2024年4月9日发(作者：秦昊磊)
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------
常见的生化检测方法
Western-blot 法 Western Blot 印迹法是把通过电泳分离的
蛋白质组分从凝胶转移至一种固相支持物， 通过抗体与附着于固相
支持物的靶蛋白的抗原表位发生特异性反应进行检测。
Western Blot 既可以定性， 又可以半定量， 是初步鉴定靶蛋
白表达的最方便也是最通用的方法。
1、 试剂耗材的准备：
⑴、 转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl， 39 mM 甘氨酸， 0. 037%
SDS， 20%甲醇） ：
⑵、 10丽春红染液：
⑶、 TBS 缓冲液：
⑷、 TBST 缓冲液（含 20%Tween20 的 TBS 缓冲液） ：
⑸、 封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）：
⑹、 一抗、 二抗及抗体稀释液：
参照说明书， 以封闭液或 TBST 进行稀释。
⑺、 底物显色液 ECL， 4℃ 避光保存， 现用现配。
⑻、 显影液和定影液。
用水稀释 10-20 倍于铝盒中， 可多次使用。
室温避光存放。
2、 实验步骤：
⑴、 蛋白样品制备：
1 / 15
用细胞裂解液抽提蛋白， 并测蛋白浓度。
⑵、 取 1mg 蛋白进行 SDS-PAGE。
⑶、 转膜：
（转膜缓冲液 4℃预冷备用， 冷却装置于-80℃冰箱冷冻备用）。
⑷、 将 2 张海绵垫、 2 张滤纸、 转膜夹子及玻棒浸泡在盛
转膜缓冲液的铝盒中。
⑸、 戴上手套， 剪一张与凝胶尺寸相近的 PVDF 膜（83 mm75
mm）， 左上角剪一缺口作为标记， 浸泡在盛有 20mL 甲醇的平皿中
约 15 sec， 直到膜变半透明。
用纯水冲洗膜2 次。
浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
⑹、 SDS-PAGE 结束后， 小心地剥下两块凝胶， 一块用于考
马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。
海绵垫、 滤纸、 PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在 15 min-1hr 之
间。
⑺、 将转膜夹子打开， 使黑的一面保持水平。
按照海绵垫、 滤纸、 凝胶、 膜、 滤纸和海绵垫的先后顺序
铺垫， 制备凝胶转移夹层。
将膜与凝胶对齐。
用玻璃棒赶走气泡。
⑻、 将夹子夹起来， 扣紧， 小心不要移动内层。
放入电转槽中。
2024年4月9日发(作者：秦昊磊)
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常见的生化检测方法
Western-blot 法 Western Blot 印迹法是把通过电泳分离的
蛋白质组分从凝胶转移至一种固相支持物， 通过抗体与附着于固相
支持物的靶蛋白的抗原表位发生特异性反应进行检测。
Western Blot 既可以定性， 又可以半定量， 是初步鉴定靶蛋
白表达的最方便也是最通用的方法。
1、 试剂耗材的准备：
⑴、 转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl， 39 mM 甘氨酸， 0. 037%
SDS， 20%甲醇） ：
⑵、 10丽春红染液：
⑶、 TBS 缓冲液：
⑷、 TBST 缓冲液（含 20%Tween20 的 TBS 缓冲液） ：
⑸、 封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）：
⑹、 一抗、 二抗及抗体稀释液：
参照说明书， 以封闭液或 TBST 进行稀释。
⑺、 底物显色液 ECL， 4℃ 避光保存， 现用现配。
⑻、 显影液和定影液。
用水稀释 10-20 倍于铝盒中， 可多次使用。
室温避光存放。
2、 实验步骤：
⑴、 蛋白样品制备：
1 / 15
用细胞裂解液抽提蛋白， 并测蛋白浓度。
⑵、 取 1mg 蛋白进行 SDS-PAGE。
⑶、 转膜：
（转膜缓冲液 4℃预冷备用， 冷却装置于-80℃冰箱冷冻备用）。
⑷、 将 2 张海绵垫、 2 张滤纸、 转膜夹子及玻棒浸泡在盛
转膜缓冲液的铝盒中。
⑸、 戴上手套， 剪一张与凝胶尺寸相近的 PVDF 膜（83 mm75
mm）， 左上角剪一缺口作为标记， 浸泡在盛有 20mL 甲醇的平皿中
约 15 sec， 直到膜变半透明。
用纯水冲洗膜2 次。
浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
⑹、 SDS-PAGE 结束后， 小心地剥下两块凝胶， 一块用于考
马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。
海绵垫、 滤纸、 PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在 15 min-1hr 之
间。
⑺、 将转膜夹子打开， 使黑的一面保持水平。
按照海绵垫、 滤纸、 凝胶、 膜、 滤纸和海绵垫的先后顺序
铺垫， 制备凝胶转移夹层。
将膜与凝胶对齐。
用玻璃棒赶走气泡。
⑻、 将夹子夹起来， 扣紧， 小心不要移动内层。
放入电转槽中。