2024年4月10日发(作者：任英光)
•
920
•
中国老年学杂志
2019
年
2
月第
39
卷
PVT1
通过促进肿瘤干细胞特性介导肺腺癌细胞
PC9
厄洛替尼抵抗
汤中文倪正义
（
武汉市金银潭医院胸外科
，
湖北武汉
430023
）
〔
摘要
〕
目的探究浆细胞瘤转化迁移基因
（
PVT
）
1
对肺腺癌肿瘤干细胞特性及厄洛替尼抵抗的影响
。
方法慢病
毒介导转染
PVT1
干扰载体
siPVTl-1
及
siPVTl-2
下调肺腺癌细胞
PC9
中
PVT1
的表达作为干扰
A
组及干扰
B
组细胞
，
转染对
照载体为对照组细胞
。
实时荧光定量
PCR（
qPCR
）
技术检测
133
和
CD44
mRNA
的表达水平
，
Western
印迹检测
CD133
和
CD44
蛋白的表达水平
。
CCK-8
法检测细胞对厄洛替尼的半抑制浓度
（
IC50
）
，
方差分析及
SNK-g
检验比较各组指标
间的统计学差异
。
结果
干扰
A
组及干扰
B
组
PVT1
、
CD133
和
CD44
mRNA
的表达水平均显著低于对照组
，
差异有统计学意
义
（
P<0.05
）
。
干扰
A
组及干扰
B
组
CD133
和
CD44
蛋白表达水平均显著低于对照组
，
差异有统计学意义
（
P<0.05
）
。
干扰
A
组及干扰
B
组厄洛替尼
IC50
显著低于对照组
，
差异有统计学意义
（
P<0.05
）
。
结论
PVT1
可通过诱导肺腺癌细胞干细胞特
性的维持促进其厄洛替尼抵抗的发生
。
〔
关键词
〕
浆细胞瘤转化迁移基因
1;
肺腺癌;厄洛替尼;肿瘤干细胞
〔
中图分类号
〕
R735.
9
〔文献标识码
〕
A
〔
文章编号〕
1005-9202
（
2019
）
O4Q920Q4;doi
：
10.
3969/j.
issn.
1005-9202.2019.04.050
2015
年我国肺癌新发病例约
73.3
万
，
死亡
61.0
万,且呈快速增长趋势⑴
，
肺腺癌属于非小细
司
，
货号
：
S1023
）
,DMEM
高糖培养基及胎牛血清
（
美国
Gibco
公司）
，
胰蛋白酶
-EDTA
消化液
（
上海
索宝生物科技有限公司
）
，
瞟吟霉素
（
美国
Sigma
公
司
），
慢病毒包装试剂盒
（
上海翊圣生物科技有限公
司
）
，
慢病毒对照载体
、
干扰载体
siPVTl-1
及
胞肺癌
，
是肺癌主要的病理类型
，
其细胞恶性程度
强
，
血行转移发生早
，
多数患者就诊时已处于晚
期⑵
。
表皮生长因子受体
（
EGFR
）
是影响肺腺癌进
展的重要因素
,EGFR
突变的肺腺癌细胞倾向于更
高的恶性程度
，
同时存在
EGFR
突变的患者肿瘤进
展更快且预后不良⑶
，
表明
EGFR
可作为原癌基因
siPVTl-2
（苏州吉玛基因股份有限公司
）
,TRIzol
Re
agent
RNA
提取试剂
（
美国
Invitrogen
公司
）
，
反转录
试剂盒及
SYBR
Premix
Ex
Taq
H
核酸荧光染料
（
大
连宝生物工程有限公司
）
,qPCR
引物合成
（
武汉金
参与促进肺腺癌的进展
。
厄洛替尼为表皮生长因子
受体酪氨酸激酶抑制剂
（
EGFR-TKI
）
,
可显著改善
开瑞生物工程有限公司
）
,
Ripa
蛋白裂解液及
BCA
EGFR
突变肺腺癌患者病情及预后水平
，
是目前晚
期肺腺癌患者靶向治疗的一线药物之一⑷，
然而原
蛋白定量试剂盒
（
上海碧云天生物技术有限公司
）
，
蛋白酶抑制剂
cocktail
（
美国
Roche
公司
）
，
EasyBlot
发及获得性耐药的发生将最终导致厄洛替尼治疗的
失败⑸
。
浆细胞瘤转化迁移基因
（PVT
）
l
属于长链
非编码
RNA
（LncRNA
）
,
是近年肿瘤研究的热点分
电化学发光（
ECL
）
显色试剂盒
（
上海生工生物工程
公司
）
，
抗体
（
美国
Abeam
公司
）
:
CD133
（
abl9898
）
,
CD44
（
ab51O37
）
,
p-actin
（
ab8227
）
,
Goat
Anti-Rabbit
子
，
其可通过多种途径参与促进不同恶性肿瘤的恶
性行为⑹
。
本实验以
EGFR
敏感突变的
PC9
肺腺
癌细胞系为模型
，
对
PVT1
与厄洛替尼抵抗的关系
免疫球蛋白
（
Ig
）
G
二抗
（
ab6721
）
,
CCK-8
试剂盒
（
日本同仁化学研究所
）
。
1.2
实验仪器
主要实验仪器包括
：
H
eraguard™
及相关机制进行初步探究
。
ECO
超净工作台及
Forma
C0
2
细胞培养箱
（
美国
Thermo
Scientific
公司
）
,
DM
1000
显微镜
（
德国
Leica
1
材料与方法
11
实验细胞及试剂实验细胞包括人肺腺癌细
公司
）
,1-16K
高速离心机
（德国
Sigma
公司
）
,2720
Thermal
Cycler
PCR
仪及
Nanodrop2000
超微量分光
胞系
PC9
（
上海生博生物医药科技有限公司
）
及人
胚肾细胞
293T
（
美国模式培养物集存库
）
。
主要实
光度计
（
美国
Thermo
Scientific
公司）
,7500
Fast
实
时荧光定量
PCR
仪
（
美国
Thermo
Scientific
公司
）
,
iMark
多功能酶标仪
（
美国
Bio-Rad
公司
）
，
电泳仪及
验试剂包括:科研用盐酸厄洛替尼
（
美国
Selleck
公
通信作者:倪正义
（
1967-
）
,
男
，
主任医师
，
主要从事胸外科疾病的治
疗研究
。
转膜仪等
（
上海天能科技有限公司
）
，
Gel
Imager
凝
胶成像系统
（
美国
Thermo
Scientific
公司）
。
1.3
实验方法
第一作者:汤中文
（
1979-）
,
男
，主治医师
，
主要从事胸外科疾病的诊
疗研究
。
13.1
细胞培养与分组处理
PC9
及
293T
细胞均
汤中文等
PVT1
通过促进肿瘤干细胞特性介导肺腺癌细胞
PC9
厄洛替尼抵抗
第
4
期
•
921
•
使用
10%
胎牛血清
DMEM
高糖培养基培养,培养环
境
；
5%CO
2
,37^C,
湿度
1
00%
。
分组处理
：
将
293T
细胞接种至
6
孔板中
，
接种浓度为
2xl0
5
个
/
孔,共
接种
3
孔
，
分别标记为对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组病毒
，
培养过夜后取
3
支
1.5
ml
离心管
，
每管加
入
7.5
>11
转染脂质体及
500
门
DMEM
高糖培养基
，
并分别加入慢病毒对照载体
、
干扰载体
siPVTl-1
及
siPVTl-2,
充分混匀后室温静置
20
min,
分别加入相
应的
293T
细胞中
,6
h
后更换
10%
胎牛血清
DMEM
高糖培养基培养
,48
h
后收集细胞上清液,过滤后
得到
3
组病毒悬液备用
。
将
PC9
细胞接种至
6
孔板
中
，
接种浓度为
2
乂
105
个/孔,共接种
3
孔
，
同样分别
标记为对照组
，
干扰
A
组及干扰
B
组
，
将各组病毒
悬液与
10%
胎牛血清
DMEM
高糖培养基
1
：
1混合
培养各组
PC9
细胞
3
天
，
1
jjig/ml
H
吟霉素筛选细
胞至稳定生长
。
1.3.2
实时荧光定量
PCR(qPCR)
检测各组细胞
PVT1
、
CD133
和
CD44
mRNA
表达水平
收集对照
组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
2xl0
5
个以上,
Trizol
法提取细胞总
RNA,
反转录试剂盒得到3
组细胞的
cDNA
模板,稀释合成引物
，
引物序列：
PVT1
上游引
物
5
'-CATCCGGCGCTCAGCT-3
'
,
下游引物
5
Z
-TCAT-
GATGGCTGTATGTGCCA-3'
；
CD133
上游引物
5'-
TTACGGCACTCTTCACCT-3
7
,
下游引物
5
，
-TATTC-
CACAAGCAGCAAA-3
z
；
CD44
上游引物
5'-ACAACT-
GGTGATGGAGACTCATCC3,
下游引物
5
，
-CA-
GAGTGGCTTATCATCTTGG-3
7
；
0-actin
上游引物
5'-
TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3
，
,
下游引物
5
，
-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3
，
。
根据
SYBR
Premix
Ex
Taq
口核酸荧光染料要求配置
qPCR
体系
，
行两步法
PCR
扩增:预变性
95^
,30
s
；
扩增反应
95
七
，
5
s,60t,34
s,
熔解阶段
95t,15
s
。
以
p-actin
为内参基因
,2'
aact
法计算各组细胞
PVT1
及44
mRNA
的表达量
。
1.3.
3
Western
印迹检测各组细胞
CD133和
CD44
蛋白表达水平
收集对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组
细胞
5x105
个以上,
Ripa
裂解液冰上裂解细胞
2
h,
13
000
r/min,4T
：
离心
10
min,
取上清液
BCA
试剂
盒检测总蛋白浓度
，
取
50
)
xg
配置十二烷基硫酸钠
-
聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE
)
上样体系
，
100T
变
性
5
min,10%SDS-PAGE
电泳稳压
120
V,2
h,
转膜稳
流
300
mA,
2
h,5%
脱脂牛奶封闭
2
h,PBS
洗膜后一
抗
4
七摇转孵育过夜
，
抗体浓度
1
：
1
OOO,PBS
洗膜
3
次
,1
：2
000
二抗室温孵育
2
洗膜
3
次后行
ECL
发光,
Gel
Imager
凝胶成像系统曝光条带上蛋白
印迹,并扫描灰度值
，
以
P-actin
为内参基因
，
目的条
带与
P-actin
灰度值比作为目的蛋白表达量
。
1.3.4
CCK-8
实验检测各组细胞厄洛替尼半抑制
浓度
(IC50)
接种对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细
胞于
96
孔板中
，
浓度
2
000
个
/孔
，
设置
0
、
2.5
、
5
、
10
、
20
,40,80
J60
、
320
nmol/L
厄洛替尼浓度梯度
,
每组浓度梯度设置
5
个重复孔
，
培养过夜后加入相
应浓度的厄洛替尼继续培养
24
h,
弃上清
,CCK-8
试
剂与
10%
胎牛血清
DMEM
高糖培养基
1
：
5
混合均
匀后加入细胞中
,37
七孵育
1
h,
酶标仪检测
450
nm
处波长
，
以各组细胞
0
nmol/L
浓度的吸光值为基线
绘制拟合曲线
，
并分析细胞厄洛替尼
IC50
值
。
1.4
统计学方法
采用
SPSS18.0
软件进行单因素
方差分析
、
SNK-g
法
。
2
结果
2.1
各组细胞
133
和
CD44
mRNA
表达
水平的比较
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
PVT1
表达水平分别为
(0.
057
±0.
006)
,
(0.
016±
0.
002)
及
(0.
012±0,
002)
；
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD133
mRNA
表达水平分别为
(0.
237
±
0.
019),(
0.
095
±0.010)
及
(
0.
127
±
0.
014
)
；
对照
组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD44
mRNA
表达水
平分别为
(0.
386+0.
033)
,
(
0.
179
±
0.
013
)
及
(0.
142±0.018),
干扰
A
组及干扰
B
组
PVT1
、
CD133
和
CD44
mRNA
的表达水平均显著低于对照
组,差异有统计学意义
(
P<0.
05
)
o
2.2
各组细胞
CD133
及
CD44
蛋白表达水平的比
较
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD133
蛋白
表达水平分别为
(0.
691
±0.
103),(0.
348
±0.
072)
及
(0.
316+0.
085
)
；
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD44
蛋白表达水平分别为
(
0.
540
±
0.
093
)
、
(0.
274±0.
060)
及
(
0.
282±0.
057)
；
干扰
A
组及干
扰
B
组
CD133
和
CD44
蛋白表达水平均显著低于对
照组
，
差异有统计学意义
(P<0.
05),
见图
1
。
图
1
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD133
及
CD44
蛋白表达水平
•
922
•
2.3
各组细胞厄洛替尼
IC50
的比较
对照组
、
干
扰
A
组及干扰
B
组细胞厄洛替尼
IC50
分别为
〔
（
149.4±15.
3
）
nmol/L
〕
、
〔
（
53.
1
士&
2
）
nmol/L
〕
及
t
（67.
4±10.5
）
nmol/L
］
，
干扰
A
组及干扰
B
组厄洛
替尼
IC50
显著低于对照组
，
差异有统计学意义
（
P<
0.
05
）
。
3
讨论
LncRNA
是一类无开放阅读框且转录本长度大
于
200
nt
的
RNA
分子
，
其不翻译相应蛋白
，
而是通
过转录调控及转录后调控等表观遗传机制发挥生物
学作用⑺
。
基于表观遗传在肿瘤中的重要地位
，
包
括PVT1
在内的多种
LncRNA被发现参与影响恶性
肿瘤的发生发展⑻
，
PVT1
基因定位于人染色体
8q24
上,研究显示其在多种恶性肿瘤组织中表达上
调
，
且可促进肿瘤细胞的恶性行为及化疗抵抗的形
成:
PVT1
被发现高表达于胰腺癌，
且表达与患者淋
巴结转移及不良预后正相关,
PVT1
是导致胰腺癌患
者预后不良的独立危险因素
⑼
；
PVT1
在胃癌组织
及细胞中表达上调
，
与患者预后不良正相关,且在多
药耐药的胃癌组织及细胞中表达进一步增强
，体外
研究显示
PVT1
可促进多药耐药基因
、
mTOR
信号通
路及缺氧诱导因子
1«
的活化介导胃癌细胞的恶性
行为
［
1
°
］
;PVT1
高表达于卵巢癌组织中
，
且可通过抑
制卵巢癌细胞的凋亡介导其顺钳抵抗能力的形
成⑴
）
；
PVT1
还可通过调控信号转导与转录激活因
子
（
STAT
）
6
的表达促进乳腺癌细胞的体内外增
殖
［
12
）
；
PVT1
在结直肠癌组织中表达上调
，
同样可提
示患者预后不良
，
体外
siRNA
介导
PVT1
表达下调
后细胞增殖及转移能力均显著下调
（
⑶
；
非小细胞肺
癌组织及细胞中同样发现
PVT1
的高表达
，
且
PVT1
表达与细胞组织学分级
、
淋巴结转移及患者不良预
后显著正相关
，
体外干扰
PVT1
表达可下调肺癌细
胞增殖转移能力
，
提示
PVT1
对肺癌细胞恶性行为
存在促进作用
“
切
，
但目前有关
PVT1
与肺腺癌厄
洛替尼抵抗的关系及相关机制尚不明确
。
肿瘤干细
胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的肿瘤细
胞
，
其具有启动和重建肿瘤组织表型的能力
，
被认为
与恶性肿瘤放化疗抵抗的形成密切相关
C16J
,CD133
及
CD44是经典的非小细胞肺癌干细胞标志物
，
CD133
参与肿瘤信号转导及免疫逃逸等机制，
是影
响肿瘤细胞生长及生存的重要分子
，
而
CD44
则参
与细胞间及细胞间质间的特异性粘连
，
对肿瘤细胞
的黏附及上皮间充质转化具有重要意义
，
两者均被
发现参与肺癌细胞放化疗抵抗的形成
［
，
7J8
］
o
另外
，
中国老年学杂志
2019
年
2
月第
39
卷
Farhana
等(叨在研究中指出
PVT1
与结直肠癌细胞
干细胞特性存在密切联系
。
本研究结果显示
，
体外干扰
PC9
肺腺癌细胞系
中
PVT1
表达后
，
细胞
CD133
及
CD44
的
mRNA
及
蛋白表达均出现明显下调
，
提示
PVT1
可能通过
CD133
及
CD44
转录水平的正调控作用
，促进肺腺
癌的干细胞特性
。
干扰
PVT1
表达后
，
细胞厄洛替
尼
IC50
值显著降低
，
对厄洛替尼的敏感性增强
，
提
示
PVT1
对
PC9
细胞厄洛替尼抵抗发生的促进作
用
。
综上所述
，
本研究表明
PVT1
可通过介导肺腺
癌细胞干细胞特性促进其厄洛替尼抵抗的发生
。
4
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evaluation
of
emerging
tools
[
J
]
.
RNA
,2014
；
20(
11
)
:
1655-65.
8
Cheetham
SW
,Gruhl
F
,
Mattick
JS,et
al.
Long
noncoding
RNAs
and
the
genetics
of
cancer
〔
J
〕
.
Br
J
Cancer,2013
；
108
(
12
)
：2419-25.
9
Huang
C
,
Yu
W
,
Wang
Q
,et
al.
Increased
expression
of
the
IncRNA
PVT1
is
associated
with
poor
prognosis
in
pancreatic
cancer
patients
[JJ.
Minerva
Med,
2015
；
106(3
)
：
143-9.
10
Zhang
XW
,
Bu
P,
Liu
L,
et
al.
Overexpression
of
long
non-coding
RNA
PVT1
in gastric
cancer
cells
promotes
the
development
of
mul-
tidrug
resistance
[
J
).
Biochem
Biophy
Res
Commun
,2015
；
462
(
3
)
:
227-32.
II
Liu
E
,
Liu
Z
,
Zhou
Y,et
al.
Overexpression
of
long
non-coding
RNA
PVT1
in
ovarian
cancer
cells
promotes
cisplatin
resistance
by
regula
ting
apoptotic
pathways
〔
J
〕
.
Int
J
Clin
Exp
Med
,
2015
；
8
(
11
)
：
20565-72.
12
Yan
C
,
Chen
Y,
Kong
W,e£
al.
PVT1
-derived
miR-1207-5p
promotes
breast
cancer
cell
growth
by
targeting
STAT6
〔
J
〕
.
Cancer
Sci
,2017
；
108(5):868-76.
13
Takahashi
Y
,
Sawada
G
,
Kurashige
J,e£
al.
Amplification
of
PVT-1
is
involved
in
poor
prognosis
via
apoptosis
inhibition
in
colorectal
canc-
ers
〔
J
〕
.
Br
J
Cancer,
2014
；
1
10(
1
)
：
164-71.
刘波等
KIM
・
1
在
TGF-B1
诱导的大鼠肾小管上皮细胞纤维化因子表达中的作用第
4
期
•
923
•
14
Yang
YR
,
Zang
SZ
,
Zhong
CL,et
al.
Increased
expression
of
the
ln-
2015
；
27
(7)
：
458-60.
cRNA
PVT1
promotes
tumorigenesis
in
non-small
cell
lung
cancer
18
Suda
K
,
Murakami
I,
Yu
H
,eZ
al.
PS06.
01
CD44
confers
EMT
phe
[
J
Clin
Exp
Pathol,
2014
；
7(
10)
：
6929-35.
notypic
change
following
resistance
to
EGFR-TKIs
in
lung
cancer
15
Cui
D,
Yu
CH
,
Liu
M,et
al.
Long
non-coding
RNA
PVT1
as
a
novel
[JJ.
J
Thorac
Oncol,
2017
；
12(
11
)
：
S1581-2.
biomarker
for
diagnosis
and
prognosis
of
non-small
cell
lung
cancer
19
Farhana
L
,
Antaki
F
,
Anees
MR
,
et
al.
Role
of
cancer
stem
cells
in
(J
].
Tumor
Biol,
2016
；
37(3
)
：
4127-34.
racial
disparity
in
colorectal
cancer
[
J
)
.
Cancer
Med
,2016
；
5
(
6
)
:
16
Colak
S
,
Medema
JP.
Cancer
stem
cells
-important
players
in
tumor
1268-7
&
therapy
resistance^
J]
.
Febs
J
,2014
；
281
(21
)
：
4779-91.(2018-04-02
修回
〕
17
吉亚君
，
白玲
，
王鑫
，
等.肿瘤干细胞标志物
-
(编辑王一涵)
4
在小细胞肺癌中的表达及其临床意义
〔
J
〕
•肿瘤研究与临床
，
KIM-1
在
TGF-pi
诱导的大鼠肾小管上皮细胞纤维化因子表达中的作用
刘波'王萍
I
李霞
I
张杰
$
李丽
$
(1
兖矿集团有限公司总医院肾内科
，
山东邹城
273517,2
济宁医学院附属医院肾内科)
〔
摘
要
〕
目的
探讨肾脏损伤因子
(KIM)-l
在转化生长因子
(TGF)-pi
诱导的肾小管上皮细胞纤维化因子表达中的
作用
。
方法
用
TGF-B1
刺激处理大鼠肾小管上皮细胞
NRK52E,qRT-PCR
和
Western
印迹法分别测定细胞中
KIM-1
mRNA
和蛋白水平
。
在
NRK52E
中转染
KIM-1
siRNA,
给予
TGF0
刺激后
,qRT-PCR
和
Western
印迹法分别测定细胞中
KIM-1
mR
NA
和蛋白水平
。
Western
印迹法检测细胞中上皮间质转化
(
EMT)
标志蛋白上皮钙黏附素
(E-cadherin)
、
a-
平滑肌肌动蛋白
(SMA)
和纤维化因子结缔组织生长因子
(CTGF)
J
型胶原酶
(Coll
),3
型胶原酶
(
Col3)
的表达
。
结果
对照组
+TGF-pl
细胞
中
KIM-1
mRNA
和蛋白水平明显高于对照组
(
P<0.05)
。
干扰组
+TGF-pl
细胞中
KIM-1
表达水平显著低于对照组
+TGF-pl
,
差异具有统计学意义
(P<0.05)
。
干扰组
+TGF-P1
细胞中
E-cadherin
蛋白表达水平升高
,a-SMA
表达水平降低
，
纤维化因子
CTGF
、
Coll
、
Col3
的表达也降低
，
与对照组
+TGF-pl
比较差异具有统计学意义
(
P<0.
05)
。
结论
敲低
KIM-1
可以减少
TGF-pl
诱导的肾小管上皮细胞纤维化因子表达,抑制肾小管上皮细胞
EMT
。
〔
关键词
〕
肾小管上皮细胞;纤维化;转化生长因子
B1;
肾脏损伤因子
〔
中图分类号
〕
R692.
6
〔
文献标识码
〕
A
〔
文章编号
〕
1005-9202(2019)044)923>04
；
doi
：
10.3969/.
1005-9202.
2019.04.051
肥胖
、
糖尿病
、
高血压等均会引起慢性肾脏疾
1
材料与方法
病发生
，
肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病发展
1.1
主要材料
大鼠肾小管上皮细胞
NRK52E
购
到终末期的共同特征
，
肾间质纤维化的发生与肾
自成都正能生物
;TGF-pi
购自美国
Pepreotech
；
Li
小管上皮细胞上皮间质转化
(
EMT)
有关
，
在此过
pofectamine
2000
购自美国
Invitrogen
；
BCA蛋白检测
程中
，
上皮细胞标志特征逐渐消失
，
细胞开始表达
试剂盒电化学发光
(ECL)
试剂盒购自美国
Pierce
；
辣
a-
平滑肌肌动蛋白
(
SMA)Z
)
。
肾小管上皮细胞
根过氧化物酶标记的免疫球蛋白
(
Ig)G
购自美国
纤维化发生的诱导因素有很多
，
其中转化生长因
Jackson
;
上皮钙黏附素
(
E-cadherin
)
抗体
、
a-SMA
抗
子
(TGF)-pi
是重要的诱发因子
，
也是常用的体外
体购自美国
BD
；
结缔组织生长因子
(
CTGF)
抗体
、1
研究肾小管上皮细胞纤维化的诱导因子⑶
。
肾脏
型胶原酶
(
Coll
)
抗体
、
3
型胶原酶
(
Col3
)
抗体购自美
损伤因子
(KIM)-l
是一种跨膜蛋白
，
可以反映肾
国
Abeam；
荧光定量
PCR
试剂盒购自大连宝生物
。
功能的变化
，
在肾损伤中具有重要意义
“亠
。
研究
1.2
细胞培养和分组大鼠肾小管上皮细胞
显示
,KIM-1
在肾纤维化组织中表达上调
，
并且可
NRK52E
培养于含
10%
胎牛血清的
DMEM
高糖培
以用于判断肾功能的损伤情况⑹
。
本实验探讨
养液中
，
在
37^,5%
CO?
培养箱内培养
。
NRK52E
KIM-1
在
TGF-pl
诱导肾小管上皮细胞纤维化和
细胞分为
：
对照组
、
对照组
+
TGF-pl
.
阴性组
+TGF-
EMT
中的作用
。
01
、干扰组
+TGF-P1
，
对照组+TGF-R1、
阴性组
+TGF-
卩
1
、
干扰组
+TGF-P1
细胞分别用
TGF-pl
刺激
，
刺激
方法为:在细胞培养液中添加
10
ng/ml
的
TGF-pl
基金项目
：
济宁医学院青年基金项目
(
JYQ14KJ37
)
继续孵育
72
h
0
阴性组+TGF-B1、
干扰组
+
TGF-pl
第一作者:刘波
(1974-),
女
，
主治医师，
主要从事肾脏病学研究
。
细胞在
TGF-pi
刺激前
，
分别转染
siRNA
对照和
2024年4月10日发(作者：任英光)
•
920
•
中国老年学杂志
2019
年
2
月第
39
卷
PVT1
通过促进肿瘤干细胞特性介导肺腺癌细胞
PC9
厄洛替尼抵抗
汤中文倪正义
（
武汉市金银潭医院胸外科
，
湖北武汉
430023
）
〔
摘要
〕
目的探究浆细胞瘤转化迁移基因
（
PVT
）
1
对肺腺癌肿瘤干细胞特性及厄洛替尼抵抗的影响
。
方法慢病
毒介导转染
PVT1
干扰载体
siPVTl-1
及
siPVTl-2
下调肺腺癌细胞
PC9
中
PVT1
的表达作为干扰
A
组及干扰
B
组细胞
，
转染对
照载体为对照组细胞
。
实时荧光定量
PCR（
qPCR
）
技术检测
133
和
CD44
mRNA
的表达水平
，
Western
印迹检测
CD133
和
CD44
蛋白的表达水平
。
CCK-8
法检测细胞对厄洛替尼的半抑制浓度
（
IC50
）
，
方差分析及
SNK-g
检验比较各组指标
间的统计学差异
。
结果
干扰
A
组及干扰
B
组
PVT1
、
CD133
和
CD44
mRNA
的表达水平均显著低于对照组
，
差异有统计学意
义
（
P<0.05
）
。
干扰
A
组及干扰
B
组
CD133
和
CD44
蛋白表达水平均显著低于对照组
，
差异有统计学意义
（
P<0.05
）
。
干扰
A
组及干扰
B
组厄洛替尼
IC50
显著低于对照组
，
差异有统计学意义
（
P<0.05
）
。
结论
PVT1
可通过诱导肺腺癌细胞干细胞特
性的维持促进其厄洛替尼抵抗的发生
。
〔
关键词
〕
浆细胞瘤转化迁移基因
1;
肺腺癌;厄洛替尼;肿瘤干细胞
〔
中图分类号
〕
R735.
9
〔文献标识码
〕
A
〔
文章编号〕
1005-9202
（
2019
）
O4Q920Q4;doi
：
10.
3969/j.
issn.
1005-9202.2019.04.050
2015
年我国肺癌新发病例约
73.3
万
，
死亡
61.0
万,且呈快速增长趋势⑴
，
肺腺癌属于非小细
司
，
货号
：
S1023
）
,DMEM
高糖培养基及胎牛血清
（
美国
Gibco
公司）
，
胰蛋白酶
-EDTA
消化液
（
上海
索宝生物科技有限公司
）
，
瞟吟霉素
（
美国
Sigma
公
司
），
慢病毒包装试剂盒
（
上海翊圣生物科技有限公
司
）
，
慢病毒对照载体
、
干扰载体
siPVTl-1
及
胞肺癌
，
是肺癌主要的病理类型
，
其细胞恶性程度
强
，
血行转移发生早
，
多数患者就诊时已处于晚
期⑵
。
表皮生长因子受体
（
EGFR
）
是影响肺腺癌进
展的重要因素
,EGFR
突变的肺腺癌细胞倾向于更
高的恶性程度
，
同时存在
EGFR
突变的患者肿瘤进
展更快且预后不良⑶
，
表明
EGFR
可作为原癌基因
siPVTl-2
（苏州吉玛基因股份有限公司
）
,TRIzol
Re
agent
RNA
提取试剂
（
美国
Invitrogen
公司
）
，
反转录
试剂盒及
SYBR
Premix
Ex
Taq
H
核酸荧光染料
（
大
连宝生物工程有限公司
）
,qPCR
引物合成
（
武汉金
参与促进肺腺癌的进展
。
厄洛替尼为表皮生长因子
受体酪氨酸激酶抑制剂
（
EGFR-TKI
）
,
可显著改善
开瑞生物工程有限公司
）
,
Ripa
蛋白裂解液及
BCA
EGFR
突变肺腺癌患者病情及预后水平
，
是目前晚
期肺腺癌患者靶向治疗的一线药物之一⑷，
然而原
蛋白定量试剂盒
（
上海碧云天生物技术有限公司
）
，
蛋白酶抑制剂
cocktail
（
美国
Roche
公司
）
，
EasyBlot
发及获得性耐药的发生将最终导致厄洛替尼治疗的
失败⑸
。
浆细胞瘤转化迁移基因
（PVT
）
l
属于长链
非编码
RNA
（LncRNA
）
,
是近年肿瘤研究的热点分
电化学发光（
ECL
）
显色试剂盒
（
上海生工生物工程
公司
）
，
抗体
（
美国
Abeam
公司
）
:
CD133
（
abl9898
）
,
CD44
（
ab51O37
）
,
p-actin
（
ab8227
）
,
Goat
Anti-Rabbit
子
，
其可通过多种途径参与促进不同恶性肿瘤的恶
性行为⑹
。
本实验以
EGFR
敏感突变的
PC9
肺腺
癌细胞系为模型
，
对
PVT1
与厄洛替尼抵抗的关系
免疫球蛋白
（
Ig
）
G
二抗
（
ab6721
）
,
CCK-8
试剂盒
（
日本同仁化学研究所
）
。
1.2
实验仪器
主要实验仪器包括
：
H
eraguard™
及相关机制进行初步探究
。
ECO
超净工作台及
Forma
C0
2
细胞培养箱
（
美国
Thermo
Scientific
公司
）
,
DM
1000
显微镜
（
德国
Leica
1
材料与方法
11
实验细胞及试剂实验细胞包括人肺腺癌细
公司
）
,1-16K
高速离心机
（德国
Sigma
公司
）
,2720
Thermal
Cycler
PCR
仪及
Nanodrop2000
超微量分光
胞系
PC9
（
上海生博生物医药科技有限公司
）
及人
胚肾细胞
293T
（
美国模式培养物集存库
）
。
主要实
光度计
（
美国
Thermo
Scientific
公司）
,7500
Fast
实
时荧光定量
PCR
仪
（
美国
Thermo
Scientific
公司
）
,
iMark
多功能酶标仪
（
美国
Bio-Rad
公司
）
，
电泳仪及
验试剂包括:科研用盐酸厄洛替尼
（
美国
Selleck
公
通信作者:倪正义
（
1967-
）
,
男
，
主任医师
，
主要从事胸外科疾病的治
疗研究
。
转膜仪等
（
上海天能科技有限公司
）
，
Gel
Imager
凝
胶成像系统
（
美国
Thermo
Scientific
公司）
。
1.3
实验方法
第一作者:汤中文
（
1979-）
,
男
，主治医师
，
主要从事胸外科疾病的诊
疗研究
。
13.1
细胞培养与分组处理
PC9
及
293T
细胞均
汤中文等
PVT1
通过促进肿瘤干细胞特性介导肺腺癌细胞
PC9
厄洛替尼抵抗
第
4
期
•
921
•
使用
10%
胎牛血清
DMEM
高糖培养基培养,培养环
境
；
5%CO
2
,37^C,
湿度
1
00%
。
分组处理
：
将
293T
细胞接种至
6
孔板中
，
接种浓度为
2xl0
5
个
/
孔,共
接种
3
孔
，
分别标记为对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组病毒
，
培养过夜后取
3
支
1.5
ml
离心管
，
每管加
入
7.5
>11
转染脂质体及
500
门
DMEM
高糖培养基
，
并分别加入慢病毒对照载体
、
干扰载体
siPVTl-1
及
siPVTl-2,
充分混匀后室温静置
20
min,
分别加入相
应的
293T
细胞中
,6
h
后更换
10%
胎牛血清
DMEM
高糖培养基培养
,48
h
后收集细胞上清液,过滤后
得到
3
组病毒悬液备用
。
将
PC9
细胞接种至
6
孔板
中
，
接种浓度为
2
乂
105
个/孔,共接种
3
孔
，
同样分别
标记为对照组
，
干扰
A
组及干扰
B
组
，
将各组病毒
悬液与
10%
胎牛血清
DMEM
高糖培养基
1
：
1混合
培养各组
PC9
细胞
3
天
，
1
jjig/ml
H
吟霉素筛选细
胞至稳定生长
。
1.3.2
实时荧光定量
PCR(qPCR)
检测各组细胞
PVT1
、
CD133
和
CD44
mRNA
表达水平
收集对照
组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
2xl0
5
个以上,
Trizol
法提取细胞总
RNA,
反转录试剂盒得到3
组细胞的
cDNA
模板,稀释合成引物
，
引物序列：
PVT1
上游引
物
5
'-CATCCGGCGCTCAGCT-3
'
,
下游引物
5
Z
-TCAT-
GATGGCTGTATGTGCCA-3'
；
CD133
上游引物
5'-
TTACGGCACTCTTCACCT-3
7
,
下游引物
5
，
-TATTC-
CACAAGCAGCAAA-3
z
；
CD44
上游引物
5'-ACAACT-
GGTGATGGAGACTCATCC3,
下游引物
5
，
-CA-
GAGTGGCTTATCATCTTGG-3
7
；
0-actin
上游引物
5'-
TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3
，
,
下游引物
5
，
-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3
，
。
根据
SYBR
Premix
Ex
Taq
口核酸荧光染料要求配置
qPCR
体系
，
行两步法
PCR
扩增:预变性
95^
,30
s
；
扩增反应
95
七
，
5
s,60t,34
s,
熔解阶段
95t,15
s
。
以
p-actin
为内参基因
,2'
aact
法计算各组细胞
PVT1
及44
mRNA
的表达量
。
1.3.
3
Western
印迹检测各组细胞
CD133和
CD44
蛋白表达水平
收集对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组
细胞
5x105
个以上,
Ripa
裂解液冰上裂解细胞
2
h,
13
000
r/min,4T
：
离心
10
min,
取上清液
BCA
试剂
盒检测总蛋白浓度
，
取
50
)
xg
配置十二烷基硫酸钠
-
聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE
)
上样体系
，
100T
变
性
5
min,10%SDS-PAGE
电泳稳压
120
V,2
h,
转膜稳
流
300
mA,
2
h,5%
脱脂牛奶封闭
2
h,PBS
洗膜后一
抗
4
七摇转孵育过夜
，
抗体浓度
1
：
1
OOO,PBS
洗膜
3
次
,1
：2
000
二抗室温孵育
2
洗膜
3
次后行
ECL
发光,
Gel
Imager
凝胶成像系统曝光条带上蛋白
印迹,并扫描灰度值
，
以
P-actin
为内参基因
，
目的条
带与
P-actin
灰度值比作为目的蛋白表达量
。
1.3.4
CCK-8
实验检测各组细胞厄洛替尼半抑制
浓度
(IC50)
接种对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细
胞于
96
孔板中
，
浓度
2
000
个
/孔
，
设置
0
、
2.5
、
5
、
10
、
20
,40,80
J60
、
320
nmol/L
厄洛替尼浓度梯度
,
每组浓度梯度设置
5
个重复孔
，
培养过夜后加入相
应浓度的厄洛替尼继续培养
24
h,
弃上清
,CCK-8
试
剂与
10%
胎牛血清
DMEM
高糖培养基
1
：
5
混合均
匀后加入细胞中
,37
七孵育
1
h,
酶标仪检测
450
nm
处波长
，
以各组细胞
0
nmol/L
浓度的吸光值为基线
绘制拟合曲线
，
并分析细胞厄洛替尼
IC50
值
。
1.4
统计学方法
采用
SPSS18.0
软件进行单因素
方差分析
、
SNK-g
法
。
2
结果
2.1
各组细胞
133
和
CD44
mRNA
表达
水平的比较
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
PVT1
表达水平分别为
(0.
057
±0.
006)
,
(0.
016±
0.
002)
及
(0.
012±0,
002)
；
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD133
mRNA
表达水平分别为
(0.
237
±
0.
019),(
0.
095
±0.010)
及
(
0.
127
±
0.
014
)
；
对照
组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD44
mRNA
表达水
平分别为
(0.
386+0.
033)
,
(
0.
179
±
0.
013
)
及
(0.
142±0.018),
干扰
A
组及干扰
B
组
PVT1
、
CD133
和
CD44
mRNA
的表达水平均显著低于对照
组,差异有统计学意义
(
P<0.
05
)
o
2.2
各组细胞
CD133
及
CD44
蛋白表达水平的比
较
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD133
蛋白
表达水平分别为
(0.
691
±0.
103),(0.
348
±0.
072)
及
(0.
316+0.
085
)
；
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD44
蛋白表达水平分别为
(
0.
540
±
0.
093
)
、
(0.
274±0.
060)
及
(
0.
282±0.
057)
；
干扰
A
组及干
扰
B
组
CD133
和
CD44
蛋白表达水平均显著低于对
照组
，
差异有统计学意义
(P<0.
05),
见图
1
。
图
1
对照组
、
干扰
A
组及干扰
B
组细胞
CD133
及
CD44
蛋白表达水平
•
922
•
2.3
各组细胞厄洛替尼
IC50
的比较
对照组
、
干
扰
A
组及干扰
B
组细胞厄洛替尼
IC50
分别为
〔
（
149.4±15.
3
）
nmol/L
〕
、
〔
（
53.
1
士&
2
）
nmol/L
〕
及
t
（67.
4±10.5
）
nmol/L
］
，
干扰
A
组及干扰
B
组厄洛
替尼
IC50
显著低于对照组
，
差异有统计学意义
（
P<
0.
05
）
。
3
讨论
LncRNA
是一类无开放阅读框且转录本长度大
于
200
nt
的
RNA
分子
，
其不翻译相应蛋白
，
而是通
过转录调控及转录后调控等表观遗传机制发挥生物
学作用⑺
。
基于表观遗传在肿瘤中的重要地位
，
包
括PVT1
在内的多种
LncRNA被发现参与影响恶性
肿瘤的发生发展⑻
，
PVT1
基因定位于人染色体
8q24
上,研究显示其在多种恶性肿瘤组织中表达上
调
，
且可促进肿瘤细胞的恶性行为及化疗抵抗的形
成:
PVT1
被发现高表达于胰腺癌，
且表达与患者淋
巴结转移及不良预后正相关,
PVT1
是导致胰腺癌患
者预后不良的独立危险因素
⑼
；
PVT1
在胃癌组织
及细胞中表达上调
，
与患者预后不良正相关,且在多
药耐药的胃癌组织及细胞中表达进一步增强
，体外
研究显示
PVT1
可促进多药耐药基因
、
mTOR
信号通
路及缺氧诱导因子
1«
的活化介导胃癌细胞的恶性
行为
［
1
°
］
;PVT1
高表达于卵巢癌组织中
，
且可通过抑
制卵巢癌细胞的凋亡介导其顺钳抵抗能力的形
成⑴
）
；
PVT1
还可通过调控信号转导与转录激活因
子
（
STAT
）
6
的表达促进乳腺癌细胞的体内外增
殖
［
12
）
；
PVT1
在结直肠癌组织中表达上调
，
同样可提
示患者预后不良
，
体外
siRNA
介导
PVT1
表达下调
后细胞增殖及转移能力均显著下调
（
⑶
；
非小细胞肺
癌组织及细胞中同样发现
PVT1
的高表达
，
且
PVT1
表达与细胞组织学分级
、
淋巴结转移及患者不良预
后显著正相关
，
体外干扰
PVT1
表达可下调肺癌细
胞增殖转移能力
，
提示
PVT1
对肺癌细胞恶性行为
存在促进作用
“
切
，
但目前有关
PVT1
与肺腺癌厄
洛替尼抵抗的关系及相关机制尚不明确
。
肿瘤干细
胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的肿瘤细
胞
，
其具有启动和重建肿瘤组织表型的能力
，
被认为
与恶性肿瘤放化疗抵抗的形成密切相关
C16J
,CD133
及
CD44是经典的非小细胞肺癌干细胞标志物
，
CD133
参与肿瘤信号转导及免疫逃逸等机制，
是影
响肿瘤细胞生长及生存的重要分子
，
而
CD44
则参
与细胞间及细胞间质间的特异性粘连
，
对肿瘤细胞
的黏附及上皮间充质转化具有重要意义
，
两者均被
发现参与肺癌细胞放化疗抵抗的形成
［
，
7J8
］
o
另外
，
中国老年学杂志
2019
年
2
月第
39
卷
Farhana
等(叨在研究中指出
PVT1
与结直肠癌细胞
干细胞特性存在密切联系
。
本研究结果显示
，
体外干扰
PC9
肺腺癌细胞系
中
PVT1
表达后
，
细胞
CD133
及
CD44
的
mRNA
及
蛋白表达均出现明显下调
，
提示
PVT1
可能通过
CD133
及
CD44
转录水平的正调控作用
，促进肺腺
癌的干细胞特性
。
干扰
PVT1
表达后
，
细胞厄洛替
尼
IC50
值显著降低
，
对厄洛替尼的敏感性增强
，
提
示
PVT1
对
PC9
细胞厄洛替尼抵抗发生的促进作
用
。
综上所述
，
本研究表明
PVT1
可通过介导肺腺
癌细胞干细胞特性促进其厄洛替尼抵抗的发生
。
4
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expression
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prognosis
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10
Zhang
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P,
Liu
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Overexpression
of
long
non-coding
RNA
PVT1
in gastric
cancer
cells
promotes
the
development
of
mul-
tidrug
resistance
[
J
).
Biochem
Biophy
Res
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3
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II
Liu
E
,
Liu
Z
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Overexpression
of
long
non-coding
RNA
PVT1
in
ovarian
cancer
cells
promotes
cisplatin
resistance
by
regula
ting
apoptotic
pathways
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J
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11
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Yan
C
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Chen
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Kong
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breast
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cell
growth
by
targeting
STAT6
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Amplification
of
PVT-1
is
involved
in
poor
prognosis
via
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colorectal
canc-
ers
〔
J
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Br
J
Cancer,
2014
；
1
10(
1
)
：
164-71.
刘波等
KIM
・
1
在
TGF-B1
诱导的大鼠肾小管上皮细胞纤维化因子表达中的作用第
4
期
•
923
•
14
Yang
YR
,
Zang
SZ
,
Zhong
CL,et
al.
Increased
expression
of
the
ln-
2015
；
27
(7)
：
458-60.
cRNA
PVT1
promotes
tumorigenesis
in
non-small
cell
lung
cancer
18
Suda
K
,
Murakami
I,
Yu
H
,eZ
al.
PS06.
01
CD44
confers
EMT
phe
[
J
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10)
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notypic
change
following
resistance
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EGFR-TKIs
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lung
cancer
15
Cui
D,
Yu
CH
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Liu
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Long
non-coding
RNA
PVT1
as
a
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12(
11
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S1581-2.
biomarker
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diagnosis
and
prognosis
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non-small
cell
lung
cancer
19
Farhana
L
,
Antaki
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Role
of
cancer
stem
cells
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4127-34.
racial
disparity
in
colorectal
cancer
[
J
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.
Cancer
Med
,2016
；
5
(
6
)
:
16
Colak
S
,
Medema
JP.
Cancer
stem
cells
-important
players
in
tumor
1268-7
&
therapy
resistance^
J]
.
Febs
J
,2014
；
281
(21
)
：
4779-91.(2018-04-02
修回
〕
17
吉亚君
，
白玲
，
王鑫
，
等.肿瘤干细胞标志物
-
(编辑王一涵)
4
在小细胞肺癌中的表达及其临床意义
〔
J
〕
•肿瘤研究与临床
，
KIM-1
在
TGF-pi
诱导的大鼠肾小管上皮细胞纤维化因子表达中的作用
刘波'王萍
I
李霞
I
张杰
$
李丽
$
(1
兖矿集团有限公司总医院肾内科
，
山东邹城
273517,2
济宁医学院附属医院肾内科)
〔
摘
要
〕
目的
探讨肾脏损伤因子
(KIM)-l
在转化生长因子
(TGF)-pi
诱导的肾小管上皮细胞纤维化因子表达中的
作用
。
方法
用
TGF-B1
刺激处理大鼠肾小管上皮细胞
NRK52E,qRT-PCR
和
Western
印迹法分别测定细胞中
KIM-1
mRNA
和蛋白水平
。
在
NRK52E
中转染
KIM-1
siRNA,
给予
TGF0
刺激后
,qRT-PCR
和
Western
印迹法分别测定细胞中
KIM-1
mR
NA
和蛋白水平
。
Western
印迹法检测细胞中上皮间质转化
(
EMT)
标志蛋白上皮钙黏附素
(E-cadherin)
、
a-
平滑肌肌动蛋白
(SMA)
和纤维化因子结缔组织生长因子
(CTGF)
J
型胶原酶
(Coll
),3
型胶原酶
(
Col3)
的表达
。
结果
对照组
+TGF-pl
细胞
中
KIM-1
mRNA
和蛋白水平明显高于对照组
(
P<0.05)
。
干扰组
+TGF-pl
细胞中
KIM-1
表达水平显著低于对照组
+TGF-pl
,
差异具有统计学意义
(P<0.05)
。
干扰组
+TGF-P1
细胞中
E-cadherin
蛋白表达水平升高
,a-SMA
表达水平降低
，
纤维化因子
CTGF
、
Coll
、
Col3
的表达也降低
，
与对照组
+TGF-pl
比较差异具有统计学意义
(
P<0.
05)
。
结论
敲低
KIM-1
可以减少
TGF-pl
诱导的肾小管上皮细胞纤维化因子表达,抑制肾小管上皮细胞
EMT
。
〔
关键词
〕
肾小管上皮细胞;纤维化;转化生长因子
B1;
肾脏损伤因子
〔
中图分类号
〕
R692.
6
〔
文献标识码
〕
A
〔
文章编号
〕
1005-9202(2019)044)923>04
；
doi
：
10.3969/.
1005-9202.
2019.04.051
肥胖
、
糖尿病
、
高血压等均会引起慢性肾脏疾
1
材料与方法
病发生
，
肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病发展
1.1
主要材料
大鼠肾小管上皮细胞
NRK52E
购
到终末期的共同特征
，
肾间质纤维化的发生与肾
自成都正能生物
;TGF-pi
购自美国
Pepreotech
；
Li
小管上皮细胞上皮间质转化
(
EMT)
有关
，
在此过
pofectamine
2000
购自美国
Invitrogen
；
BCA蛋白检测
程中
，
上皮细胞标志特征逐渐消失
，
细胞开始表达
试剂盒电化学发光
(ECL)
试剂盒购自美国
Pierce
；
辣
a-
平滑肌肌动蛋白
(
SMA)Z
)
。
肾小管上皮细胞
根过氧化物酶标记的免疫球蛋白
(
Ig)G
购自美国
纤维化发生的诱导因素有很多
，
其中转化生长因
Jackson
;
上皮钙黏附素
(
E-cadherin
)
抗体
、
a-SMA
抗
子
(TGF)-pi
是重要的诱发因子
，
也是常用的体外
体购自美国
BD
；
结缔组织生长因子
(
CTGF)
抗体
、1
研究肾小管上皮细胞纤维化的诱导因子⑶
。
肾脏
型胶原酶
(
Coll
)
抗体
、
3
型胶原酶
(
Col3
)
抗体购自美
损伤因子
(KIM)-l
是一种跨膜蛋白
，
可以反映肾
国
Abeam；
荧光定量
PCR
试剂盒购自大连宝生物
。
功能的变化
，
在肾损伤中具有重要意义
“亠
。
研究
1.2
细胞培养和分组大鼠肾小管上皮细胞
显示
,KIM-1
在肾纤维化组织中表达上调
，
并且可
NRK52E
培养于含
10%
胎牛血清的
DMEM
高糖培
以用于判断肾功能的损伤情况⑹
。
本实验探讨
养液中
，
在
37^,5%
CO?
培养箱内培养
。
NRK52E
KIM-1
在
TGF-pl
诱导肾小管上皮细胞纤维化和
细胞分为
：
对照组
、
对照组
+
TGF-pl
.
阴性组
+TGF-
EMT
中的作用
。
01
、干扰组
+TGF-P1
，
对照组+TGF-R1、
阴性组
+TGF-
卩
1
、
干扰组
+TGF-P1
细胞分别用
TGF-pl
刺激
，
刺激
方法为:在细胞培养液中添加
10
ng/ml
的
TGF-pl
基金项目
：
济宁医学院青年基金项目
(
JYQ14KJ37
)
继续孵育
72
h
0
阴性组+TGF-B1、
干扰组
+
TGF-pl
第一作者:刘波
(1974-),
女
，
主治医师，
主要从事肾脏病学研究
。
细胞在
TGF-pi
刺激前
，
分别转染
siRNA
对照和