2024年4月2日发(作者：薛夏青)
WB的原理、操作及注意事项
原理：
通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，
对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定
的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备
A：样品的制备
1 组织：
组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，
180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，
溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：
细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，
180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，
溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：
直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因
1.双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，
常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是
Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最
大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有
肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三
氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量
测定。
法：
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性
溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深
蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干
扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重
偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上
述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液
中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络
合物所还原。
3.紫外吸收法：
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸
和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干
扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化
的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必
须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：
是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是
蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。
此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其
他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各
种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变化。
所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm
和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽
键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用
于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：
光密度之差求
得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较
大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改
变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。
4. Bradford比色法：
Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白
可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。
分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20µl），以
0.15mmol/l NaCl补足至100µl，同时以两管100µl的0.15mmol/l NaCl作空白对照。每管
各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测
A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA
标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100µg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体
积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100µg另作一标准曲线进行测定。
5．电泳估算法（我们选择此法）：
样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。
以提取癌组织总蛋白为例：
① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的
1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。
② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。
③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml
溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；
④ SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
A：实际操作
1. 做胶前的准备
1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2024年4月2日发(作者：薛夏青)
WB的原理、操作及注意事项
原理：
通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，
对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定
的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备
A：样品的制备
1 组织：
组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，
180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，
溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：
细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，
180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，
溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：
直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因
1.双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，
常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是
Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最
大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有
肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三
氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量
测定。
法：
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性
溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深
蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干
扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重
偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上
述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液
中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络
合物所还原。
3.紫外吸收法：
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸
和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干
扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化
的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必
须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：
是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是
蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。
此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其
他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各
种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变化。
所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm
和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽
键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用
于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：
光密度之差求
得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较
大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改
变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。
4. Bradford比色法：
Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白
可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。
分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20µl），以
0.15mmol/l NaCl补足至100µl，同时以两管100µl的0.15mmol/l NaCl作空白对照。每管
各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测
A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA
标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100µg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体
积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100µg另作一标准曲线进行测定。
5．电泳估算法（我们选择此法）：
样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。
以提取癌组织总蛋白为例：
① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的
1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。
② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。
③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml
溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；
④ SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
A：实际操作
1. 做胶前的准备
1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。