2024年4月8日发(作者：化半兰)
CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统
CHO细胞表达系统原理
分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究
的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表
达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就 CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
CHO细胞表达体系及其特点
诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人
瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％
以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③
目的产物的分离纯化等。
针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工
程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大
肠杆菌()是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用生产的
蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和
包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，
它具有许多优点：
①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于
天然蛋白分子；
②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；
③具有重组基因的高效扩增和表达能力；
④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；
⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。
但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。 目前已有越来越
多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。
CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO
和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的
潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌
外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝 试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞
获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：
(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白
分子；
(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
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(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生
产。
表1 用于生产基因工程药物的表达系统
表达系统
特点
具有原核细胞良好的可操作
大肠杆菌()
产量
原
核
生
性，成本低．产率高，但不
能进行糖基化修饰，胞内分
泌形成包涵体。
兼具原核细胞良好 的可操
外源蛋白占细菌总蛋白量：胞
内表达10%~70%，胞外表达
0.3~4％
物
酵母(yeasts)
作性和真核系统的后加工能
力，但 存在产量低及过度糖
基化等问题。
第二代酵母表达系统，部分
克服了利甩
外源蛋白占菌体总蛋白量：
~10%
甲醇营养型酵母
(Methylotroph yeasts)
真
生
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核
昆虫杆状病毒系统
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酵母表达的过度糖基化缺
点，有较好的分泌牲，产量
子仍有一些差异
较高，但 产品结构与天然分
外源蛋白占菌体总蛋白量：
10~30％
具有高等真核生物表达系统
的优点，产品的抗原性免疫
原性和功能与天然蛋白质相发酵液中目的产物含量：
似，表达水平较高，但其糖
1~500mg／L
基化程度较低，形式较为单
一
产品的抗原性、免疫原性和
哺乳动物细胞
功能与天然 蛋白质最接近，
糖基化等后加工最准确，表
达水平较低
发酵液中目的产物含量 ；0.2
~ 200mg／L
表2 某些利用CHO细胞表达的外源基因
药用蛋白
G-CSF
产量
90μg/1x106ce11／24h
5~5.6μg／ml／72h
2
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FSH
EP0
14mg／L／24h
10085U／m]
Pro -UK
500—1000IU／106ce11／24h
800—1500IU／106ce11／24h
IL -6
36.8μg／106ce11／24h
105U／ml
IL -12
IFN(7)
ATⅢ
C^MPATH-1H
GP1
TIMP
4 9μg／ml
67.9±80μg／106ce11／24h
131.1mg／L／122h
0.64mg／ml
CHO细胞无血清培养
细胞
CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是
目前生物工程上广泛使用的细胞。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三
十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的，
大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO却具有如上的
功能，因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，
该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋
白分离纯化工作十分有利。
细胞血清培养
传统上CHO细胞的培养都是在DMEM／F12基础培养基中添加5~10的小牛血清(用于重组蛋白)或
胎牛血清(用于杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成DNA，
对细胞的增殖有很大的作用。实验证明，血清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但
哺乳动物的血清价格昂贵，成本高不适于今天的大规模工业化生产。而且哺乳动物血清作为补加物，存在
许多问题，首先血清的来源存在问题，血清来源于特定的地区，因而如果该地区发生灾荒或牛群中流行疾
病，都可导致血清失去供应源。血清批量之间的差异大，重复性差，由于血清来源于动物，动物个体或群
体的差异及时间上的差异都能导致每个批号的血清不完全一样。
从重组蛋白生产的角度来看，出于Q和Qc的要求，每换一个批号的血清，都包含大量的验证工作，
这就给生产带来很大的麻烦。另外血清来源于动物因此经常被污染，污染的血清往往导致细胞生长缓慢，
蛋白产量下降，甚至导致细胞死亡。目前购自各大公司的血清虽能消灭细菌和所有支原体，但很难保证除
去所有的病毒污染。血清的成分十分复杂，经研究表明，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定
的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响细胞功能的表达 血清复杂的成分也给基因工程
表达产物的下游工作带来很大的困难，因此成分明确，价格经济的无血清培养基成为CHO细胞培养的一
种必然需求。
3. CHO细胞的无血清培养基
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180μg／ml
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从血清培养所面临的问题，我们不难看出：人们急切地需要找到能够替代血清的物质，从而解决血
清培养所面临的这一问题。五十年代起，科学家就开始研究无血清培养基。要发展无血清培养基，必须找
到适当的具有血清功能的因子，由于血清的成分不清而且十分复杂，具有多种促进细胞生长和增殖的因子，
因此要找到血清替代物是相当困难的。人们已经发现一些物质单独或一起使用可以替代血清。这些物质分
别是微量元素、生长因子、激素、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂。微量元素是细胞代谢所必需的，是无血清
培养基的主要添加物之一，铁、锌、硒等都是不可缺少的，有些资料证明还需要铜、锰、钼、钒等元素，
这些元素在血清培养中由血清提供，在无血清培养中需要补加。促生长因子是无血清培养基的主要补加物
之一。
现在研究者已经从血清、各种组织和生物成分中用生物工程的方法，制取了各种促细胞生长物，如
表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板生长因子(PDGF)、生长调节素(SM)等。现已证明
很多激素具有促进细胞生长的作用，胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，无血清培养基缺乏对细胞的
保护，血清培养残余的胰蛋白酶对血清的损伤十分严重，因而无血清培养基必须添加酶抑制剂。脂类是细
胞膜的主要成分，添加脂类可以促进细胞增殖，随着无血清培养基研究的进一步深入，无血清培养基将越
来越完善。
无血清培养试验步骤
1．实验材料
CHO细胞株购于俄罗斯Soym Agromed，无血清培养基(CHO-S-sFM1I)购于Gibeo公司。
2．实验方法
2.1 无血清培养基的配制
用90ml纯水溶解制备1升量的袋装Gibeo CHO-S-sFM1I，加人2.45g NaHC03，用 1N NaOH将pH
调为8.0，再用1N HC1调回至pH7.1，定容后用0.22μm滤器过滤除菌。
2.2 CHO细胞的适应
用含血清的常规培养基和无血清培养基1:1(v/v)悬浮细胞，接种量为3×105个/ml。在37℃，8％培养
箱中培养，使细胞密度达5×105个/m1。然后用等体积的CHO-S-sFM1I 将细胞稀释到3x 105个/ml，继续
培养，重复上述操作，直至血清浓度降为0.1％后，用完全无血清培养基培养到3×106个/ml。再以3×l05
个/ml接种，传50代，至此完成适应工作。
2 3 细胞计数参阅《组织培养技术4》的方法，用血球计数板计数。
2.4 CHO细胞表达EPO水平应用MIT比色法测定。
4.无血清培养基的发展
目前的无血清培养基已进入第三代，第一代无血清培养基虽然不含有血清，但含有大量的动物或植
物蛋白，如BSA或激素等，虽然它所含的总体蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高，八十年代末，
九十年代初，研究人员开发出了第二代无血清培养基，它完全不用动物来源的蛋白，如 LTI公司生产的
CH0～S—SFM I，它采用悬浮的CHO表达蛋白，培养基蛋白含量很低(少于100~g/m1)，使重组蛋白的纯
化简单，目前市售的无血清培养基主要是这一类。第三代无血清培养基现在已经出现，它完全不含有蛋白
或含量极低，如 LTI公司最近推出的CHO—I—PFM，培养基不含任何蛋白质，没有任何动物、人类蛋白
或多肽，为表达产品的下游处理工作提供极大方便。目前无血清培养基的价格还很高，不亚于大规模的工
业化生产，因此降低无血清培养基的成本，开发出无血清、无蛋白、低成本的无血清培 养基日益受到人
们的重视。随着生物工程产品的开发和推广，它的应用愈来愈广泛，相信在将来的生物制药行业它将具有
广阔的市场前景和应用空间。
CHO细胞表达系统常见问题及解析
1．问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低
糖？
参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比
较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在
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玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。
2．问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？
参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白
表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能
性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：
1.采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，
可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。
N-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。
3.构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有
可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。
当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA
测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！
3．问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长
参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以
在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。
我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。
无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培
养基（好像HyClone就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认
为无血清。在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。分步法是，CHO
细胞先在含10％血清的常规培养基里培养，再到含5％血清的培养基里培养，再到含2.5％血清的培养基
里培养，依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步
到位法就是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。
4．问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入pcDNA3.1，
没有插入其他的基因或者tag。现准备转染CHO细胞。就相关问题想问问：
1.有的文献上没有署名K1或是DHFR,普通所写的CHO细胞是指那种？野生型CHO细胞又是指的哪
种？
2. 这三种细胞是不是因为CHO-K1和CHO/DHFR-有扩增基因GS 和DHFR,可以更为有效的扩增进
而表达，比野生型CHO在转染中更起作用？
3.如果就我的实验要求，CHO-K1或者CHO/DHFR-更加适合，那么转染CHO-K1是不是可以直接转
染？而转染CHO-DHFR-需要和携带DHFR-的标记质粒共转染？
参考见解：做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的，这个载体同时可以过表达一个抗
性基因，如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目的蛋白也得到了
有效的表达。
1.野生型CHO就是ＣＨＯ－Ｋ１
2. CHO－DHFR-是指ＤＨＦＲ缺陷型细胞，ＤＨＦＲ作为筛选标记．
3.你用pcＤＮＡ3.1的话,可以直接转染CHO-K1,加G418筛选即可.
5．问：最近作试验需要用到CHO细胞，老师从广西带回两瓶，本来用的是DMEM培养液，由于我没有
接触过细胞这方面的知识，上网查了下培养液，说1640就可以，就仓促用了1640，两天过去了贴壁很不
好，估计是要完了，求救。
参考见解1：
1。带回来的细胞瓶汇合度大概多少？一般送人的细胞汇合度大概80－90％，且瓶里加满培养液，再
包装。细胞生长旺盛，便于处理。加满培养液的目的是防止运输过程中倒置，细胞接触不到培养液而死亡
或活力下降。培养时应该分瓶培养。我想你应该分瓶了吧，我们一般1:3分瓶。不分瓶培养可想而知了。
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2。如果上述没错的话，准备好正确的完全培养液，将生长不好的细胞瓶中的细胞消化收集，合并一
下，铺底大概30％。正常培养。
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3。关键掌握住起始细胞的密度和严格的操作。因为这细胞已很常见。方法正确不存在长不好的问题。
除非你的老师带回来的细胞存在问题。
参考见解2：
37度预热胰酶，吸除培养瓶中的培养液，PBS（无钙镁）洗涤细胞1次后，加入少量胰酶，覆盖细
胞即可。轻轻摇动（前后左右）。镜下观察细胞状态，一旦出现细胞回缩形态变圆即停止消化（防止过渡
消化）。加入完全培养液（必须含胎牛血清）终止消化反应。湾头吸管顺序吹打细胞，小心避免产生气泡
（对细胞有害）。镜下观察细胞，细胞分散即可后续操作。如果是新手，保留上清以防不测，别倒掉。
6．问：最近要养CHO细胞,要作些准备,但不知道其培养也是什么,谢谢
参考见解：这是一篇已发表的CHO细胞培养的方法.
CHO细胞培养：CHO细胞株置于RPMI 1640 培养基中，内含10%灭活小牛血清，青霉素100 IU/mL，
链霉素100 IU/mL，置于37℃，5%CO2的培养箱（德国Heraeus）中培养。每隔48 h换培液，当单层培养
细胞汇合以后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。 将培养瓶中的CHO细胞按1×105/mL传代移入培养
板中，待进入对数生长期后（约24 h）加药。
这是细胞的供给源:
CHO细胞由中科院上海生物化学和细胞生物学研究所提供。
7．问：这两个月，CHO细胞在反应器上总是在前两天很难密度长上去，同期转瓶生长正常，基本排除细
胞及培养基的问题，换罐做也出现同种现象，可排除反应器问题。与曾经在此罐上正常生长的一批相比，
只是接入培养液体积由1.5升该为0.8升，其他条件均相同，反应器控制系统无异常。不知问题到底出在
什么地方
参考见解：根据我自己的经验，如果你的种子细胞和培养基都确保没问题的话，试试一下几点：
1.接种时留一些细胞悬液，种回到方瓶或转瓶中，用与大罐相同的培养基同时培养，观察48小时内
的生长情况，如果方瓶长势良好而罐子有问题，那就是操作的问题了
2.不知道你的罐子800mL能否确保搅拌、通气等参数的控制效率，只看仪表显示是不够的，有时液
位太低可能探测到的不是真实值，你可以在接种前用水试试，把各种条件设的极端一些，容易发现问题
3.有可能的话再做一次1.5L培养，看能否重现6月的结果，因为你说所有条件都一样可能是不准确
的，有疏漏的地方
8．问：我培养的cho细胞,在塑料基质的方瓶中贴壁和生长情况很好,形态也很正常,但是接入转瓶后贴壁情
况很差,不伸展或伸展需要的时间很长.请问这主要是什么原因?
参考见解：我觉得可能的原因有如下几点：
1 细胞本身贴壁生长的能力较弱，一般细胞在塑料器皿上的贴附能力强于玻璃器皿，这样的话，就
选择塑料器皿好了。其实塑料培养瓶等也是可以重复使用的，清洗干净，泡酸，冲洗干净，凉干之后，射
线照射消毒或者就是紫外消毒也行，我们实验室就这样重复用培养板，没有什么问题。当然，太旧的还是
扔了好了。
2 培养液PH不好也会影响贴壁，配的时候加好缓冲试剂，不嫌麻烦的话调定PH在7.2左右。使用
时间较长的培养液由于在空气中暴露时间长，ph会有变化
3 消化时候处理不合适，比如胰酶消化过久，有EDTA的话，去除不干净也影响贴壁的。消化完了
之后要吸干净消化液，用培养液漂洗细胞，或者吹下来之后离心，换加新鲜培养液
4 血清也可能影响贴壁，我观察过，细胞在胎牛血清中贴壁明显快于新生牛血清，尤其是Hyclone
的血清，不过很贵
9．问：最近我养CHO细胞，是从别人那里得来得。给我得时候细胞有一半是圆形一半是梭行的。但是养
着养着就大部分成圆形，而且有的像荷包蛋一样，而那些还是梭形的细胞里面出现了空泡一样的东西，还
有渐渐像融化了一样。是什么原因，我一直很头疼，不知道该怎么办，下面的实验无法进行，苦恼啊！
参考见解：听您的描述估计很可能是支原体污染。
建议马上丢弃该细胞，因为支原体污染很难去除，为避免影响您实验室其他的细胞操作一定不要犹
豫。您可以重新索取或购买状态好的CHO细胞。
10．问：由于接种密度稍低一些，CHO细胞在2L转瓶中培养5天左右很难消化下来，即使消化下来也是
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成团的，请问为什么？加完血清的培养基又重新过滤了，会不会对细胞的生长速度有影响，一般培养三天
就能张满，谢谢
参考见解：1：首先考虑一下你的胰酶有没有问题，也有可能是胰酶的浓度不够？
2：成团也可能是细胞太多了，因此在消化时应该延长消化的时间，同时传代时尽量吹散成单细胞悬
液！
3：消化后传代时多弃去些细胞试试，也可以多传几瓶，三瓶，四瓶都是可以的！
CHO细胞表达系统在疫苗研制中应用
分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究
的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表
达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
1．CHO细胞表达体系及其特点
CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO
和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的
潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌
外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞
获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sFM 中生长良好。
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：
(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然
蛋白分子；
(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大
规模生产。
2．CHO细胞表达疫苗
2.1 乙肝疫苗
CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。目前只有 CHO表达乙肝疫苗 已投入生产，这
是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。使用酵母表达乙肝疫苗虽然获
得了很大成功，但是酵母系统还存在着许多缺陷，最重要的一点，酵母不能模拟蛋白在人体肝细胞中的翻
译后修饰、蛋白折叠、大分子组装以及糖基化。这些特点正是抗原在动物细胞中引起免疫反应所必须的。
而 CHO细胞表达的蛋白更接近人体来源的乙肝表面抗原。1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合
长春生物制品研究所等单位研制成功了由 CHO细胞表达的基因工程乙肝疫苗，并于1992年批量上市。该
疫苗是以S蛋白为靶抗原的乙肝疫苗，与酵母表达的乙肝表面抗原同属于第2代乙肝疫苗。
许多实验证明，乙肝病毒(rmv)衣膜蛋白的PreS部分在引发人体免疫反应中起着重要作用。因此由
CHO细胞中表达的含S和PreS2基因的乙肝表面抗原，被誉为第三代乙肝疫苗。以色列生产的新 型疫苗。
包含了S、PreS1、PreS2等3个基因，在CHO中表达的蛋白形成22 μm大小的颗粒，含有衣膜所有的抗
原表位。
目前已投入市场的CHO表达基因重组乙肝疫苗主要有：法国巴斯德研究所Gen Hevac B、以色列
Bio-Technology General公司的Bio-Hep-B、瑞士的Hepreeombe等。在美国以酵母表达的乙肝疫苗为主的
同时，CHO表达的乙肝疫苗占据了欧洲市场。中国长春生物制品所的乙肝疫苗 已正式生产。在现有的安
全性记载中，动物细胞表达的生物产品尤其CHO表达的产物的安全性很好。在已批准进入临床或生产的
动物细胞表达的乙肝疫苗的使用中，没有发现严重的副反应。
在免疫原性方面，我国 CHO生产的乙肝疫苗的免疫原性与血源疫苗没有差异，明显优于酵母重组疫
苗。还有调查显示，新生儿接种国产乙肝CHO疫苗第1年的抗HBs阳性率为98.25％，抗体GMT为77.64，
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而血源疫苗免疫后第1年抗HBs阳性率在73.3％～93.5％之间。与酵母重组疫苗比较，更低剂量的CHO
乙肝重组疫苗及鼠细胞表达的乙肝疫苗在T细胞水平产生更高的免疫原性，这些疫苗刺激T细胞产生帮助
引起更高的血清转化率和更高的抗HBs滴度。
2.2 Epstein-Ban-病毒(EBV)疫苗
象其他疱疹病毒一样，EBV外周包绕一层脂质包膜。主要由gp340(有报道为gp350)和gp220两种糖
蛋白组成，分子量分别为340kDa和220kDa。gp340/220具有广泛的糖基化位点，其多糖部分占整个分子
量的50％以上，因此，哺乳动物细胞是其最适宜的表达宿主。将含gp340/220基因的重组载体，转染CHO-A6
细胞系和CHO dhfr-细胞系，经筛选获得可表达gp340/220蛋白的细胞株，经纯化的gp340/220免疫小鼠。
2周后小鼠血清中检测到明显的gp340/220特异性抗体，表明CHO细胞表达的gp340/220具有同天然膜抗
原相似的分子量、糖基化程度、免疫特异性和免疫原性，可望成为EB病毒基因工程亚单位疫苗。
国外有研究也将gp340/220基因克隆构建重组载体，但经过定点突变使之只合成gp340蛋白。该种蛋
白同样能被抗gp340220的单克隆抗体所识别，并具有同EBV受体、CD21结合的能力，说明重组蛋白同
野生型EBVgp340/220结构相似。用重组蛋白免疫兔子，获得了高滴度的抗体，所产生的抗体可以中和野
生型EBV。
2.3 艾滋病病毒(HIv)疫苗
HIV基因组中的三大结构蛋白编码区分别编码核心蛋白Gag、聚合酶Pol和外膜蛋白Env。Env的前
体单位为糖蛋白gpl60，加工后形成膜外蛋白gp120和跨膜蛋白gp41。目前针对 HIV病毒研制的疫苗有多
种：减毒活疫苗、灭活疫苗、载体活疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗及重组亚单位疫苗。
其中不同宿主细胞表达的以Env、Gag、Pol等蛋白为靶抗原的多种亚单位疫苗在国外进入了临床实
验。其中CHO细胞表达的gpl20制成的疫苗为较早研制的一种。重组载体转入CHO-L761h细胞系，获得
可持续分泌gpl20蛋白的细胞株。
纯化后的蛋白同3种常用免疫佐剂免疫兔子，均诱导了高滴度的免疫反应；给猩猩接种也可以保护
机体免受由低剂量的同类 HIV毒株攻击而导致的感染。但是在泰国给数千人免疫接种后无明显的保护效
果。不过。在恒河猴接种gp120疫苗的同时注射CHO表达的重组白介素12(ILl2)。所诱导的抗体水平是单
一接种gp120疫苗的10倍；而新的I临床使用表明，受试者免疫重组痘病毒疫苗后。再使用gp120亚单位
疫苗加强，80%以上的人产生了特异的体液和细胞免疫反应。
3．小结
由于CHO表达系统具有完善的翻译后修饰功能。对于一些特定的蛋白。特别是糖基化程度高的蛋白
来说。是最为合适的表达体系。因此，除了以上介绍的3种病毒疫苗外。丙肝病毒、水痘一带状疱疹病毒
亚单位疫苗在 CHO细胞中的表达在国内外均有研究。但CHO表达亚单位疫苗还存在着一些问题：
(1)单一的亚单位疫苗往往具有免疫原性弱的缺点；
(2)CHO细胞培养成本高、条件难控制。在一定程度上限制了CHO细胞表达亚单位疫苗的发展。
因此。应进一步研究CHO表达系统，对表达载体进行改造使之能容载更大片断的蛋白基因并提高表
达量；改造CHO细胞使之更利于大规模生产；改进发酵工艺、纯化工艺。使CHO培养成本降低。
CHO细胞表达系统研究进展
影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻
译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达谓节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有
一定作用。研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染
方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构
来实现。
转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作
用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此，表达载体的元件组成及结构是ClIO细胞高效表达外源
基 因的关键因素之一。借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，
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使其方便而高效地用于外源基因的表达。 目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表
达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件 主要有启动子一增强子元件、转录
剪切和Poly A信号等。
1 启动子
启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作
用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报
告基因在细胞中测定。SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、
LTR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子
>LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。
来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，
依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有
多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启
动子等在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前导
序列，使CHO细胞表达EPO的水平增加了2l倍和l6倍。在实际应用中所有的生产细胞系都是用强的、
组成 型启动子。SR启动子(SV40早期启动子+HTLV)比SV40早期启动子表达水平提高约5倍。
与启动子相连的是增强子元件，也是一种调节基因转录的顺式作用元件，具有种和组织特异性。病
毒增强子的主要优点是病毒包装要求增强子位于mRNA帽子位点附近，从而形 成紧密型表达载体CHO
细胞中一般使用SV40和CMV增强子。增强子可位于载体中两个启动子之间，为两个启动子公用。
2 外源基因
位于启动子之后的是克隆的基因序列，或被表达的外源蛋白的cDNA。外源基因的结构 可在翻译水
平上调控它的表达效率，这种调控机理很复杂，目前尚不清楚。但是在启动子一定的情况下，可以通过下
列方法增加外源基因的表达量：
①在加工和剪接途径中引入一个指导前体mRNA合成的内含子序列；
②引入一个促进mRNA翻译的序列；
③拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌物和膜结合蛋白的输出等；
④在不改变基因产品氨基酸序列的前提下修饰个别基因的编码序列，解决密码子偏性问题；
⑤尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5
未翻译前导区和克隆中的GC尾部对表达水平的不良影响，以及减少3未译区(3-UTR)对mRNA稳定性的
不良影响。例如，人G-CSF基因的3-UTR中富含AT元素（ARE)，ARE与mRNA 的半衰期有关，切除
AR以增加mRNA的稳定性，提高蛋白质的合成；
⑥转染靶细胞中导人表达载体启动子相应的强反式激活因子是提高外源基因表达的新策略。
3 终止区域
为了使外源基因得到准确表达，其后是强的终止子区域。终止子一般从病毒基因组，如 SV40、T抗
原终止信号、肝炎表面抗原序列或β-珠蛋白等中获得。不同的3'-未编码区(UTR)序列能影响重组系统的表
达。Rotondaro等使用两个不同的3'-未翻译区表达人G-CSF，结果包含兔β1-珠蛋白基因第二内含子和聚
腺苷酸信号的3'-UTR的表达效率高于包含SV40小t内含子和早期区域腺苷酸化信号的3'-UTR的表达效
率。
4 选择标记
要从细胞中选择出获得了外源DNA并稳定转化的动物细胞是很困难的。为此，人们在表达质粒或另
一个质粒上，克隆或构建了许多选择性标记。目前有十余种选择性标记可供使用。最常使用的有DHFR、
Neo和GS等基因。为了便于过程分析，研究者们还在CHO细胞中构建了一些具有特殊物理性质的报告基
因。如Trudy H等人将 Lac z基因克隆到载体上，通过简单的比色实验便可快速测定出β-半乳糖苷酸
的活性，细胞在无菌条件下分析后还可继续培养。分泌碱性磷酸酶的基因也有类似的功效。其它类型的报
告基因在检测时不甚便利，因为它们或者要求放射性基质，或者要求特殊仪器以测定发光物质或荧光物质。
5 基因扩增
外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。一般来讲，表达系统
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中的整个载体是由两个独立且连在一起的表达单元组成：外源基因表达单元和 扩增基因表达单元。扩增
基因往往亦为选择标记。
迄今为止，世界上已经建立了十余种基因扩增选择系统，其中二氢叶酸还原酶(dhfr)基因扩增系统是
最常用的基因扩增选择系统。而谷氨酰胺台成酶(GS)扩增系统是新近发展的更有效的扩增表达系统。宿主
细胞为CHO-k1细胞。在这个系统中质粒pEEl4被整合人染色体，使外源基因在人巨细胞病毒(h-CMV5)
和 SV40 3'-端控制下进行表达。选择标记基因是从SV40晚期启动子转录而来，其中包括一个小基因，一
个内含子和3'-侧翼约lkb DNA。GS基因的选择压力是低水平的MSX，在这一选择压力下．细胞内的外源
基因拷贝数可达1000-2000拷贝/细胞。GS基因扩增前后，CAT基因的表达水平提高了19-20倍左右。与
dhfr基因扩增系统相比，GS系统具有更高的扩增效率。Bebbinglon等人利用GS系统生产嵌合抗体，表达
水平达200-500mg/106/48h。
CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望
存在的问题
在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利
用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存
在以下问题：
①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低；
②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；
③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而
对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少；
④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
前景展望
在今后的若干年内，随着以CHO细胞为主的动物细胞表达系统日趋完善，动物细胞将可能成为生产
基因工程药物的主要宿主细胞。围绕CHO细胞表达系统而进行的相关研究将成为生物工程领域一个活跃
的研究热点。科研人员将把以下问题作为今后的主攻方向：
①提高表达水平，如发展一些新的强启动子，寻找合适的增强子，装配适合于cDNA高效表达的必
要元件以及根据CHO细胞翻译特点调整外源基因密码子等；
②在进一步提高表达水平的同时．还将注重分离纯化的问题，如改变DNA中的个别序列，使表达产
物在不影响生物 活性的前提下，携带有利于分离纯化的基团；
③细胞培养的低成本、高密度、高产量和培养设备的大型化、自动化精巧化；
④分离纯化的低成本和高活性回收率。
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2024年4月8日发(作者：化半兰)
CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统
CHO细胞表达系统原理
分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究
的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表
达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就 CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
CHO细胞表达体系及其特点
诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人
瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％
以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③
目的产物的分离纯化等。
针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工
程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大
肠杆菌()是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用生产的
蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和
包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，
它具有许多优点：
①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于
天然蛋白分子；
②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；
③具有重组基因的高效扩增和表达能力；
④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；
⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。
但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。 目前已有越来越
多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。
CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO
和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的
潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌
外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝 试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞
获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：
(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白
分子；
(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
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(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生
产。
表1 用于生产基因工程药物的表达系统
表达系统
特点
具有原核细胞良好的可操作
大肠杆菌()
产量
原
核
生
性，成本低．产率高，但不
能进行糖基化修饰，胞内分
泌形成包涵体。
兼具原核细胞良好 的可操
外源蛋白占细菌总蛋白量：胞
内表达10%~70%，胞外表达
0.3~4％
物
酵母(yeasts)
作性和真核系统的后加工能
力，但 存在产量低及过度糖
基化等问题。
第二代酵母表达系统，部分
克服了利甩
外源蛋白占菌体总蛋白量：
~10%
甲醇营养型酵母
(Methylotroph yeasts)
真
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核
昆虫杆状病毒系统
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酵母表达的过度糖基化缺
点，有较好的分泌牲，产量
子仍有一些差异
较高，但 产品结构与天然分
外源蛋白占菌体总蛋白量：
10~30％
具有高等真核生物表达系统
的优点，产品的抗原性免疫
原性和功能与天然蛋白质相发酵液中目的产物含量：
似，表达水平较高，但其糖
1~500mg／L
基化程度较低，形式较为单
一
产品的抗原性、免疫原性和
哺乳动物细胞
功能与天然 蛋白质最接近，
糖基化等后加工最准确，表
达水平较低
发酵液中目的产物含量 ；0.2
~ 200mg／L
表2 某些利用CHO细胞表达的外源基因
药用蛋白
G-CSF
产量
90μg/1x106ce11／24h
5~5.6μg／ml／72h
2
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FSH
EP0
14mg／L／24h
10085U／m]
Pro -UK
500—1000IU／106ce11／24h
800—1500IU／106ce11／24h
IL -6
36.8μg／106ce11／24h
105U／ml
IL -12
IFN(7)
ATⅢ
C^MPATH-1H
GP1
TIMP
4 9μg／ml
67.9±80μg／106ce11／24h
131.1mg／L／122h
0.64mg／ml
CHO细胞无血清培养
细胞
CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是
目前生物工程上广泛使用的细胞。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三
十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的，
大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO却具有如上的
功能，因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，
该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋
白分离纯化工作十分有利。
细胞血清培养
传统上CHO细胞的培养都是在DMEM／F12基础培养基中添加5~10的小牛血清(用于重组蛋白)或
胎牛血清(用于杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成DNA，
对细胞的增殖有很大的作用。实验证明，血清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但
哺乳动物的血清价格昂贵，成本高不适于今天的大规模工业化生产。而且哺乳动物血清作为补加物，存在
许多问题，首先血清的来源存在问题，血清来源于特定的地区，因而如果该地区发生灾荒或牛群中流行疾
病，都可导致血清失去供应源。血清批量之间的差异大，重复性差，由于血清来源于动物，动物个体或群
体的差异及时间上的差异都能导致每个批号的血清不完全一样。
从重组蛋白生产的角度来看，出于Q和Qc的要求，每换一个批号的血清，都包含大量的验证工作，
这就给生产带来很大的麻烦。另外血清来源于动物因此经常被污染，污染的血清往往导致细胞生长缓慢，
蛋白产量下降，甚至导致细胞死亡。目前购自各大公司的血清虽能消灭细菌和所有支原体，但很难保证除
去所有的病毒污染。血清的成分十分复杂，经研究表明，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定
的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响细胞功能的表达 血清复杂的成分也给基因工程
表达产物的下游工作带来很大的困难，因此成分明确，价格经济的无血清培养基成为CHO细胞培养的一
种必然需求。
3. CHO细胞的无血清培养基
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180μg／ml
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从血清培养所面临的问题，我们不难看出：人们急切地需要找到能够替代血清的物质，从而解决血
清培养所面临的这一问题。五十年代起，科学家就开始研究无血清培养基。要发展无血清培养基，必须找
到适当的具有血清功能的因子，由于血清的成分不清而且十分复杂，具有多种促进细胞生长和增殖的因子，
因此要找到血清替代物是相当困难的。人们已经发现一些物质单独或一起使用可以替代血清。这些物质分
别是微量元素、生长因子、激素、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂。微量元素是细胞代谢所必需的，是无血清
培养基的主要添加物之一，铁、锌、硒等都是不可缺少的，有些资料证明还需要铜、锰、钼、钒等元素，
这些元素在血清培养中由血清提供，在无血清培养中需要补加。促生长因子是无血清培养基的主要补加物
之一。
现在研究者已经从血清、各种组织和生物成分中用生物工程的方法，制取了各种促细胞生长物，如
表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板生长因子(PDGF)、生长调节素(SM)等。现已证明
很多激素具有促进细胞生长的作用，胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，无血清培养基缺乏对细胞的
保护，血清培养残余的胰蛋白酶对血清的损伤十分严重，因而无血清培养基必须添加酶抑制剂。脂类是细
胞膜的主要成分，添加脂类可以促进细胞增殖，随着无血清培养基研究的进一步深入，无血清培养基将越
来越完善。
无血清培养试验步骤
1．实验材料
CHO细胞株购于俄罗斯Soym Agromed，无血清培养基(CHO-S-sFM1I)购于Gibeo公司。
2．实验方法
2.1 无血清培养基的配制
用90ml纯水溶解制备1升量的袋装Gibeo CHO-S-sFM1I，加人2.45g NaHC03，用 1N NaOH将pH
调为8.0，再用1N HC1调回至pH7.1，定容后用0.22μm滤器过滤除菌。
2.2 CHO细胞的适应
用含血清的常规培养基和无血清培养基1:1(v/v)悬浮细胞，接种量为3×105个/ml。在37℃，8％培养
箱中培养，使细胞密度达5×105个/m1。然后用等体积的CHO-S-sFM1I 将细胞稀释到3x 105个/ml，继续
培养，重复上述操作，直至血清浓度降为0.1％后，用完全无血清培养基培养到3×106个/ml。再以3×l05
个/ml接种，传50代，至此完成适应工作。
2 3 细胞计数参阅《组织培养技术4》的方法，用血球计数板计数。
2.4 CHO细胞表达EPO水平应用MIT比色法测定。
4.无血清培养基的发展
目前的无血清培养基已进入第三代，第一代无血清培养基虽然不含有血清，但含有大量的动物或植
物蛋白，如BSA或激素等，虽然它所含的总体蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高，八十年代末，
九十年代初，研究人员开发出了第二代无血清培养基，它完全不用动物来源的蛋白，如 LTI公司生产的
CH0～S—SFM I，它采用悬浮的CHO表达蛋白，培养基蛋白含量很低(少于100~g/m1)，使重组蛋白的纯
化简单，目前市售的无血清培养基主要是这一类。第三代无血清培养基现在已经出现，它完全不含有蛋白
或含量极低，如 LTI公司最近推出的CHO—I—PFM，培养基不含任何蛋白质，没有任何动物、人类蛋白
或多肽，为表达产品的下游处理工作提供极大方便。目前无血清培养基的价格还很高，不亚于大规模的工
业化生产，因此降低无血清培养基的成本，开发出无血清、无蛋白、低成本的无血清培 养基日益受到人
们的重视。随着生物工程产品的开发和推广，它的应用愈来愈广泛，相信在将来的生物制药行业它将具有
广阔的市场前景和应用空间。
CHO细胞表达系统常见问题及解析
1．问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低
糖？
参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比
较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在
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玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。
2．问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？
参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白
表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能
性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：
1.采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，
可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。
N-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。
3.构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有
可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。
当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA
测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！
3．问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长
参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以
在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。
我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。
无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培
养基（好像HyClone就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认
为无血清。在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。分步法是，CHO
细胞先在含10％血清的常规培养基里培养，再到含5％血清的培养基里培养，再到含2.5％血清的培养基
里培养，依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步
到位法就是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。
4．问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入pcDNA3.1，
没有插入其他的基因或者tag。现准备转染CHO细胞。就相关问题想问问：
1.有的文献上没有署名K1或是DHFR,普通所写的CHO细胞是指那种？野生型CHO细胞又是指的哪
种？
2. 这三种细胞是不是因为CHO-K1和CHO/DHFR-有扩增基因GS 和DHFR,可以更为有效的扩增进
而表达，比野生型CHO在转染中更起作用？
3.如果就我的实验要求，CHO-K1或者CHO/DHFR-更加适合，那么转染CHO-K1是不是可以直接转
染？而转染CHO-DHFR-需要和携带DHFR-的标记质粒共转染？
参考见解：做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的，这个载体同时可以过表达一个抗
性基因，如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目的蛋白也得到了
有效的表达。
1.野生型CHO就是ＣＨＯ－Ｋ１
2. CHO－DHFR-是指ＤＨＦＲ缺陷型细胞，ＤＨＦＲ作为筛选标记．
3.你用pcＤＮＡ3.1的话,可以直接转染CHO-K1,加G418筛选即可.
5．问：最近作试验需要用到CHO细胞，老师从广西带回两瓶，本来用的是DMEM培养液，由于我没有
接触过细胞这方面的知识，上网查了下培养液，说1640就可以，就仓促用了1640，两天过去了贴壁很不
好，估计是要完了，求救。
参考见解1：
1。带回来的细胞瓶汇合度大概多少？一般送人的细胞汇合度大概80－90％，且瓶里加满培养液，再
包装。细胞生长旺盛，便于处理。加满培养液的目的是防止运输过程中倒置，细胞接触不到培养液而死亡
或活力下降。培养时应该分瓶培养。我想你应该分瓶了吧，我们一般1:3分瓶。不分瓶培养可想而知了。
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2。如果上述没错的话，准备好正确的完全培养液，将生长不好的细胞瓶中的细胞消化收集，合并一
下，铺底大概30％。正常培养。
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3。关键掌握住起始细胞的密度和严格的操作。因为这细胞已很常见。方法正确不存在长不好的问题。
除非你的老师带回来的细胞存在问题。
参考见解2：
37度预热胰酶，吸除培养瓶中的培养液，PBS（无钙镁）洗涤细胞1次后，加入少量胰酶，覆盖细
胞即可。轻轻摇动（前后左右）。镜下观察细胞状态，一旦出现细胞回缩形态变圆即停止消化（防止过渡
消化）。加入完全培养液（必须含胎牛血清）终止消化反应。湾头吸管顺序吹打细胞，小心避免产生气泡
（对细胞有害）。镜下观察细胞，细胞分散即可后续操作。如果是新手，保留上清以防不测，别倒掉。
6．问：最近要养CHO细胞,要作些准备,但不知道其培养也是什么,谢谢
参考见解：这是一篇已发表的CHO细胞培养的方法.
CHO细胞培养：CHO细胞株置于RPMI 1640 培养基中，内含10%灭活小牛血清，青霉素100 IU/mL，
链霉素100 IU/mL，置于37℃，5%CO2的培养箱（德国Heraeus）中培养。每隔48 h换培液，当单层培养
细胞汇合以后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。 将培养瓶中的CHO细胞按1×105/mL传代移入培养
板中，待进入对数生长期后（约24 h）加药。
这是细胞的供给源:
CHO细胞由中科院上海生物化学和细胞生物学研究所提供。
7．问：这两个月，CHO细胞在反应器上总是在前两天很难密度长上去，同期转瓶生长正常，基本排除细
胞及培养基的问题，换罐做也出现同种现象，可排除反应器问题。与曾经在此罐上正常生长的一批相比，
只是接入培养液体积由1.5升该为0.8升，其他条件均相同，反应器控制系统无异常。不知问题到底出在
什么地方
参考见解：根据我自己的经验，如果你的种子细胞和培养基都确保没问题的话，试试一下几点：
1.接种时留一些细胞悬液，种回到方瓶或转瓶中，用与大罐相同的培养基同时培养，观察48小时内
的生长情况，如果方瓶长势良好而罐子有问题，那就是操作的问题了
2.不知道你的罐子800mL能否确保搅拌、通气等参数的控制效率，只看仪表显示是不够的，有时液
位太低可能探测到的不是真实值，你可以在接种前用水试试，把各种条件设的极端一些，容易发现问题
3.有可能的话再做一次1.5L培养，看能否重现6月的结果，因为你说所有条件都一样可能是不准确
的，有疏漏的地方
8．问：我培养的cho细胞,在塑料基质的方瓶中贴壁和生长情况很好,形态也很正常,但是接入转瓶后贴壁情
况很差,不伸展或伸展需要的时间很长.请问这主要是什么原因?
参考见解：我觉得可能的原因有如下几点：
1 细胞本身贴壁生长的能力较弱，一般细胞在塑料器皿上的贴附能力强于玻璃器皿，这样的话，就
选择塑料器皿好了。其实塑料培养瓶等也是可以重复使用的，清洗干净，泡酸，冲洗干净，凉干之后，射
线照射消毒或者就是紫外消毒也行，我们实验室就这样重复用培养板，没有什么问题。当然，太旧的还是
扔了好了。
2 培养液PH不好也会影响贴壁，配的时候加好缓冲试剂，不嫌麻烦的话调定PH在7.2左右。使用
时间较长的培养液由于在空气中暴露时间长，ph会有变化
3 消化时候处理不合适，比如胰酶消化过久，有EDTA的话，去除不干净也影响贴壁的。消化完了
之后要吸干净消化液，用培养液漂洗细胞，或者吹下来之后离心，换加新鲜培养液
4 血清也可能影响贴壁，我观察过，细胞在胎牛血清中贴壁明显快于新生牛血清，尤其是Hyclone
的血清，不过很贵
9．问：最近我养CHO细胞，是从别人那里得来得。给我得时候细胞有一半是圆形一半是梭行的。但是养
着养着就大部分成圆形，而且有的像荷包蛋一样，而那些还是梭形的细胞里面出现了空泡一样的东西，还
有渐渐像融化了一样。是什么原因，我一直很头疼，不知道该怎么办，下面的实验无法进行，苦恼啊！
参考见解：听您的描述估计很可能是支原体污染。
建议马上丢弃该细胞，因为支原体污染很难去除，为避免影响您实验室其他的细胞操作一定不要犹
豫。您可以重新索取或购买状态好的CHO细胞。
10．问：由于接种密度稍低一些，CHO细胞在2L转瓶中培养5天左右很难消化下来，即使消化下来也是
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成团的，请问为什么？加完血清的培养基又重新过滤了，会不会对细胞的生长速度有影响，一般培养三天
就能张满，谢谢
参考见解：1：首先考虑一下你的胰酶有没有问题，也有可能是胰酶的浓度不够？
2：成团也可能是细胞太多了，因此在消化时应该延长消化的时间，同时传代时尽量吹散成单细胞悬
液！
3：消化后传代时多弃去些细胞试试，也可以多传几瓶，三瓶，四瓶都是可以的！
CHO细胞表达系统在疫苗研制中应用
分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究
的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表
达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
1．CHO细胞表达体系及其特点
CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO
和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的
潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌
外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞
获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sFM 中生长良好。
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：
(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然
蛋白分子；
(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大
规模生产。
2．CHO细胞表达疫苗
2.1 乙肝疫苗
CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。目前只有 CHO表达乙肝疫苗 已投入生产，这
是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。使用酵母表达乙肝疫苗虽然获
得了很大成功，但是酵母系统还存在着许多缺陷，最重要的一点，酵母不能模拟蛋白在人体肝细胞中的翻
译后修饰、蛋白折叠、大分子组装以及糖基化。这些特点正是抗原在动物细胞中引起免疫反应所必须的。
而 CHO细胞表达的蛋白更接近人体来源的乙肝表面抗原。1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合
长春生物制品研究所等单位研制成功了由 CHO细胞表达的基因工程乙肝疫苗，并于1992年批量上市。该
疫苗是以S蛋白为靶抗原的乙肝疫苗，与酵母表达的乙肝表面抗原同属于第2代乙肝疫苗。
许多实验证明，乙肝病毒(rmv)衣膜蛋白的PreS部分在引发人体免疫反应中起着重要作用。因此由
CHO细胞中表达的含S和PreS2基因的乙肝表面抗原，被誉为第三代乙肝疫苗。以色列生产的新 型疫苗。
包含了S、PreS1、PreS2等3个基因，在CHO中表达的蛋白形成22 μm大小的颗粒，含有衣膜所有的抗
原表位。
目前已投入市场的CHO表达基因重组乙肝疫苗主要有：法国巴斯德研究所Gen Hevac B、以色列
Bio-Technology General公司的Bio-Hep-B、瑞士的Hepreeombe等。在美国以酵母表达的乙肝疫苗为主的
同时，CHO表达的乙肝疫苗占据了欧洲市场。中国长春生物制品所的乙肝疫苗 已正式生产。在现有的安
全性记载中，动物细胞表达的生物产品尤其CHO表达的产物的安全性很好。在已批准进入临床或生产的
动物细胞表达的乙肝疫苗的使用中，没有发现严重的副反应。
在免疫原性方面，我国 CHO生产的乙肝疫苗的免疫原性与血源疫苗没有差异，明显优于酵母重组疫
苗。还有调查显示，新生儿接种国产乙肝CHO疫苗第1年的抗HBs阳性率为98.25％，抗体GMT为77.64，
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而血源疫苗免疫后第1年抗HBs阳性率在73.3％～93.5％之间。与酵母重组疫苗比较，更低剂量的CHO
乙肝重组疫苗及鼠细胞表达的乙肝疫苗在T细胞水平产生更高的免疫原性，这些疫苗刺激T细胞产生帮助
引起更高的血清转化率和更高的抗HBs滴度。
2.2 Epstein-Ban-病毒(EBV)疫苗
象其他疱疹病毒一样，EBV外周包绕一层脂质包膜。主要由gp340(有报道为gp350)和gp220两种糖
蛋白组成，分子量分别为340kDa和220kDa。gp340/220具有广泛的糖基化位点，其多糖部分占整个分子
量的50％以上，因此，哺乳动物细胞是其最适宜的表达宿主。将含gp340/220基因的重组载体，转染CHO-A6
细胞系和CHO dhfr-细胞系，经筛选获得可表达gp340/220蛋白的细胞株，经纯化的gp340/220免疫小鼠。
2周后小鼠血清中检测到明显的gp340/220特异性抗体，表明CHO细胞表达的gp340/220具有同天然膜抗
原相似的分子量、糖基化程度、免疫特异性和免疫原性，可望成为EB病毒基因工程亚单位疫苗。
国外有研究也将gp340/220基因克隆构建重组载体，但经过定点突变使之只合成gp340蛋白。该种蛋
白同样能被抗gp340220的单克隆抗体所识别，并具有同EBV受体、CD21结合的能力，说明重组蛋白同
野生型EBVgp340/220结构相似。用重组蛋白免疫兔子，获得了高滴度的抗体，所产生的抗体可以中和野
生型EBV。
2.3 艾滋病病毒(HIv)疫苗
HIV基因组中的三大结构蛋白编码区分别编码核心蛋白Gag、聚合酶Pol和外膜蛋白Env。Env的前
体单位为糖蛋白gpl60，加工后形成膜外蛋白gp120和跨膜蛋白gp41。目前针对 HIV病毒研制的疫苗有多
种：减毒活疫苗、灭活疫苗、载体活疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗及重组亚单位疫苗。
其中不同宿主细胞表达的以Env、Gag、Pol等蛋白为靶抗原的多种亚单位疫苗在国外进入了临床实
验。其中CHO细胞表达的gpl20制成的疫苗为较早研制的一种。重组载体转入CHO-L761h细胞系，获得
可持续分泌gpl20蛋白的细胞株。
纯化后的蛋白同3种常用免疫佐剂免疫兔子，均诱导了高滴度的免疫反应；给猩猩接种也可以保护
机体免受由低剂量的同类 HIV毒株攻击而导致的感染。但是在泰国给数千人免疫接种后无明显的保护效
果。不过。在恒河猴接种gp120疫苗的同时注射CHO表达的重组白介素12(ILl2)。所诱导的抗体水平是单
一接种gp120疫苗的10倍；而新的I临床使用表明，受试者免疫重组痘病毒疫苗后。再使用gp120亚单位
疫苗加强，80%以上的人产生了特异的体液和细胞免疫反应。
3．小结
由于CHO表达系统具有完善的翻译后修饰功能。对于一些特定的蛋白。特别是糖基化程度高的蛋白
来说。是最为合适的表达体系。因此，除了以上介绍的3种病毒疫苗外。丙肝病毒、水痘一带状疱疹病毒
亚单位疫苗在 CHO细胞中的表达在国内外均有研究。但CHO表达亚单位疫苗还存在着一些问题：
(1)单一的亚单位疫苗往往具有免疫原性弱的缺点；
(2)CHO细胞培养成本高、条件难控制。在一定程度上限制了CHO细胞表达亚单位疫苗的发展。
因此。应进一步研究CHO表达系统，对表达载体进行改造使之能容载更大片断的蛋白基因并提高表
达量；改造CHO细胞使之更利于大规模生产；改进发酵工艺、纯化工艺。使CHO培养成本降低。
CHO细胞表达系统研究进展
影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻
译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达谓节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有
一定作用。研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染
方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构
来实现。
转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作
用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此，表达载体的元件组成及结构是ClIO细胞高效表达外源
基 因的关键因素之一。借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，
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使其方便而高效地用于外源基因的表达。 目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表
达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件 主要有启动子一增强子元件、转录
剪切和Poly A信号等。
1 启动子
启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作
用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报
告基因在细胞中测定。SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、
LTR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子
>LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。
来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，
依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有
多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启
动子等在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前导
序列，使CHO细胞表达EPO的水平增加了2l倍和l6倍。在实际应用中所有的生产细胞系都是用强的、
组成 型启动子。SR启动子(SV40早期启动子+HTLV)比SV40早期启动子表达水平提高约5倍。
与启动子相连的是增强子元件，也是一种调节基因转录的顺式作用元件，具有种和组织特异性。病
毒增强子的主要优点是病毒包装要求增强子位于mRNA帽子位点附近，从而形 成紧密型表达载体CHO
细胞中一般使用SV40和CMV增强子。增强子可位于载体中两个启动子之间，为两个启动子公用。
2 外源基因
位于启动子之后的是克隆的基因序列，或被表达的外源蛋白的cDNA。外源基因的结构 可在翻译水
平上调控它的表达效率，这种调控机理很复杂，目前尚不清楚。但是在启动子一定的情况下，可以通过下
列方法增加外源基因的表达量：
①在加工和剪接途径中引入一个指导前体mRNA合成的内含子序列；
②引入一个促进mRNA翻译的序列；
③拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌物和膜结合蛋白的输出等；
④在不改变基因产品氨基酸序列的前提下修饰个别基因的编码序列，解决密码子偏性问题；
⑤尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5
未翻译前导区和克隆中的GC尾部对表达水平的不良影响，以及减少3未译区(3-UTR)对mRNA稳定性的
不良影响。例如，人G-CSF基因的3-UTR中富含AT元素（ARE)，ARE与mRNA 的半衰期有关，切除
AR以增加mRNA的稳定性，提高蛋白质的合成；
⑥转染靶细胞中导人表达载体启动子相应的强反式激活因子是提高外源基因表达的新策略。
3 终止区域
为了使外源基因得到准确表达，其后是强的终止子区域。终止子一般从病毒基因组，如 SV40、T抗
原终止信号、肝炎表面抗原序列或β-珠蛋白等中获得。不同的3'-未编码区(UTR)序列能影响重组系统的表
达。Rotondaro等使用两个不同的3'-未翻译区表达人G-CSF，结果包含兔β1-珠蛋白基因第二内含子和聚
腺苷酸信号的3'-UTR的表达效率高于包含SV40小t内含子和早期区域腺苷酸化信号的3'-UTR的表达效
率。
4 选择标记
要从细胞中选择出获得了外源DNA并稳定转化的动物细胞是很困难的。为此，人们在表达质粒或另
一个质粒上，克隆或构建了许多选择性标记。目前有十余种选择性标记可供使用。最常使用的有DHFR、
Neo和GS等基因。为了便于过程分析，研究者们还在CHO细胞中构建了一些具有特殊物理性质的报告基
因。如Trudy H等人将 Lac z基因克隆到载体上，通过简单的比色实验便可快速测定出β-半乳糖苷酸
的活性，细胞在无菌条件下分析后还可继续培养。分泌碱性磷酸酶的基因也有类似的功效。其它类型的报
告基因在检测时不甚便利，因为它们或者要求放射性基质，或者要求特殊仪器以测定发光物质或荧光物质。
5 基因扩增
外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。一般来讲，表达系统
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中的整个载体是由两个独立且连在一起的表达单元组成：外源基因表达单元和 扩增基因表达单元。扩增
基因往往亦为选择标记。
迄今为止，世界上已经建立了十余种基因扩增选择系统，其中二氢叶酸还原酶(dhfr)基因扩增系统是
最常用的基因扩增选择系统。而谷氨酰胺台成酶(GS)扩增系统是新近发展的更有效的扩增表达系统。宿主
细胞为CHO-k1细胞。在这个系统中质粒pEEl4被整合人染色体，使外源基因在人巨细胞病毒(h-CMV5)
和 SV40 3'-端控制下进行表达。选择标记基因是从SV40晚期启动子转录而来，其中包括一个小基因，一
个内含子和3'-侧翼约lkb DNA。GS基因的选择压力是低水平的MSX，在这一选择压力下．细胞内的外源
基因拷贝数可达1000-2000拷贝/细胞。GS基因扩增前后，CAT基因的表达水平提高了19-20倍左右。与
dhfr基因扩增系统相比，GS系统具有更高的扩增效率。Bebbinglon等人利用GS系统生产嵌合抗体，表达
水平达200-500mg/106/48h。
CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望
存在的问题
在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利
用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存
在以下问题：
①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低；
②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；
③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而
对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少；
④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
前景展望
在今后的若干年内，随着以CHO细胞为主的动物细胞表达系统日趋完善，动物细胞将可能成为生产
基因工程药物的主要宿主细胞。围绕CHO细胞表达系统而进行的相关研究将成为生物工程领域一个活跃
的研究热点。科研人员将把以下问题作为今后的主攻方向：
①提高表达水平，如发展一些新的强启动子，寻找合适的增强子，装配适合于cDNA高效表达的必
要元件以及根据CHO细胞翻译特点调整外源基因密码子等；
②在进一步提高表达水平的同时．还将注重分离纯化的问题，如改变DNA中的个别序列，使表达产
物在不影响生物 活性的前提下，携带有利于分离纯化的基团；
③细胞培养的低成本、高密度、高产量和培养设备的大型化、自动化精巧化；
④分离纯化的低成本和高活性回收率。
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