2024年4月2日发(作者：乔锦)
ScienceofSericulture
2015，41（1）：0010
－
0017
ISSN0257
－
4799；CN32
－
1115/S
DOI：10．13441/j．cnki．cykx．2015．01．004
蚕业科学
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的
表达分析
张大燕贾凌向仲怀何宁佳
（
家蚕基因组生物学国家重点实验室
，
西南大学蚕学与系统生物学研究所
，
重庆
400716）
摘要微小
ＲNA（miＲNA）
是一类内源性非编码的单链小
ＲNA，
对植物的生长发育起着重要调控作用
。
建立高效的桑树瞬
时表达体系是研究桑树
miＲNA
及其靶基因功能的有效手段
。
将川桑
（Morusnotabilis）
基因组中克隆的
miＲn51
前体序列连接
35S-miＲn51
重组质粒
，
构建了
PLGNL-
通过农杆菌介导其在桑树叶片中瞬时表达
。
采用
GUS
组织化学染到
PLGNL
载体上
，
色
、
多酚氧化酶活性检测以及荧光定量
PCＲ
等方法
，
分析不同缓冲液
、
重组农杆菌注射菌液浓度
、
转化时间
、
桑树品种等试验
miＲn51
及靶基因表达水平的影响
，
条件对农杆菌介导的桑树叶片瞬时表达体系转化效率
、
当采用
1
号缓冲液和菌
液
D（600nm）
=
0.6
的重组农杆菌进行瞬时转化时
，
转化桑树叶片
3d
后
miＲn51
的表达量最高
，
其靶基因
MnPPO2
的表达水
平受到明显抑制
，
不同桑树品种对瞬时表达体系的瞬时表达效率有一定影响
。
以上结果表明
，
建立的农杆菌介导的桑树瞬时
有效
、
快捷地验证桑树
miＲNA
对其靶基因的调控作用
。
表达体系能简便
、
关键词桑树
；
根瘤农杆菌
；
瞬时表达
；
微小
ＲNA；
靶基因
Q943.2；S888.2
文献标识码
A
文章编号
0257
－
4799（2015）01
－
0010
－
08
中图分类号
ConstructionofMulberryTransientExpression
byAgrobacteriumandExpressionAnalysesof
TargetGene
ZhangDayanJiaLingXiangZhonghuaiHeNingjia
*
SystemMediated
miＲn51andIts
（StateKeyLaboratoryofSilkwormGenomeBiology，InstituteofSericultureandSystemsBiology，SouthwestUniversity，
Chongqing400716，China）
AbstractMicroＲNAs（miＲNA）areaclassofnon-codingendogenoussingle-strandsmallＲNAs．Theyplayimportant
rolesinregulationofplantgrowthanddevelopment．Establishinganefficienttransientexpressionsystemisaneffective
methodtostudythefunctionsofmiＲNAanditstargetgenesinmulberry．Inpresentstudy，miＲn51precursorsequence
35S-wasclonedfromMorusnotabilisgenomeandligatedwithvectorPLGNLtoconstructrecombinantplasmidPLGNL-
miＲn51，andthenPLGNL-35S-miＲn51wastransformedintomulberryleavesviaagrobacterium．Byusingthemethodsof
GUShistochemicalstaining，polyphenoloxidaseactivityassayandfluorescencequantitativePCＲ，theeffectofexperi-
mentalconditions，suchasdifferentinjectionbuffer，
收稿日期
：2014
－
09
－
26
接受日期
：2014
－
12
－
10
“863”
资助项目
：
国家高科技研究发展计划项目
（No．2013AA10060-
5），
商务部市场运行司茧丝绸产业公共服务体系建设项
目
（No．3）。
第一作者信息
：
张大燕
（1987
－
），
女
，
硕士研究生
。
E-mail：zhanglucyyan@163．com
通信作者信息
：
何宁佳
，
教授
，
博士生导师
。
E-mail：hejia@swu．edu．cn
*
recombinantagrobacteriumconcentration，transformation
timeandmulberryvariety，ontransformationefficiencyof
mulberryleaftransientexpressionsystemmediatedby
agrobacteriumandontheexpressionlevelofmiＲn51and
itstargetgenewereanalyzed．Theresultsindicatedthat
afterinjectionwithrecombinantagrobacteriumatconcen-
trationsofD（600nm）
=
0.6mixedwithNo．1injection
bufferforthreedays，theexpressionlevelofmiＲn51in
Correspondingauthor．E-mail：hejia@swu．edu．cn
第
1
期张大燕等
：
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的表达分析
11
mulberryleafwasthehighestanditstargetgeneMnPPO2wassignificantlyinhibited．Differentmulberryvarietieshasa
certainimpactontransformationefficiency．Thisestablishedmulberrytransientexpressionsystemmediatedbyagrobac-
teriumprovidesasimple，effective，andinstantapproachtostudytheregulatoryfunctionofmulberrymiＲNAonitstarget
gene．
KeywordsMorusL．；Agrobacteriumtumefaciens；Transientexpression；MicroＲNA；Targetgene
M
icroＲNA（miＲNA）
是一类内源性非编码的单链
［1］
小
ＲNA，
长度为
20～25
个核苷酸
。miＲNA
广
［2］
瞬时表达技术可以实现目的基因短暂的高水平
表达
，
与稳定遗传表达相比
，
具有操作简便
、
所需时间
短
、
耗资少等优点
。
由农杆菌介导的瞬时表达技术已
经成功应用于烟草
［9］［10］［11］［12］
、
拟南芥
、
玉米
和柚子
泛存在于动物
、
植物和微生物的基因组中
，
对生物体
的生长发育起着十分重要的调控作用
。
植物
miＲNA
基因首先经
ＲNA
聚合酶Ⅱ
（ＲNApol
Ⅱ
）
转录
形成具有
polyA
和帽子结构的初级转录物
（pri-miＲNA），
接着被剪切成含茎环结构的
pre-
miＲNA，
随后在
DCL1（ＲNA
聚合酶Ⅲ家族的特异性
核酸内切酶
dicer
同源物
）
和相关酶的作用下加工形
经加工修饰后在输出蛋成
miＲNA/miＲNA*
复合物
，
［3
－
4］
。
成
白的作用下进入细胞核形成成熟的
miＲNA
等植物的基因功能研究
，
该技术也被用来分析
miＲNA
与调控靶基因的关系
［13］
、ＲNA
干扰
［14］
、
蛋白
质的互作
［15］
及亚细胞定位
［16］
等
。
然而
，
在桑树中利
用瞬时表达技术研究基因功能还未见报道
。
本研究
从川桑基因组中克隆
miＲn51
前体序列
，
将其与
PLGNL
载体连接
，
并将构建的重组质粒转入农杆菌
感受态细胞中
。
利用农杆菌介导的外源基因瞬时表
达技术
，
将含有
miＲn51
的表达载体导入桑树叶片
，
通
过
GUS
组织化学染色
、
多酚氧化酶活性检测和荧光
定量
PCＲ
等方法探讨不同注射缓冲液
、
重组农杆菌
菌液浓度
、
转化时间
、
桑品种等条件对转化效率的影
并利用该技术分析
miＲn51
与其靶基因的瞬时表响
，
达水平
，
以期构建能用于桑树
miＲNA
及其靶基因功
能研究的高效植物瞬时表达体系
。
1
1.1
材料与方法
材料
供试桑树材料为白桑
（MorusalbaL．）
品种策沙
2
号和广东桑
（MorusatropurpureaＲoxb．）
品种伦教
109
的幼苗
。
将
2
个品种的桑种子
（
由本实验室保存
）
在
4℃
无菌水中浸泡
3～4d
后
，
播种在高温灭菌的营养
蛭石
、
珍珠岩的质量比为
3∶1∶1）
中
，
置于土
（
营养土
、
POX
型人工智能植物培养箱
（
宁波东南仪器公司
）
中
培养
。
培养条件
：
黑夜和白天的温度分别设置
26℃，
为
22℃、
每天黑暗与白天的光照时间分别为
8
h
和
16h。
培养
2
个月后选择生长状况相同的桑树
幼苗用于瞬时转化试验
。
表达载体
PLGNL（
由本实验室保存
）
含有
CaMV35S
启动子和β
-
葡聚糖苷酶
（GUS）
报告基因
。
用于瞬时转化的根瘤农杆菌
（Agrobacteriumtumefa-
ciens）
菌株为
LBA4404，
自带
PAL4404
质粒
，
为本实
验室保存菌种
。
熟
miＲNA
作为负调控因子调控靶基因的方式主要
降低靶基有
：（1）
与靶基因结合引起
mＲNA
的断裂
，
因的
mＲNA
水平
［5］
；（2）
转录后抑制靶基因
mＲNA
的
［6］
翻译
，
降低靶基因的蛋白质表达水平
。miＲNA
通
过以上
2
种作用方式调控靶基因的表达
，
从而调节生
物体的生长发育
。
自
2002
年植物
miＲNA
被发现以
miＲNA
数据库
（http：
∥
www．mirbase．org/index．
来
，
shtml）
中已登录的植物成熟
miＲNA
超过
8295
条
。
桑树
（MorusL．）
作为一种多年生木本植物
，
除
了栽桑养蚕的传统用途外
，
还具有重要的生态价值
，
是保护和改善生态环境的优良树种之一
。
研究逆境
胁迫下桑树
miＲNA
及其靶基因的表达变化将为桑
［7］
树抗逆性调控机制的研究提供重要参考
。Jia
等
利用
Solexa
测序方法在川桑
（Morusnotabilis）
基因
组中鉴定了
85
个保守
miＲNA
和
262
个新
miＲNA，
并利用生物信息学软件预测得到
332
个潜在的
miＲNA
靶基因
，PCＲ
分析了
9
个保守通过
qＲT-
miＲNA
和
miＲn51
等
5
个新
miＲNA
在川桑的叶
、
枝
［8］
皮
、
雄花中的表达模式
。2014
年
Gai
等采
用
Illumina
高通量测序技术
，
分别在被植原体侵染
及正常的湖桑
32
号植株叶片中鉴定到了
62
个保守
的
miＲNA
和
13
个新的植原体响应
miＲNA。
虽然已
有关于桑树
miＲNA
的研究报道
，
但由于未能建立稳
目前还未见有桑树定的桑树遗传转化和再生技术
，
miＲNA
及其靶基因的功能研究的详细报道
。
12
蚕业科学
2015；41（1）
1.2
重组表达载体的构建及转化农杆菌
从川桑基因组中扩增
miＲn51
的前体序列
pre-
95%
乙醇脱色
12h
左右
，
显微镜下拍照色
4～8h，
观察
。
1.4.2
多酚氧化酶
（MnPPO）
活性检测分别取转
化后的
2
个桑品种植株的新鲜叶片
0.2g，
经液氮迅
速研磨后
，
加入
3mLpH6.0
的
0.2mol/L
磷酸氢二
0.1mol/L
柠檬酸缓冲液
，
钠
-
研磨匀浆
。
用
2.5mL
缓冲液冲洗研钵
，
收集研磨液
。4℃
下
4000r/min
离心
15min，
上清即为粗酶提取液
。
另取一支干净
的离心管
，
加入
2mL
缓冲液和
0.05mol/L
邻二苯
30℃
恒温水浴箱中预热
30min，
酚
333
μ
L，
加入
333
μ
L
酶提取液和
666
μ
L
蒸馏水
，
反应
2min，
检
测
5min
内
D（410nm）
值的变化
，
以加热灭活的酶
液作为空白对照
。
以
1min
内
D（410nm）
值变化
0.01
所需酶量
（mg）
为一个多酚氧化酶活性单位
（U），
计算多酚氧化酶的活性
（U/mg）。
1.4.3
荧光定量
PCＲ
取瞬时转化的桑叶
，
用液
氮研磨成粉末状
，
参照
ＲNAisoPlus（TaKaＲa
公司
）
使用说明书提取总
ＲNA，
用
1%
琼脂糖凝胶电泳检
NanoDrop2000
分光光度计测定
ＲNA
测
ＲNA
质量
，
浓度
。
取
1
μ
g
桑叶总
ＲNA
作为模板
，
参照
Primer
ScriptＲT
反转录试剂盒
（PerfectＲealTime）（TaKaＲa
公司
）
说明合成
cDNA
第
1
链
。
根据川桑基因组数
CGAGAGA-
据设计
MnPPO2
基因扩增上游引物
（5'-
ACTCCTCACACTGCT-3'）
和下游引物
（5'-GGCTCT-
TCCATAGACTCCACATC-3'）；
内参基因为桑树核糖
GGCTA-
体蛋白基因
MnＲPL15，
上游引物序列为
5'-
TGTGATTTACCGTGTT-3'，TT-
下游引物序列为
5'-
GGTCCAGTATGAGTTGAGAA-3'。
根据
PLGNL
载
体上
GUS
序列设计其荧光定量
PCＲ
引物
，
检测瞬
时表达后
GUS
基因表达水平
，
其上游引物序列为
5'-AATGTTCTGCGACGCTCAC-3'，
下游引物序列为
5'-CTTTTTCCAGTACCTTCTCTGC-3'。
取
1
μ
g
桑
MLVreversetranscriptase
反转录叶总
ＲNA，
参照
M-
试剂盒
（
美国
Promega
公司
）
说明合成
cDNA
第
1
条
链
，
稀释
2
倍用于
miＲn51
荧光定量
PCＲ
检测
。
依
据茎环
PCＲ
原理设计
miＲn51
和内参基因的反
GTCGTA-
转录引物
。miＲn51
反转录引物序列为
5'-
TCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA-
CGACTACTTC-3'，GCAAGA-
其上游引物序列为
5'-
TCGACCAGCCGAGTA-3'，CA-
下游引物序列为
5'-
GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；
用桑树核糖体
5.8S
ＲNA
基因作为内参基因
，C-
其反转录引物序列为
5'-
［20］
CGCGGATCCATATTGG-miＲn51（
上游引物序列为
5'-
ATCTCGACCA-3'，CCCCCGGGT-
下游引物序列为
5'-
TGAATCTCTACCAGCCGAGT-3'），PCＲ
产物纯化回
T
载体上
，
收后连接到
pMD19-
转化后挑取阳性克隆
测序验证
。
将测序验证正确的质粒与
PLGNL
载体
分别用
BamH
Ⅰ和
Sma
Ⅰ双酶切
，
回收产物
，
用
T4
DNA
连接酶连接
，
构建重组质粒并通过双酶切和
Sanger
测序验证
。
将该重组质粒转化农杆菌感受态
挑取单菌落培养后进行菌液
PCＲ
检测
，
获得细胞
，
35S-miＲn51
的含有植物超量表达重组载体
PLGNL-
农杆菌
。
1.3
不同条件下的瞬时转化试验
将含目的载体的农杆菌按照体积比
1∶50
加入
到含
50
μ
g/mL
卡那霉素的
YEB
培养基中扩大培
养
，
在
28℃
下
220r/min
培养
16～20h
后
，
于
4℃
下
6000r/min
离心
10min，
回收菌体
。
配制
2
种注射缓冲液体系
。1
号缓冲液
：
含
0.5
N
吗啉代乙磺酸
、2.17
μ
g/mL
的
1/2
μ
g/mL2-
MS
［17］
和
5g/L
蔗糖
，
调节
pH
至
5.7
后
，
再加入
1
mg/mL
苄氨基腺嘌呤
（6-BA）、200
μ
L/mLSilwet
L-77
和
100mg/mL
乙酰丁香酮
。2
号缓冲液
（pH
10mmol/L2-N
吗啉代乙磺
5.6）：10mmol/LMgCl
2
、
［18］
酸和
150
μ
mol/L
乙酰丁香酮
。
分别使用
2
种缓
冲液重悬菌体
，
将菌液的
D（600nm）
值分别调整至
0.4、0.6、0.8
和
1.0，
将
4
种浓度的菌液放置在黑
21～23℃
条件下培养
2～3h
后备用
。
暗
、
用刀片轻轻划伤用于接种的
2
个供试品种的桑
树植株叶片远轴端的下表面
，
用
1mL
注射器吸取适
量菌液
，
将注射器针头顶住叶片刺破处
，
轻轻推动
，
将菌液注射入叶片
，
菌液注射剂量
100
μ
L/
片
。
注
射完毕后将桑树植株套上保鲜袋
，
黑暗条件下培养
2d
后取下保鲜袋
，3、4
和
5d
后取转化继续培养
2、
处理的桑叶
，
以接种注射缓冲液的叶片作为对照
。
1.4
检测方法
1.4.119］
参照文献
［
的方法
。
配制
1mLGUS
染液
：100mmol/LGUS
缓冲液
800
250mmol/LEDTA20
μ
L、2%Triton-X-10050
μ
L、
25mmol/LK
4
［Fe（CN）
6
］20
μ
L、25mmol/L
μ
L、
K
3
［Fe（CN）
6
］20
μ
L
和
10mmol/LX-Gluc50
μ
L。
37℃
染将转化后的桑树叶片置于
GUS
染液中
，
GUS
组织化学染色
第
1
期张大燕等
：
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的表达分析
13
AAAGAAAACAAACAAGTTCCTC-3'，
上游引物序列
CACCTCAAACCTCCAGTGAA-3'、
为
5'-
下游引物序
CAAAGAAAACAAACAAGTTCCTC-3'。
引列为
5'-
物均由生工生物工程
（
上海
）
股份有限公司合成
。
用
StepOnePlus
荧光定量
PCＲ
仪
（
美国
AppliedBio-
systems
公司
）
进行
qＲT-PCＲ。
反应体系
（20
μ
L）
包
TM
括
2
×
SYBＲPremixExTaq
Ⅱ
（TaKaＲa
公司
）10
200nmol/L
上
、50
×
Ｒox
μ
L，
下游引物各
0.4
μ
L，
ＲeferenceDye
TM
0.4
μ
L，10ng/
μ
LcDNA
模板
2
μ
L，
ddH
2
O6.8
μ
L。
反应条件为
：95℃
预变性
30s；95
℃5s，60℃30s，
共
40
个循环
。
1.4.4
数据统计分析每组试验均重复
3
次
，
数据
采用
SPSS
统计分析软件进行相关性分析
。
2
2.1
结果与分析
重组载体及转化农杆菌的鉴定
miＲn51
序列设计特异引物
，
根据川桑
pre-
以川
PCＲ
扩增
，B）。
测获得大小为
87bp
的产物
（
图
1-
序鉴定正确的阳性克隆经
BamH
Ⅰ和
Sma
Ⅰ双酶切
miＲn51
基因片段与后
，
用
T4DNA
连接酶将
pre-
PLGNL
载体进行连接
，
由
CaMV35S
启动
pre-
miＲn51
基因表达
（
图
1-A）。
图
1-B
为
PLGNL-35S-
miＲn51
质粒双酶切验证电泳检测结果
。
将获得的
重组质粒转化农杆菌
LBA4404
菌株
，
菌液
PCＲ
扩
miＲn51
基因增得到
87bp
的片段
，
测序验证为
pre-
35S-miＲn51
成功转入到农杆菌片段
，
说明
PLGNL-
LBA4404
菌株中
（
图
1-C）。
为了验证川桑中是否存在成熟
miＲn51，
以川桑
cDNA
为模板
，
茎环
PCＲ
扩增得到
miＲn51
片段
，
大
小为
71bp，
将该片段序列进行克隆测序验证
，
与川
表明川桑桑
miＲNA
数据库比对显示序列完全正确
，
pre-miＲn51
能够被加工成成熟
miＲNA。
在供试桑
品种策沙
2
号和伦教
109
中也克隆得到成熟
miＲn51（
图
1-D）。
miＲn51
基因进行对
pre-
桑基因组
DNA
为模板
，
A．
载体结构示意
B．PLGNL-35S-miＲn51
载体双酶切鉴定
，1—pre-miＲn51PCＲ
扩增
，2—PLGNL-35S-miＲn51
双酶切
，3—PLGNL
空载体
C．
农杆菌菌液
PCＲ
扩增
D．miＲn51
成熟体茎环
PCＲ
扩增
，1—
川桑成熟
miＲn51
茎环
，
2—
策沙
2
号成熟
miＲn51
茎环
，3—
伦教
109
成熟
miＲn51
茎环
A．StructurediagramofvectorB．VerificationofvectorPLGNL-35S-miＲn51bydualenzymedigestion，1—PCＲamplificationofpre-miＲn51，
C．PCＲamplificationofagrobacteriumsolution2—PLGNL-35S-miＲn51digestedwithdoubleenzyme，3—PLGNLemptyvector
D．PCＲamplificationofmaturemiＲn51stem-loop，1—MaturemiＲn51stem-loopinMorusnotabilis，
2—MaturemiＲn51stem-loopinCesha2，3—MaturemiＲn51stem-loopinLunjiao109
图
1
Fig.1
PLGNL-35S-miＲn51
表达载体的构建策略与鉴定
ConstructionandverificationofexpressionvectorPLGNL-35S-miＲn51
14
蚕业科学
2015；41（1）
2.2
不同条件下重组农杆菌菌液对桑树叶片的转
化效率
2.2.1
不同缓冲液对转化效率的影响分别采用
1
号和
2
号缓冲液重悬菌体
，
注射到策沙
2
号叶片的次
4d
后取一小片桑叶
（
避开伤口处
）
进行级叶脉中
，
GUS
组织化学染色
：
用
1
号缓冲液配制注射菌液
0.8
和
1.0
时
，
的
D（600nm）
值分别为
0.6、
注射桑树
叶片检测到的
GUS
基因表达量比用
2
号缓冲液配制
相同浓度注射菌液处理桑树叶片中的表达量高
（
图
2）。
因此
，
选择
1
号注射缓冲液进行后续试验
。
杆菌菌液注射后
，
转化叶片中
GUS
基因的表达水平
有显著差异
，
其中
，
注射
D（600nm）
值分别为
0.6
和
0.8
的菌液的叶片中
，GUS
基因的表达水平相对较
高
；
而注射
D（600nm）
值为
0.4
和
1.0
的菌液的桑叶
中
GUS
基因的表达水平相对较低
。
因此
，
注射不同
浓度的菌液对桑树瞬时表达效率有重要影响
，
浓度过
高或过低均会影响瞬时表达效率
。
检测样品为桑品种策沙
2
号处理
3d
后的叶片
。
不同小写字母表示组间差异达显著水平
（P＜0.05），
图
4～6
同
。
Samplesfortestwereleavesfrommulberryvariety
Cesha2atday3aftertransfection．Differentlowercase
lettersindicatesignificantdifference（P＜0.05），
ThesameinFig．4to6．
图
3
Fig.3
荧光定量
PCＲ
检测不同浓度重组农杆菌菌液
转化桑树叶片中的
GUS
基因表达水平
GUSgeneexpressionlevelinmulberryleavesafterbeing
transfectedwithdifferentconcentrationsofagrobacterial
solutiondetectedbyfluorescentquantitativePCＲ
A．1
号缓冲液配制注射菌液
B．2
号缓冲液配制注射菌液
a、b
和
c
依次是以
D（600nm）
值分别为
0.6、0.8、
1.0
的注射菌液处理
4d
的策沙
2
号桑树叶片
。
A．Bacterialsolutionpreparedwithinjectionbuffer1
B．Bacterialsolutionpreparedwithinjectionbuffer2
a，bandcareleavesfrommulberryvarietyCesha2
atday4aftertreatmentwithbacterialinjection
0.8and1.0，respectively．solutionatD（600nm）of0.6，
2.3
注射菌液的浓度和瞬时转化时间对
miＲn51
取
1
号缓冲液
及靶基因表达水平的影响
2.3.1
对
miＲn51
表达水平的影响
0.6、0.8
和将菌液分别稀释至
D（600nm）
=
0.4、
1.0
作为试验组注射菌液
，
同时以不含菌体的
1
号
缓冲液作为对照组注射液
。
通过荧光定量
PCＲ
检
A）。
与对照相比
，
测
miＲn51
的表达量
（
图
4-
在转化
0.8
和
1.0
的菌后
3d，
分别以
D（600nm）
值为
0.6、
miＲn51
的表达量均显著上液注射处理的叶片中
，
升
；
转化后
4d，
用
D（600nm）
=
0.4
菌液注射处理
miＲn51
的表达水平比对照组叶片增加了的叶片中
，
约
1.7
倍
；
转化后
5d，
各试验组叶片中的
miＲn51
表
达水平没有继续上升
，
反而下降
，
推测可能是因为农
杆菌介导的瞬时转化有一定的时效性
，
植物体内的
图
2
Fig.2
GUS
组织化学染色法检测不同缓冲液配制重组
农杆菌菌液对桑树叶片的转化效果
Thetransfectionefficiencyofagrobacterialsolutions
preparedwithdifferentinjectionbufferstomulberry
leafdetectedbyGUShistochemicalstaining
2.2.2
不同浓度注射菌液对转化效率的影响选取
瞬时转化后
3d
的策沙
2
号桑叶
，
荧光定量
PCＲ
检测
GUS
基因的表达水平
（
图
3）。
用不同浓度的重组农
第
1
期张大燕等
：
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的表达分析
15
其他防御机制调控了
miＲNA
的表达
。
2.3.2
对
miＲn51
靶基因表达水平的影响为了
验证桑树
miＲn51
与靶基因
MnPPO2
的相互作用
，
通过荧光定量
PCＲ
检测
MnPPO2
的表达水平
，
结果
B：
在瞬时转化
3d
后
，
见图
4-
分别以
D（600nm）
值
为
0.6、0.8
和
1.0
的菌液注射处理的叶片
MnPPO2
的表达水平显著下调
；
而瞬时转化后
4
中
，
d，
经
D（600nm）
=
0.4
的菌液处理的叶片中
，
MnPPO2
的表达水平降低
5
倍以上
，
与
miＲn51
的表
达呈负相关
，
同预期结果一致
。
供试桑品种为策沙
2
号
，
图
5
同
。
ThemulberryvarietyfortestwasCesha2．ThesameinFig．5．
图
4
荧光定量
PCＲ
检测不同浓度重组农杆菌菌液转化桑树叶片后
miＲn51（A）
及其靶基因
MnPPO2（B）
的表达水平
Fig.4ExpressionlevelofmiＲn51（A）anditstargetgeneMnPPO2（B）inmulberryleavesafterbeingtransfected
withdifferentconcentrationsofagrobacterialsolutiondetectedbyfluorescentquantitativePCＲ
2.3.3
取瞬时转化
4d
后不同浓度菌液处理的桑树叶片检测
MnPPO
酶的
对
MnPPO
酶活性的影响
MnPPO
酶活性均有不同程度的降低
，
说明
miＲn51
转
化入桑叶细胞中
，
能够有效抑制
MnPPO2
基因
mＲNA
的转录及蛋白质表达
。
其中
，
经
D（600nm）
值为
0.6
MnPPO
酶活性降低最为显著
。
的菌液处理的叶片中
，
B），
结合
MnPPO2
转录的荧光定量
PCＲ
结果
（
图
4-
确定以桑品种策沙
2
号的桑树叶片为材料
，
进行瞬时
表达的最适菌液浓度的
D（600nm）
值为
0.4
或
0.6，
最佳表达时间在转化后的第
3
天或第
4
天
。
2.4
桑树品种对转化效率和
miＲn51
及靶基因表
达水平的影响
为了进一步分析建立的农杆菌介导的瞬时表达
体系表达效率是否在不同桑树品种材料之间存在差
异
，
用
1
号缓冲液将重组农杆菌配制成
4
个浓度梯度
活性
（
图
5），
与对照组相比
，
各试验组桑树叶片中的
图
5
Fig.5
桑树叶片注射不同浓度重组农杆菌菌液
4d
后多酚氧化酶的活性比较
的菌液
，
注射生长状况一致的桑品种伦教
109
的幼苗
2、3、4
和
5d
的叶片进行组叶片
。
分别取瞬时转化
1、
3
和
4d
织化学染色检测
GUS
表达量
，
瞬时转化后
2、
3
时
，
桑叶
GUS
的表达量较高
。
因此
，
选取转化后
2、
和
4d
的桑叶样品
，
通过荧光定量
PCＲ
检测
miＲn51
和
MnPPO2
的表达水平
，
评价瞬时表达效果
。
结果显
AcomparisononMnPPOactivityinmulberryleaves
atday4afterbeingtransfectedwithdifferent
concentrationsofagrobacterialsolution
16
蚕业科学
2015；41（1）
D（600nm）
=
0.4
的菌液处理桑叶
2d
后
，miＲn51
示
，
A），
在叶中的表达水平比对照组上升约
4
倍
（
图
6-
而
对应的靶基因的表达水平不但未受到抑制反而上调
（
图
6-B），
可能是叶片细胞受到刺激后基因迅速表达
D（600nm）
值为
0.4
和以响应外界刺激
；
转化
3d
后
，
0.6
的菌液处理桑树叶片中的
miＲn51
表达水平显著
升高
，
而靶基因
MnPPO2
的表达水平受到抑制
，
这种
表明现象与
miＲNA
调控靶基因的作用方式一致
，
miＲNA
抑制了靶基因的表达
，
且在转化后第
3
天
，
瞬
时表达效率最高
。
以上结果与用桑品种策沙
2
号的
桑树叶片为材料进行转化结果相比
，
基因表达持续时
间短
，
仅持续
4d，
且在第
3
天时瞬时表达效率最高
，
说明用不同桑品种的桑树叶片构建的瞬时表达体系
，
其瞬时表达效率存在一定差异
。
图
6
荧光定量检测伦教
109
桑树叶片注射不同浓度重组农杆菌菌液后
miＲn51（A）
及其靶基因
MnPPO2（B）
的表达水平
ExpressionlevelofmiＲn51（A）anditstargetgeneMnPPO2（B）inmulberryleavesofagroLunjiao109afterbeing
transfectedwithdifferentconcentrationsofagrobacterialsolutiondetectedbyfluorescentquantitativePCＲ
Fig.6
3
讨论
时间却不一致
，
可能是由于不同桑品种对农杆菌的
敏感程度不同
。
瞬时转化后
，
通过
GUS
组织化学染
色和荧光定量
PCＲ
检测到
miＲn51
在桑叶细胞中的
表达时间较长
，
说明采用农杆菌介导的瞬时表达技
miＲn51
可以顺利进入桑叶细胞中
，
而且靶基因术
，
MnPPO2
的
mＲNA
水平及酶活性与对照相比均呈降
低趋势
，
暗示
miＲn51
能够有效沉默靶基因的表达
。
多酚氧化酶是一类含铜的氧化还原酶
，
参与植
物色素的生成
，
且与植物抗逆
、
生长发育有关
，
该酶
在正常生理状态下没有被激活
，
但在植物受机械损
伤后可以诱导防御系统激活多酚氧化酶蛋白的表
［25］
达
。
以策沙
2
号的桑树叶片为材料进行瞬时转
荧光定量
PCＲ
检测
miＲn51
的表达水化处理后
5d，
平较稳定
，
靶基因
MnPPO2
的表达水平却升高
。
出
现此现象可能是因为在桑树瞬时转化后期
，
MnPPO2
可能响应进入细胞的微生物诱导
，
使得表
达水平上调
，
暗示桑树
miＲn51
可能与外界诱导相
关
。
此外
，
试验中还发现以高浓度
［D（600nm）
=
1.0］
的菌液转化后
，
桑树叶片中的
miＲn51
表达水
平并不是最高
，
同时注射处叶片出现萎蔫变黄
，
说明
虽然农杆菌介导的植物瞬时表达技术已经广泛
应用于多个物种的基因功能验证
、
遗传改良和蛋白
，
但是影响瞬时表达效率的因素质互作等研究
很多
，
不同物种建立的瞬时表达体系存在差异
。
本
研究分别探讨了桑树瞬时表达体系中注射缓冲液成
分
、
重组农杆菌菌液浓度和转化时间及不同桑树品
种材料等因素对瞬时转化效率的影响
，
结果显示上
述各因素对瞬时转化效率均有一定程度的影响
，
优
化桑树瞬时表达体系的最佳条件为采用
1
号注射缓
冲液
，
注射重组菌液浓度的
D（600nm）
值为
0.4
或
0.6，
转化
3d
后目的基因的表达效率最高
。1
号缓
BA，
冲液中含有
5g/L
蔗糖和
1mg/mL6-
有利于重
［23］
组菌通过伤口渗入植物细胞
；
含有的表面活性剂
SilwetL-77
通过降低植物细胞的表面张力
，
同样能
［21
－
22］
够刺激重组质粒进入叶片细胞
，
从而提高了瞬时转
［24］
化效率
。
在桑品种策沙
2
号和伦教
109
的桑树
叶片进行瞬时转化的试验中
，
菌液对
2
个桑品种叶
片的最适转化浓度相同
，
然而目的基因表达变化的
第
1
期张大燕等
：
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的表达分析
17
桑树瞬时表达技术体系中的菌液浓度不宜过高
。
虽然瞬时转化后目的基因表达持续时间较短
，
不能在细胞中持续稳定表达
，
存在一定的局限性
；
但
农杆菌介导的瞬时表达可作用于完整植株
，
能够快
速
、
准确地反映外源基因和植物体内相关基因的表
达模式
。
随着桑树基因组测序和桑树
miＲNA
高通
量测序的相继完成
，
需要采用更有效的方法研究
miＲNA
与靶基因的功能
，
因此本试验初步建立的桑
树瞬时表达体系
，
为桑树
miＲNA
和靶基因功能在桑
树植株的验证与研究提供了简便
、
有效
、
快捷的
方法
。
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0017
ISSN0257
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4799；CN32
－
1115/S
DOI：10．13441/j．cnki．cykx．2015．01．004
蚕业科学
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的
表达分析
张大燕贾凌向仲怀何宁佳
（
家蚕基因组生物学国家重点实验室
，
西南大学蚕学与系统生物学研究所
，
重庆
400716）
摘要微小
ＲNA（miＲNA）
是一类内源性非编码的单链小
ＲNA，
对植物的生长发育起着重要调控作用
。
建立高效的桑树瞬
时表达体系是研究桑树
miＲNA
及其靶基因功能的有效手段
。
将川桑
（Morusnotabilis）
基因组中克隆的
miＲn51
前体序列连接
35S-miＲn51
重组质粒
，
构建了
PLGNL-
通过农杆菌介导其在桑树叶片中瞬时表达
。
采用
GUS
组织化学染到
PLGNL
载体上
，
色
、
多酚氧化酶活性检测以及荧光定量
PCＲ
等方法
，
分析不同缓冲液
、
重组农杆菌注射菌液浓度
、
转化时间
、
桑树品种等试验
miＲn51
及靶基因表达水平的影响
，
条件对农杆菌介导的桑树叶片瞬时表达体系转化效率
、
当采用
1
号缓冲液和菌
液
D（600nm）
=
0.6
的重组农杆菌进行瞬时转化时
，
转化桑树叶片
3d
后
miＲn51
的表达量最高
，
其靶基因
MnPPO2
的表达水
平受到明显抑制
，
不同桑树品种对瞬时表达体系的瞬时表达效率有一定影响
。
以上结果表明
，
建立的农杆菌介导的桑树瞬时
有效
、
快捷地验证桑树
miＲNA
对其靶基因的调控作用
。
表达体系能简便
、
关键词桑树
；
根瘤农杆菌
；
瞬时表达
；
微小
ＲNA；
靶基因
Q943.2；S888.2
文献标识码
A
文章编号
0257
－
4799（2015）01
－
0010
－
08
中图分类号
ConstructionofMulberryTransientExpression
byAgrobacteriumandExpressionAnalysesof
TargetGene
ZhangDayanJiaLingXiangZhonghuaiHeNingjia
*
SystemMediated
miＲn51andIts
（StateKeyLaboratoryofSilkwormGenomeBiology，InstituteofSericultureandSystemsBiology，SouthwestUniversity，
Chongqing400716，China）
AbstractMicroＲNAs（miＲNA）areaclassofnon-codingendogenoussingle-strandsmallＲNAs．Theyplayimportant
rolesinregulationofplantgrowthanddevelopment．Establishinganefficienttransientexpressionsystemisaneffective
methodtostudythefunctionsofmiＲNAanditstargetgenesinmulberry．Inpresentstudy，miＲn51precursorsequence
35S-wasclonedfromMorusnotabilisgenomeandligatedwithvectorPLGNLtoconstructrecombinantplasmidPLGNL-
miＲn51，andthenPLGNL-35S-miＲn51wastransformedintomulberryleavesviaagrobacterium．Byusingthemethodsof
GUShistochemicalstaining，polyphenoloxidaseactivityassayandfluorescencequantitativePCＲ，theeffectofexperi-
mentalconditions，suchasdifferentinjectionbuffer，
收稿日期
：2014
－
09
－
26
接受日期
：2014
－
12
－
10
“863”
资助项目
：
国家高科技研究发展计划项目
（No．2013AA10060-
5），
商务部市场运行司茧丝绸产业公共服务体系建设项
目
（No．3）。
第一作者信息
：
张大燕
（1987
－
），
女
，
硕士研究生
。
E-mail：zhanglucyyan@163．com
通信作者信息
：
何宁佳
，
教授
，
博士生导师
。
E-mail：hejia@swu．edu．cn
*
recombinantagrobacteriumconcentration，transformation
timeandmulberryvariety，ontransformationefficiencyof
mulberryleaftransientexpressionsystemmediatedby
agrobacteriumandontheexpressionlevelofmiＲn51and
itstargetgenewereanalyzed．Theresultsindicatedthat
afterinjectionwithrecombinantagrobacteriumatconcen-
trationsofD（600nm）
=
0.6mixedwithNo．1injection
bufferforthreedays，theexpressionlevelofmiＲn51in
Correspondingauthor．E-mail：hejia@swu．edu．cn
第
1
期张大燕等
：
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的表达分析
11
mulberryleafwasthehighestanditstargetgeneMnPPO2wassignificantlyinhibited．Differentmulberryvarietieshasa
certainimpactontransformationefficiency．Thisestablishedmulberrytransientexpressionsystemmediatedbyagrobac-
teriumprovidesasimple，effective，andinstantapproachtostudytheregulatoryfunctionofmulberrymiＲNAonitstarget
gene．
KeywordsMorusL．；Agrobacteriumtumefaciens；Transientexpression；MicroＲNA；Targetgene
M
icroＲNA（miＲNA）
是一类内源性非编码的单链
［1］
小
ＲNA，
长度为
20～25
个核苷酸
。miＲNA
广
［2］
瞬时表达技术可以实现目的基因短暂的高水平
表达
，
与稳定遗传表达相比
，
具有操作简便
、
所需时间
短
、
耗资少等优点
。
由农杆菌介导的瞬时表达技术已
经成功应用于烟草
［9］［10］［11］［12］
、
拟南芥
、
玉米
和柚子
泛存在于动物
、
植物和微生物的基因组中
，
对生物体
的生长发育起着十分重要的调控作用
。
植物
miＲNA
基因首先经
ＲNA
聚合酶Ⅱ
（ＲNApol
Ⅱ
）
转录
形成具有
polyA
和帽子结构的初级转录物
（pri-miＲNA），
接着被剪切成含茎环结构的
pre-
miＲNA，
随后在
DCL1（ＲNA
聚合酶Ⅲ家族的特异性
核酸内切酶
dicer
同源物
）
和相关酶的作用下加工形
经加工修饰后在输出蛋成
miＲNA/miＲNA*
复合物
，
［3
－
4］
。
成
白的作用下进入细胞核形成成熟的
miＲNA
等植物的基因功能研究
，
该技术也被用来分析
miＲNA
与调控靶基因的关系
［13］
、ＲNA
干扰
［14］
、
蛋白
质的互作
［15］
及亚细胞定位
［16］
等
。
然而
，
在桑树中利
用瞬时表达技术研究基因功能还未见报道
。
本研究
从川桑基因组中克隆
miＲn51
前体序列
，
将其与
PLGNL
载体连接
，
并将构建的重组质粒转入农杆菌
感受态细胞中
。
利用农杆菌介导的外源基因瞬时表
达技术
，
将含有
miＲn51
的表达载体导入桑树叶片
，
通
过
GUS
组织化学染色
、
多酚氧化酶活性检测和荧光
定量
PCＲ
等方法探讨不同注射缓冲液
、
重组农杆菌
菌液浓度
、
转化时间
、
桑品种等条件对转化效率的影
并利用该技术分析
miＲn51
与其靶基因的瞬时表响
，
达水平
，
以期构建能用于桑树
miＲNA
及其靶基因功
能研究的高效植物瞬时表达体系
。
1
1.1
材料与方法
材料
供试桑树材料为白桑
（MorusalbaL．）
品种策沙
2
号和广东桑
（MorusatropurpureaＲoxb．）
品种伦教
109
的幼苗
。
将
2
个品种的桑种子
（
由本实验室保存
）
在
4℃
无菌水中浸泡
3～4d
后
，
播种在高温灭菌的营养
蛭石
、
珍珠岩的质量比为
3∶1∶1）
中
，
置于土
（
营养土
、
POX
型人工智能植物培养箱
（
宁波东南仪器公司
）
中
培养
。
培养条件
：
黑夜和白天的温度分别设置
26℃，
为
22℃、
每天黑暗与白天的光照时间分别为
8
h
和
16h。
培养
2
个月后选择生长状况相同的桑树
幼苗用于瞬时转化试验
。
表达载体
PLGNL（
由本实验室保存
）
含有
CaMV35S
启动子和β
-
葡聚糖苷酶
（GUS）
报告基因
。
用于瞬时转化的根瘤农杆菌
（Agrobacteriumtumefa-
ciens）
菌株为
LBA4404，
自带
PAL4404
质粒
，
为本实
验室保存菌种
。
熟
miＲNA
作为负调控因子调控靶基因的方式主要
降低靶基有
：（1）
与靶基因结合引起
mＲNA
的断裂
，
因的
mＲNA
水平
［5］
；（2）
转录后抑制靶基因
mＲNA
的
［6］
翻译
，
降低靶基因的蛋白质表达水平
。miＲNA
通
过以上
2
种作用方式调控靶基因的表达
，
从而调节生
物体的生长发育
。
自
2002
年植物
miＲNA
被发现以
miＲNA
数据库
（http：
∥
www．mirbase．org/index．
来
，
shtml）
中已登录的植物成熟
miＲNA
超过
8295
条
。
桑树
（MorusL．）
作为一种多年生木本植物
，
除
了栽桑养蚕的传统用途外
，
还具有重要的生态价值
，
是保护和改善生态环境的优良树种之一
。
研究逆境
胁迫下桑树
miＲNA
及其靶基因的表达变化将为桑
［7］
树抗逆性调控机制的研究提供重要参考
。Jia
等
利用
Solexa
测序方法在川桑
（Morusnotabilis）
基因
组中鉴定了
85
个保守
miＲNA
和
262
个新
miＲNA，
并利用生物信息学软件预测得到
332
个潜在的
miＲNA
靶基因
，PCＲ
分析了
9
个保守通过
qＲT-
miＲNA
和
miＲn51
等
5
个新
miＲNA
在川桑的叶
、
枝
［8］
皮
、
雄花中的表达模式
。2014
年
Gai
等采
用
Illumina
高通量测序技术
，
分别在被植原体侵染
及正常的湖桑
32
号植株叶片中鉴定到了
62
个保守
的
miＲNA
和
13
个新的植原体响应
miＲNA。
虽然已
有关于桑树
miＲNA
的研究报道
，
但由于未能建立稳
目前还未见有桑树定的桑树遗传转化和再生技术
，
miＲNA
及其靶基因的功能研究的详细报道
。
12
蚕业科学
2015；41（1）
1.2
重组表达载体的构建及转化农杆菌
从川桑基因组中扩增
miＲn51
的前体序列
pre-
95%
乙醇脱色
12h
左右
，
显微镜下拍照色
4～8h，
观察
。
1.4.2
多酚氧化酶
（MnPPO）
活性检测分别取转
化后的
2
个桑品种植株的新鲜叶片
0.2g，
经液氮迅
速研磨后
，
加入
3mLpH6.0
的
0.2mol/L
磷酸氢二
0.1mol/L
柠檬酸缓冲液
，
钠
-
研磨匀浆
。
用
2.5mL
缓冲液冲洗研钵
，
收集研磨液
。4℃
下
4000r/min
离心
15min，
上清即为粗酶提取液
。
另取一支干净
的离心管
，
加入
2mL
缓冲液和
0.05mol/L
邻二苯
30℃
恒温水浴箱中预热
30min，
酚
333
μ
L，
加入
333
μ
L
酶提取液和
666
μ
L
蒸馏水
，
反应
2min，
检
测
5min
内
D（410nm）
值的变化
，
以加热灭活的酶
液作为空白对照
。
以
1min
内
D（410nm）
值变化
0.01
所需酶量
（mg）
为一个多酚氧化酶活性单位
（U），
计算多酚氧化酶的活性
（U/mg）。
1.4.3
荧光定量
PCＲ
取瞬时转化的桑叶
，
用液
氮研磨成粉末状
，
参照
ＲNAisoPlus（TaKaＲa
公司
）
使用说明书提取总
ＲNA，
用
1%
琼脂糖凝胶电泳检
NanoDrop2000
分光光度计测定
ＲNA
测
ＲNA
质量
，
浓度
。
取
1
μ
g
桑叶总
ＲNA
作为模板
，
参照
Primer
ScriptＲT
反转录试剂盒
（PerfectＲealTime）（TaKaＲa
公司
）
说明合成
cDNA
第
1
链
。
根据川桑基因组数
CGAGAGA-
据设计
MnPPO2
基因扩增上游引物
（5'-
ACTCCTCACACTGCT-3'）
和下游引物
（5'-GGCTCT-
TCCATAGACTCCACATC-3'）；
内参基因为桑树核糖
GGCTA-
体蛋白基因
MnＲPL15，
上游引物序列为
5'-
TGTGATTTACCGTGTT-3'，TT-
下游引物序列为
5'-
GGTCCAGTATGAGTTGAGAA-3'。
根据
PLGNL
载
体上
GUS
序列设计其荧光定量
PCＲ
引物
，
检测瞬
时表达后
GUS
基因表达水平
，
其上游引物序列为
5'-AATGTTCTGCGACGCTCAC-3'，
下游引物序列为
5'-CTTTTTCCAGTACCTTCTCTGC-3'。
取
1
μ
g
桑
MLVreversetranscriptase
反转录叶总
ＲNA，
参照
M-
试剂盒
（
美国
Promega
公司
）
说明合成
cDNA
第
1
条
链
，
稀释
2
倍用于
miＲn51
荧光定量
PCＲ
检测
。
依
据茎环
PCＲ
原理设计
miＲn51
和内参基因的反
GTCGTA-
转录引物
。miＲn51
反转录引物序列为
5'-
TCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA-
CGACTACTTC-3'，GCAAGA-
其上游引物序列为
5'-
TCGACCAGCCGAGTA-3'，CA-
下游引物序列为
5'-
GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；
用桑树核糖体
5.8S
ＲNA
基因作为内参基因
，C-
其反转录引物序列为
5'-
［20］
CGCGGATCCATATTGG-miＲn51（
上游引物序列为
5'-
ATCTCGACCA-3'，CCCCCGGGT-
下游引物序列为
5'-
TGAATCTCTACCAGCCGAGT-3'），PCＲ
产物纯化回
T
载体上
，
收后连接到
pMD19-
转化后挑取阳性克隆
测序验证
。
将测序验证正确的质粒与
PLGNL
载体
分别用
BamH
Ⅰ和
Sma
Ⅰ双酶切
，
回收产物
，
用
T4
DNA
连接酶连接
，
构建重组质粒并通过双酶切和
Sanger
测序验证
。
将该重组质粒转化农杆菌感受态
挑取单菌落培养后进行菌液
PCＲ
检测
，
获得细胞
，
35S-miＲn51
的含有植物超量表达重组载体
PLGNL-
农杆菌
。
1.3
不同条件下的瞬时转化试验
将含目的载体的农杆菌按照体积比
1∶50
加入
到含
50
μ
g/mL
卡那霉素的
YEB
培养基中扩大培
养
，
在
28℃
下
220r/min
培养
16～20h
后
，
于
4℃
下
6000r/min
离心
10min，
回收菌体
。
配制
2
种注射缓冲液体系
。1
号缓冲液
：
含
0.5
N
吗啉代乙磺酸
、2.17
μ
g/mL
的
1/2
μ
g/mL2-
MS
［17］
和
5g/L
蔗糖
，
调节
pH
至
5.7
后
，
再加入
1
mg/mL
苄氨基腺嘌呤
（6-BA）、200
μ
L/mLSilwet
L-77
和
100mg/mL
乙酰丁香酮
。2
号缓冲液
（pH
10mmol/L2-N
吗啉代乙磺
5.6）：10mmol/LMgCl
2
、
［18］
酸和
150
μ
mol/L
乙酰丁香酮
。
分别使用
2
种缓
冲液重悬菌体
，
将菌液的
D（600nm）
值分别调整至
0.4、0.6、0.8
和
1.0，
将
4
种浓度的菌液放置在黑
21～23℃
条件下培养
2～3h
后备用
。
暗
、
用刀片轻轻划伤用于接种的
2
个供试品种的桑
树植株叶片远轴端的下表面
，
用
1mL
注射器吸取适
量菌液
，
将注射器针头顶住叶片刺破处
，
轻轻推动
，
将菌液注射入叶片
，
菌液注射剂量
100
μ
L/
片
。
注
射完毕后将桑树植株套上保鲜袋
，
黑暗条件下培养
2d
后取下保鲜袋
，3、4
和
5d
后取转化继续培养
2、
处理的桑叶
，
以接种注射缓冲液的叶片作为对照
。
1.4
检测方法
1.4.119］
参照文献
［
的方法
。
配制
1mLGUS
染液
：100mmol/LGUS
缓冲液
800
250mmol/LEDTA20
μ
L、2%Triton-X-10050
μ
L、
25mmol/LK
4
［Fe（CN）
6
］20
μ
L、25mmol/L
μ
L、
K
3
［Fe（CN）
6
］20
μ
L
和
10mmol/LX-Gluc50
μ
L。
37℃
染将转化后的桑树叶片置于
GUS
染液中
，
GUS
组织化学染色
第
1
期张大燕等
：
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的表达分析
13
AAAGAAAACAAACAAGTTCCTC-3'，
上游引物序列
CACCTCAAACCTCCAGTGAA-3'、
为
5'-
下游引物序
CAAAGAAAACAAACAAGTTCCTC-3'。
引列为
5'-
物均由生工生物工程
（
上海
）
股份有限公司合成
。
用
StepOnePlus
荧光定量
PCＲ
仪
（
美国
AppliedBio-
systems
公司
）
进行
qＲT-PCＲ。
反应体系
（20
μ
L）
包
TM
括
2
×
SYBＲPremixExTaq
Ⅱ
（TaKaＲa
公司
）10
200nmol/L
上
、50
×
Ｒox
μ
L，
下游引物各
0.4
μ
L，
ＲeferenceDye
TM
0.4
μ
L，10ng/
μ
LcDNA
模板
2
μ
L，
ddH
2
O6.8
μ
L。
反应条件为
：95℃
预变性
30s；95
℃5s，60℃30s，
共
40
个循环
。
1.4.4
数据统计分析每组试验均重复
3
次
，
数据
采用
SPSS
统计分析软件进行相关性分析
。
2
2.1
结果与分析
重组载体及转化农杆菌的鉴定
miＲn51
序列设计特异引物
，
根据川桑
pre-
以川
PCＲ
扩增
，B）。
测获得大小为
87bp
的产物
（
图
1-
序鉴定正确的阳性克隆经
BamH
Ⅰ和
Sma
Ⅰ双酶切
miＲn51
基因片段与后
，
用
T4DNA
连接酶将
pre-
PLGNL
载体进行连接
，
由
CaMV35S
启动
pre-
miＲn51
基因表达
（
图
1-A）。
图
1-B
为
PLGNL-35S-
miＲn51
质粒双酶切验证电泳检测结果
。
将获得的
重组质粒转化农杆菌
LBA4404
菌株
，
菌液
PCＲ
扩
miＲn51
基因增得到
87bp
的片段
，
测序验证为
pre-
35S-miＲn51
成功转入到农杆菌片段
，
说明
PLGNL-
LBA4404
菌株中
（
图
1-C）。
为了验证川桑中是否存在成熟
miＲn51，
以川桑
cDNA
为模板
，
茎环
PCＲ
扩增得到
miＲn51
片段
，
大
小为
71bp，
将该片段序列进行克隆测序验证
，
与川
表明川桑桑
miＲNA
数据库比对显示序列完全正确
，
pre-miＲn51
能够被加工成成熟
miＲNA。
在供试桑
品种策沙
2
号和伦教
109
中也克隆得到成熟
miＲn51（
图
1-D）。
miＲn51
基因进行对
pre-
桑基因组
DNA
为模板
，
A．
载体结构示意
B．PLGNL-35S-miＲn51
载体双酶切鉴定
，1—pre-miＲn51PCＲ
扩增
，2—PLGNL-35S-miＲn51
双酶切
，3—PLGNL
空载体
C．
农杆菌菌液
PCＲ
扩增
D．miＲn51
成熟体茎环
PCＲ
扩增
，1—
川桑成熟
miＲn51
茎环
，
2—
策沙
2
号成熟
miＲn51
茎环
，3—
伦教
109
成熟
miＲn51
茎环
A．StructurediagramofvectorB．VerificationofvectorPLGNL-35S-miＲn51bydualenzymedigestion，1—PCＲamplificationofpre-miＲn51，
C．PCＲamplificationofagrobacteriumsolution2—PLGNL-35S-miＲn51digestedwithdoubleenzyme，3—PLGNLemptyvector
D．PCＲamplificationofmaturemiＲn51stem-loop，1—MaturemiＲn51stem-loopinMorusnotabilis，
2—MaturemiＲn51stem-loopinCesha2，3—MaturemiＲn51stem-loopinLunjiao109
图
1
Fig.1
PLGNL-35S-miＲn51
表达载体的构建策略与鉴定
ConstructionandverificationofexpressionvectorPLGNL-35S-miＲn51
14
蚕业科学
2015；41（1）
2.2
不同条件下重组农杆菌菌液对桑树叶片的转
化效率
2.2.1
不同缓冲液对转化效率的影响分别采用
1
号和
2
号缓冲液重悬菌体
，
注射到策沙
2
号叶片的次
4d
后取一小片桑叶
（
避开伤口处
）
进行级叶脉中
，
GUS
组织化学染色
：
用
1
号缓冲液配制注射菌液
0.8
和
1.0
时
，
的
D（600nm）
值分别为
0.6、
注射桑树
叶片检测到的
GUS
基因表达量比用
2
号缓冲液配制
相同浓度注射菌液处理桑树叶片中的表达量高
（
图
2）。
因此
，
选择
1
号注射缓冲液进行后续试验
。
杆菌菌液注射后
，
转化叶片中
GUS
基因的表达水平
有显著差异
，
其中
，
注射
D（600nm）
值分别为
0.6
和
0.8
的菌液的叶片中
，GUS
基因的表达水平相对较
高
；
而注射
D（600nm）
值为
0.4
和
1.0
的菌液的桑叶
中
GUS
基因的表达水平相对较低
。
因此
，
注射不同
浓度的菌液对桑树瞬时表达效率有重要影响
，
浓度过
高或过低均会影响瞬时表达效率
。
检测样品为桑品种策沙
2
号处理
3d
后的叶片
。
不同小写字母表示组间差异达显著水平
（P＜0.05），
图
4～6
同
。
Samplesfortestwereleavesfrommulberryvariety
Cesha2atday3aftertransfection．Differentlowercase
lettersindicatesignificantdifference（P＜0.05），
ThesameinFig．4to6．
图
3
Fig.3
荧光定量
PCＲ
检测不同浓度重组农杆菌菌液
转化桑树叶片中的
GUS
基因表达水平
GUSgeneexpressionlevelinmulberryleavesafterbeing
transfectedwithdifferentconcentrationsofagrobacterial
solutiondetectedbyfluorescentquantitativePCＲ
A．1
号缓冲液配制注射菌液
B．2
号缓冲液配制注射菌液
a、b
和
c
依次是以
D（600nm）
值分别为
0.6、0.8、
1.0
的注射菌液处理
4d
的策沙
2
号桑树叶片
。
A．Bacterialsolutionpreparedwithinjectionbuffer1
B．Bacterialsolutionpreparedwithinjectionbuffer2
a，bandcareleavesfrommulberryvarietyCesha2
atday4aftertreatmentwithbacterialinjection
0.8and1.0，respectively．solutionatD（600nm）of0.6，
2.3
注射菌液的浓度和瞬时转化时间对
miＲn51
取
1
号缓冲液
及靶基因表达水平的影响
2.3.1
对
miＲn51
表达水平的影响
0.6、0.8
和将菌液分别稀释至
D（600nm）
=
0.4、
1.0
作为试验组注射菌液
，
同时以不含菌体的
1
号
缓冲液作为对照组注射液
。
通过荧光定量
PCＲ
检
A）。
与对照相比
，
测
miＲn51
的表达量
（
图
4-
在转化
0.8
和
1.0
的菌后
3d，
分别以
D（600nm）
值为
0.6、
miＲn51
的表达量均显著上液注射处理的叶片中
，
升
；
转化后
4d，
用
D（600nm）
=
0.4
菌液注射处理
miＲn51
的表达水平比对照组叶片增加了的叶片中
，
约
1.7
倍
；
转化后
5d，
各试验组叶片中的
miＲn51
表
达水平没有继续上升
，
反而下降
，
推测可能是因为农
杆菌介导的瞬时转化有一定的时效性
，
植物体内的
图
2
Fig.2
GUS
组织化学染色法检测不同缓冲液配制重组
农杆菌菌液对桑树叶片的转化效果
Thetransfectionefficiencyofagrobacterialsolutions
preparedwithdifferentinjectionbufferstomulberry
leafdetectedbyGUShistochemicalstaining
2.2.2
不同浓度注射菌液对转化效率的影响选取
瞬时转化后
3d
的策沙
2
号桑叶
，
荧光定量
PCＲ
检测
GUS
基因的表达水平
（
图
3）。
用不同浓度的重组农
第
1
期张大燕等
：
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的表达分析
15
其他防御机制调控了
miＲNA
的表达
。
2.3.2
对
miＲn51
靶基因表达水平的影响为了
验证桑树
miＲn51
与靶基因
MnPPO2
的相互作用
，
通过荧光定量
PCＲ
检测
MnPPO2
的表达水平
，
结果
B：
在瞬时转化
3d
后
，
见图
4-
分别以
D（600nm）
值
为
0.6、0.8
和
1.0
的菌液注射处理的叶片
MnPPO2
的表达水平显著下调
；
而瞬时转化后
4
中
，
d，
经
D（600nm）
=
0.4
的菌液处理的叶片中
，
MnPPO2
的表达水平降低
5
倍以上
，
与
miＲn51
的表
达呈负相关
，
同预期结果一致
。
供试桑品种为策沙
2
号
，
图
5
同
。
ThemulberryvarietyfortestwasCesha2．ThesameinFig．5．
图
4
荧光定量
PCＲ
检测不同浓度重组农杆菌菌液转化桑树叶片后
miＲn51（A）
及其靶基因
MnPPO2（B）
的表达水平
Fig.4ExpressionlevelofmiＲn51（A）anditstargetgeneMnPPO2（B）inmulberryleavesafterbeingtransfected
withdifferentconcentrationsofagrobacterialsolutiondetectedbyfluorescentquantitativePCＲ
2.3.3
取瞬时转化
4d
后不同浓度菌液处理的桑树叶片检测
MnPPO
酶的
对
MnPPO
酶活性的影响
MnPPO
酶活性均有不同程度的降低
，
说明
miＲn51
转
化入桑叶细胞中
，
能够有效抑制
MnPPO2
基因
mＲNA
的转录及蛋白质表达
。
其中
，
经
D（600nm）
值为
0.6
MnPPO
酶活性降低最为显著
。
的菌液处理的叶片中
，
B），
结合
MnPPO2
转录的荧光定量
PCＲ
结果
（
图
4-
确定以桑品种策沙
2
号的桑树叶片为材料
，
进行瞬时
表达的最适菌液浓度的
D（600nm）
值为
0.4
或
0.6，
最佳表达时间在转化后的第
3
天或第
4
天
。
2.4
桑树品种对转化效率和
miＲn51
及靶基因表
达水平的影响
为了进一步分析建立的农杆菌介导的瞬时表达
体系表达效率是否在不同桑树品种材料之间存在差
异
，
用
1
号缓冲液将重组农杆菌配制成
4
个浓度梯度
活性
（
图
5），
与对照组相比
，
各试验组桑树叶片中的
图
5
Fig.5
桑树叶片注射不同浓度重组农杆菌菌液
4d
后多酚氧化酶的活性比较
的菌液
，
注射生长状况一致的桑品种伦教
109
的幼苗
2、3、4
和
5d
的叶片进行组叶片
。
分别取瞬时转化
1、
3
和
4d
织化学染色检测
GUS
表达量
，
瞬时转化后
2、
3
时
，
桑叶
GUS
的表达量较高
。
因此
，
选取转化后
2、
和
4d
的桑叶样品
，
通过荧光定量
PCＲ
检测
miＲn51
和
MnPPO2
的表达水平
，
评价瞬时表达效果
。
结果显
AcomparisononMnPPOactivityinmulberryleaves
atday4afterbeingtransfectedwithdifferent
concentrationsofagrobacterialsolution
16
蚕业科学
2015；41（1）
D（600nm）
=
0.4
的菌液处理桑叶
2d
后
，miＲn51
示
，
A），
在叶中的表达水平比对照组上升约
4
倍
（
图
6-
而
对应的靶基因的表达水平不但未受到抑制反而上调
（
图
6-B），
可能是叶片细胞受到刺激后基因迅速表达
D（600nm）
值为
0.4
和以响应外界刺激
；
转化
3d
后
，
0.6
的菌液处理桑树叶片中的
miＲn51
表达水平显著
升高
，
而靶基因
MnPPO2
的表达水平受到抑制
，
这种
表明现象与
miＲNA
调控靶基因的作用方式一致
，
miＲNA
抑制了靶基因的表达
，
且在转化后第
3
天
，
瞬
时表达效率最高
。
以上结果与用桑品种策沙
2
号的
桑树叶片为材料进行转化结果相比
，
基因表达持续时
间短
，
仅持续
4d，
且在第
3
天时瞬时表达效率最高
，
说明用不同桑品种的桑树叶片构建的瞬时表达体系
，
其瞬时表达效率存在一定差异
。
图
6
荧光定量检测伦教
109
桑树叶片注射不同浓度重组农杆菌菌液后
miＲn51（A）
及其靶基因
MnPPO2（B）
的表达水平
ExpressionlevelofmiＲn51（A）anditstargetgeneMnPPO2（B）inmulberryleavesofagroLunjiao109afterbeing
transfectedwithdifferentconcentrationsofagrobacterialsolutiondetectedbyfluorescentquantitativePCＲ
Fig.6
3
讨论
时间却不一致
，
可能是由于不同桑品种对农杆菌的
敏感程度不同
。
瞬时转化后
，
通过
GUS
组织化学染
色和荧光定量
PCＲ
检测到
miＲn51
在桑叶细胞中的
表达时间较长
，
说明采用农杆菌介导的瞬时表达技
miＲn51
可以顺利进入桑叶细胞中
，
而且靶基因术
，
MnPPO2
的
mＲNA
水平及酶活性与对照相比均呈降
低趋势
，
暗示
miＲn51
能够有效沉默靶基因的表达
。
多酚氧化酶是一类含铜的氧化还原酶
，
参与植
物色素的生成
，
且与植物抗逆
、
生长发育有关
，
该酶
在正常生理状态下没有被激活
，
但在植物受机械损
伤后可以诱导防御系统激活多酚氧化酶蛋白的表
［25］
达
。
以策沙
2
号的桑树叶片为材料进行瞬时转
荧光定量
PCＲ
检测
miＲn51
的表达水化处理后
5d，
平较稳定
，
靶基因
MnPPO2
的表达水平却升高
。
出
现此现象可能是因为在桑树瞬时转化后期
，
MnPPO2
可能响应进入细胞的微生物诱导
，
使得表
达水平上调
，
暗示桑树
miＲn51
可能与外界诱导相
关
。
此外
，
试验中还发现以高浓度
［D（600nm）
=
1.0］
的菌液转化后
，
桑树叶片中的
miＲn51
表达水
平并不是最高
，
同时注射处叶片出现萎蔫变黄
，
说明
虽然农杆菌介导的植物瞬时表达技术已经广泛
应用于多个物种的基因功能验证
、
遗传改良和蛋白
，
但是影响瞬时表达效率的因素质互作等研究
很多
，
不同物种建立的瞬时表达体系存在差异
。
本
研究分别探讨了桑树瞬时表达体系中注射缓冲液成
分
、
重组农杆菌菌液浓度和转化时间及不同桑树品
种材料等因素对瞬时转化效率的影响
，
结果显示上
述各因素对瞬时转化效率均有一定程度的影响
，
优
化桑树瞬时表达体系的最佳条件为采用
1
号注射缓
冲液
，
注射重组菌液浓度的
D（600nm）
值为
0.4
或
0.6，
转化
3d
后目的基因的表达效率最高
。1
号缓
BA，
冲液中含有
5g/L
蔗糖和
1mg/mL6-
有利于重
［23］
组菌通过伤口渗入植物细胞
；
含有的表面活性剂
SilwetL-77
通过降低植物细胞的表面张力
，
同样能
［21
－
22］
够刺激重组质粒进入叶片细胞
，
从而提高了瞬时转
［24］
化效率
。
在桑品种策沙
2
号和伦教
109
的桑树
叶片进行瞬时转化的试验中
，
菌液对
2
个桑品种叶
片的最适转化浓度相同
，
然而目的基因表达变化的
第
1
期张大燕等
：
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51
与其靶基因的表达分析
17
桑树瞬时表达技术体系中的菌液浓度不宜过高
。
虽然瞬时转化后目的基因表达持续时间较短
，
不能在细胞中持续稳定表达
，
存在一定的局限性
；
但
农杆菌介导的瞬时表达可作用于完整植株
，
能够快
速
、
准确地反映外源基因和植物体内相关基因的表
达模式
。
随着桑树基因组测序和桑树
miＲNA
高通
量测序的相继完成
，
需要采用更有效的方法研究
miＲNA
与靶基因的功能
，
因此本试验初步建立的桑
树瞬时表达体系
，
为桑树
miＲNA
和靶基因功能在桑
树植株的验证与研究提供了简便
、
有效
、
快捷的
方法
。
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