供的频率表。经统计分析,本例22个STR总CPI值为123.32×10,累积亲子关系概率(RCP)为99.9999999999%,超过了认定父权的标准,因此可以确定可疑父是胎儿的生物学父亲。1.2 检验方法胎儿羊水5ml、男方带毛囊毛发2根、女方血样备用。采用Chelex-100 法分别提取DNA。经PowerPlex21 (普洛麦格生物技术有限公司)、AGCU EX22(无锡中德美联生物技术有限公司)复合扩增系统以及Investigator ArgusX-12(德国QIAGEN公司)扩增系统进行扩增,扩增产物在ABI3500型DNA测序仪上电泳,由GeneMapper ID X1.3软件进行结果分析。RR3 讨论羊水中含有丰富的胎儿细胞成分,是很好的生物学检材,在本案例中,用两个不同厂家的扩增试剂对相同样本进行检验,结果一样,而且孕妇为自然妊娠,因此胎儿与孕妇的亲子关系是确定的,因此可以确定胎儿在D5S818位点发生母源性突变,父权指数应按照符合遗传规律的方法计算。增加的12位点X-STR的基因座未发现不符合遗传规律地情况,进一步验证了孕妇与胎儿之间的亲子关系。X染色体特异性的STR作为特殊的遗传标记具有重要的应用价值,是常染色体STR分型的重要补充方。现有的资料表明,STR突变是DNA 复制滑动的结果或DNA复制的错误修复而造成的,STR突变是符合逐步突变模式(Stepwise Mutation Model,SMM)的,即每次突变只改变一个重复单位,两个或更多个重复单位的变化是在前一次突变基础上发生的,也就是多步突变是逐步形成的。STR基因2 结果2.1 22个常染色体STR基因座分型结果表1 22个常染色体STR 基因座分型结果STR
AMEL
D3S1358
D1S1656
D6S1043
D13S317
Penta E
D16S539
D18S51
D2S1338
CSF1PO
Penta D
TH01
vWA
D21S11
D7S820
D5S818
TPOX
D8S1179
D12S391
D19S433
FGA
D2S441
D10S1248
孕妇
X
15
15
11
8
10
9
15
23
10
8
8
17
29
11
13
8
13
19
13
21
9
12
X
16
15
13
8
19
12
21
23
12
9
9
18
31
11
13
11
14
23
16
24
12
14
胎儿
X
15
13
11
8
11
10
21
18
12
8
9
16
31
8
10
8
12
18
14
21
10
12
X
17
15
13
8
19
12
21
23
12
9
9
17
33
11
11
11
14
19
16
25
12
14
疑父
X
14
13
12
8
11
9
16
18
12
9
9
16
30
8
10
8
12
17
13
23
10
12
Y
17
13
13
10
13
10
21
19
12
9
9
17
33
9
10
11
13
18
14
25
10
12
PI
1
1.4480
3.2626
4.5703
3.4794
9.3808
2.4295
23.2558
4.9236
1.3564
7.2358
0.9587
1.2484
5.0251
2.8810
5.2219
1.2310
2.6997
2.1815
79.3650
4.6641
4.0617
4.5324
······下转第15页表2 12个位点X-STR基因座分型结果STR
DXS10103
DXS8378
DXS7132
DXS10134
DXS10074
DXS10101
DXS10135
DXS7423
DXS10146
DXS10079
HPRTB
DXS10148
孕妇
19
10
13
36
17
28
18
15
27
19
12
23.1
19
10
14
39
18
31.2
26
15
27
21
13
24.1
胎儿
17
10
13
36
17
31.2
18
15
27
19
13
24.1
19
10
14
39
18
32
22
15
27
21
15
24.1
疑父
17
10
13
36
17
32
22
14
27
20
14
22.1
19
11
15
37
18
32
23
15
27
21
15
24.1
作者简介:杨璐瑜(1987—),女,汉族,山西太原人,法医学硕士,助理法医师,研究方向:从事法医物证学鉴定、科研。通讯作者:胡利平(1979—),汉族,重庆江津人,实验师,法医学硕士,研究方向:从事法医物证学教学、科研以及社会服务。BIOTECHWORLD 生物技术世界9
生物技术 世界生命科学与实验研究methods for polymerase chain reaction amplification from for-malin-fixed and paraffin-embedded tissues.[J].Diagn Mol Paehol,2001,10(4):265.[2]BielawskiK,Zaczed,LisowskaU,tability of DNA ex-tracted from formalin-fixed,Paraffin-embdded tissues for doubledifferential polymerase chain reaction analysis.[J].Int JMolMed,2001,8(5):573.[3]Mies C,Houldsworth ti tion of DNA fromparaffin blocks for Southern bolt analysis.[J].Am J Surg Pathol,1991,15(2):169-174.[4]石蜡包埋组织基因组DNA提取的条件优化,临床与试验病理学杂志,J Clin Exp Pathol,2011,Sep;27(9):1021-1023.[5]Warford A,Pringle JH,Hay J,et rn blot analysis ofDNA extracted from formal-saline fixed and paraffin wax em-bedded tissue[J].J Pathol,1988,154(4):313-320.[6]Isola J,DeVries S,Chu L,et is of changes in DNAsequence copy number by comparative genomic hybridization inarchival paraffin-embedded tumor J Pathol;1994,145:1301-1308.[7]Lonn U,Lonn S,Nilsson B,et tration of gene-ampli-fication by PCR in archival paraffin-embedded breast Cancer Res Treat,1994;30:147-152.了90℃过夜,蛋白酶K消化时间的延长,减少了蛋白的污染,使DNA纯度提高。消化时间是一个在学术界尚无定论的问题,有人认为消化时间应适当延长,最长者有报道经7天消化,可产生高质量的DNA[5];Isola等认为增加蛋白酶 K消化,能明显增加大分子量的DNA产量,这可能与蛋白酶 K 消化能部分逆转由固定导致的交联现象有关[6],但也有研究表明: 长时间蛋白酶K 消化,使短片段增加[7]。从我们实验中,我们也发现玻片形式组织延长消化时间后,片段分布范围更宽广。3.3 Tiangen试剂盒对切片和刮片形式的石蜡包埋组织提取DNA效果从图一和图四中可以看出切片形式和刮片形式包埋组织提取的DNA纯度差异不大,但刮片形式浓度比切片形式低,这可能跟手动刮取的石蜡包埋得组织量少有关。4 结论根据各自实验室条件和样本来源,如果样本已经是烤过片的玻片形式的石蜡包埋组织,可以选择改良的Qiagen试剂盒提取DNA(提取前增加一步二甲苯浸泡玻片脱蜡,试验中90℃水浴1h改为90℃过夜); 而样本如果是石蜡块包埋的组织,有切片机的,可以将石蜡包埋组织切成5um厚切片,8张为一组,用Tiangen试剂盒提取DNA;而没有切片机的实验室可以选择用刀片刮取石蜡块组织,刮尽量薄的组织片,大约8张为一组,用Tiangen试剂盒提取DNA。得到的DNA都可以满足后续PCR扩增及测序要求。参考文献[1]Satoy,Sugier,TsuchiyaB,son of the DNA extraction······上接第11页[7]薛向阳,孔繁东,祖国仁 等.食品抗高血压肽的研究进展和前景分析[J].食品研究与开发,2004(6):28-33.[8]蒋菁莉,任发政,蔡华伟.牛乳酪蛋白降血压肽的超滤分离[J].食品科学,2006(7):124-128.[9]刘萍,红岩.血脂异常与冠心病[J].现代中西医结合杂志,2006(3):265.[10]宋晓燕,高严祥,袁芳．Progress of collagen hydrolysis． FoodNutr Chin(中国食物与营养),2008(2):32-34.[11]丁进锋,苏秀榕.海蜇胶原蛋白肽的免疫活性的研究[J].水产科学,2011(6).······上接第9页座90％的突变为一步突变即1个重复单位的加或减,大于10个重复单位的基因座突变相比重复单位小于10的较多;一般的规律是突变来自父方是来自母方的0.7-14倍,多数基因座为3-6倍。本案例中的突变是由11到13,发生了两步突变,并且是母系来源的,国内尚未见报道。因此,在今后的鉴定工作中,在出现可能是突变的情况时,要注意以下几点:①应该用不同批次相同的试剂盒以及不同厂家的试剂盒进行重复验证,保证分型的正确;②如果是二联体,在补充亲生母亲的样本的同时增加STR位点。③必要时可进行测序来验证是否为真的突变。参考文献[1]周娟娟,洪素云.中国汉族人群15个因座遗传多态性研究及法医学应用[J].中国免疫学杂志,2004,(12):841-842．[2]黄霞,王芳,王蓉感,等.重庆地区汉族人群15个STR基因座遗传多态性研究[J].重庆医学,2008,37(1):58-60．······上接第8页参考文献[1]Liang P, Pardee A B. Differential display of eukaryoticmessenger RNA by means of the polymerase chain e, 1992, 257(5072): 967-971.[2]Hubank M, Schatz D fying differences in mRNA ex-pression by representional difference analysis of cDNA. NucleicAcids Research,1994,22:5640-5648.[3]Velculescu V E,Zhang L,Vogelstein B,Kinzler K W. Serial analysisof gene expression. Science,1995,270:484-487.[4]张小芳,金梅.DDRT-PCR技术研究进展. 安徽农学通报, 2008,14(20):29-30.[5]高雪.差异表达基因分离技术的研究进展. 生物技术通报, 2009,6:71-74.······上接第7页(2):358-363.[5]Zhang J,Chen S,Liu H,et en sulfide prevents hy-drogen peroxide-induced activation of epithelial sodium channelthrough a PTEN/PI(3,4,5)P3 dependent pathway[J]．PLoS One,2013,8(5):e64304．.[6]谭志成,闫燕,李荣山.外源性硫化氢在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用.中华肾脏病杂志,2012,28(8) :639-642.[7]覃志成,石媛媛,闰燕.硫化氢通过抑制NOD样受体途径减轻肾缺血再灌注损伤.中华肾脏病杂志,2014,30(8):HWORLD 生物技术世界15
2024年3月9日发(作者：佘子怡)
生物技术 世界生命科学与实验研究羊水亲子鉴定中STR基因座D5S818二步突变1例杨璐瑜1 张核子1 张付瑶1 叶宗博1 张茵1 胡利平2(1.广东华曦法医物证司法鉴定所 广东深圳 518000;2.昆明医科大学 云南昆明 650500)中图分类号:R89文献标识码:A文章编号:1674-2060(2015)05-0009-01短串联重复序列(short tandem repeats,STR)是人类的一类重要遗传标记,因其多态性丰富,扩增片断长度短,广泛地应用于亲子鉴定中。但是,STR 基因座在遗传的过程中发生突变的概率较高,因此在鉴定过程中是个不容忽视的问题,要值得注意。笔者在工作中遇一例较罕见的母亲发生二步突变的羊水检材鉴定,现报道如下。同时应用PowerPlex21和AGCU EX22复合扩增系统,胎儿与孕妇在D5S818位点的分型结果一致,不符合遗传规律。结果见表1。R2.2 12个位点X-STR基因座分型结果分析12位点X-STR基因座检测结果,胎儿的X-STR分型均能从孕妇及可疑父的分型中找到来源,符合X染色体遗传规律,结果见表2。1 案例资料1.1 案情简介李某(孕17周+),自然受孕,未确定腹中胎儿父亲是否为其老公,特委托本鉴定所鉴定是否存在亲子关系。2.3 STR亲权指数,累计亲权指数及亲权概率的计算亲权指数(paternity index,PI)、累积亲权指数(cumulativepaternity index,CPI)及相对父权概率(relative chance of paternity,RCP)的计算按文献报道的方法计算,计算所使用的相关等位基因分［1-2］布频率数据来自文献和司法部司法鉴定科学技术研究所2014年亲权鉴定能力验证资料中的相关数据,以及无锡中德美联生物技术有限公司所提供的频率表。经统计分析,本例22个STR总CPI值为123.32×10,累积亲子关系概率(RCP)为99.9999999999%,超过了认定父权的标准,因此可以确定可疑父是胎儿的生物学父亲。1.2 检验方法胎儿羊水5ml、男方带毛囊毛发2根、女方血样备用。采用Chelex-100 法分别提取DNA。经PowerPlex21 (普洛麦格生物技术有限公司)、AGCU EX22(无锡中德美联生物技术有限公司)复合扩增系统以及Investigator ArgusX-12(德国QIAGEN公司)扩增系统进行扩增,扩增产物在ABI3500型DNA测序仪上电泳,由GeneMapper ID X1.3软件进行结果分析。RR3 讨论羊水中含有丰富的胎儿细胞成分,是很好的生物学检材,在本案例中,用两个不同厂家的扩增试剂对相同样本进行检验,结果一样,而且孕妇为自然妊娠,因此胎儿与孕妇的亲子关系是确定的,因此可以确定胎儿在D5S818位点发生母源性突变,父权指数应按照符合遗传规律的方法计算。增加的12位点X-STR的基因座未发现不符合遗传规律地情况,进一步验证了孕妇与胎儿之间的亲子关系。X染色体特异性的STR作为特殊的遗传标记具有重要的应用价值,是常染色体STR分型的重要补充方。现有的资料表明,STR突变是DNA 复制滑动的结果或DNA复制的错误修复而造成的,STR突变是符合逐步突变模式(Stepwise Mutation Model,SMM)的,即每次突变只改变一个重复单位,两个或更多个重复单位的变化是在前一次突变基础上发生的,也就是多步突变是逐步形成的。STR基因2 结果2.1 22个常染色体STR基因座分型结果表1 22个常染色体STR 基因座分型结果STR
AMEL
D3S1358
D1S1656
D6S1043
D13S317
Penta E
D16S539
D18S51
D2S1338
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D5S818
TPOX
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X
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11
11
14
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疑父
X
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Y
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1
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2.6997
2.1815
79.3650
4.6641
4.0617
4.5324
······下转第15页表2 12个位点X-STR基因座分型结果STR
DXS10103
DXS8378
DXS7132
DXS10134
DXS10074
DXS10101
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DXS7423
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孕妇
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10
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36
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19
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39
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19
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39
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27
21
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疑父
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作者简介:杨璐瑜(1987—),女,汉族,山西太原人,法医学硕士,助理法医师,研究方向:从事法医物证学鉴定、科研。通讯作者:胡利平(1979—),汉族,重庆江津人,实验师,法医学硕士,研究方向:从事法医物证学教学、科研以及社会服务。BIOTECHWORLD 生物技术世界9
生物技术 世界生命科学与实验研究methods for polymerase chain reaction amplification from for-malin-fixed and paraffin-embedded tissues.[J].Diagn Mol Paehol,2001,10(4):265.[2]BielawskiK,Zaczed,LisowskaU,tability of DNA ex-tracted from formalin-fixed,Paraffin-embdded tissues for doubledifferential polymerase chain reaction analysis.[J].Int JMolMed,2001,8(5):573.[3]Mies C,Houldsworth ti tion of DNA fromparaffin blocks for Southern bolt analysis.[J].Am J Surg Pathol,1991,15(2):169-174.[4]石蜡包埋组织基因组DNA提取的条件优化,临床与试验病理学杂志,J Clin Exp Pathol,2011,Sep;27(9):1021-1023.[5]Warford A,Pringle JH,Hay J,et rn blot analysis ofDNA extracted from formal-saline fixed and paraffin wax em-bedded tissue[J].J Pathol,1988,154(4):313-320.[6]Isola J,DeVries S,Chu L,et is of changes in DNAsequence copy number by comparative genomic hybridization inarchival paraffin-embedded tumor J Pathol;1994,145:1301-1308.[7]Lonn U,Lonn S,Nilsson B,et tration of gene-ampli-fication by PCR in archival paraffin-embedded breast Cancer Res Treat,1994;30:147-152.了90℃过夜,蛋白酶K消化时间的延长,减少了蛋白的污染,使DNA纯度提高。消化时间是一个在学术界尚无定论的问题,有人认为消化时间应适当延长,最长者有报道经7天消化,可产生高质量的DNA[5];Isola等认为增加蛋白酶 K消化,能明显增加大分子量的DNA产量,这可能与蛋白酶 K 消化能部分逆转由固定导致的交联现象有关[6],但也有研究表明: 长时间蛋白酶K 消化,使短片段增加[7]。从我们实验中,我们也发现玻片形式组织延长消化时间后,片段分布范围更宽广。3.3 Tiangen试剂盒对切片和刮片形式的石蜡包埋组织提取DNA效果从图一和图四中可以看出切片形式和刮片形式包埋组织提取的DNA纯度差异不大,但刮片形式浓度比切片形式低,这可能跟手动刮取的石蜡包埋得组织量少有关。4 结论根据各自实验室条件和样本来源,如果样本已经是烤过片的玻片形式的石蜡包埋组织,可以选择改良的Qiagen试剂盒提取DNA(提取前增加一步二甲苯浸泡玻片脱蜡,试验中90℃水浴1h改为90℃过夜); 而样本如果是石蜡块包埋的组织,有切片机的,可以将石蜡包埋组织切成5um厚切片,8张为一组,用Tiangen试剂盒提取DNA;而没有切片机的实验室可以选择用刀片刮取石蜡块组织,刮尽量薄的组织片,大约8张为一组,用Tiangen试剂盒提取DNA。得到的DNA都可以满足后续PCR扩增及测序要求。参考文献[1]Satoy,Sugier,TsuchiyaB,son of the DNA extraction······上接第11页[7]薛向阳,孔繁东,祖国仁 等.食品抗高血压肽的研究进展和前景分析[J].食品研究与开发,2004(6):28-33.[8]蒋菁莉,任发政,蔡华伟.牛乳酪蛋白降血压肽的超滤分离[J].食品科学,2006(7):124-128.[9]刘萍,红岩.血脂异常与冠心病[J].现代中西医结合杂志,2006(3):265.[10]宋晓燕,高严祥,袁芳．Progress of collagen hydrolysis． FoodNutr Chin(中国食物与营养),2008(2):32-34.[11]丁进锋,苏秀榕.海蜇胶原蛋白肽的免疫活性的研究[J].水产科学,2011(6).······上接第9页座90％的突变为一步突变即1个重复单位的加或减,大于10个重复单位的基因座突变相比重复单位小于10的较多;一般的规律是突变来自父方是来自母方的0.7-14倍,多数基因座为3-6倍。本案例中的突变是由11到13,发生了两步突变,并且是母系来源的,国内尚未见报道。因此,在今后的鉴定工作中,在出现可能是突变的情况时,要注意以下几点:①应该用不同批次相同的试剂盒以及不同厂家的试剂盒进行重复验证,保证分型的正确;②如果是二联体,在补充亲生母亲的样本的同时增加STR位点。③必要时可进行测序来验证是否为真的突变。参考文献[1]周娟娟,洪素云.中国汉族人群15个因座遗传多态性研究及法医学应用[J].中国免疫学杂志,2004,(12):841-842．[2]黄霞,王芳,王蓉感,等.重庆地区汉族人群15个STR基因座遗传多态性研究[J].重庆医学,2008,37(1):58-60．······上接第8页参考文献[1]Liang P, Pardee A B. Differential display of eukaryoticmessenger RNA by means of the polymerase chain e, 1992, 257(5072): 967-971.[2]Hubank M, Schatz D fying differences in mRNA ex-pression by representional difference analysis of cDNA. NucleicAcids Research,1994,22:5640-5648.[3]Velculescu V E,Zhang L,Vogelstein B,Kinzler K W. Serial analysisof gene expression. Science,1995,270:484-487.[4]张小芳,金梅.DDRT-PCR技术研究进展. 安徽农学通报, 2008,14(20):29-30.[5]高雪.差异表达基因分离技术的研究进展. 生物技术通报, 2009,6:71-74.······上接第7页(2):358-363.[5]Zhang J,Chen S,Liu H,et en sulfide prevents hy-drogen peroxide-induced activation of epithelial sodium channelthrough a PTEN/PI(3,4,5)P3 dependent pathway[J]．PLoS One,2013,8(5):e64304．.[6]谭志成,闫燕,李荣山.外源性硫化氢在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用.中华肾脏病杂志,2012,28(8) :639-642.[7]覃志成,石媛媛,闰燕.硫化氢通过抑制NOD样受体途径减轻肾缺血再灌注损伤.中华肾脏病杂志,2014,30(8):HWORLD 生物技术世界15