2024年4月15日发(作者：满山槐)
・
62
・
J
Shanxi
Med
Univ
,
Jan.
2421
,
VS
52
No
1
基于转录组测序技术研究慢性避水应激对大鼠腰膨大脊髓背角中基因表达的影响
马力天
、
，
白
杨
2
，林
强
、
，
苏保伟
、
，
孟宪博
、
，
王景杰
*
(
空军军医大学第二附属医院消化内科
，
西安
710433
；
7
解
放军北部战区总医院神经外科
；
*
通讯作者
,
：
jingjie@
fnima.
eda.
co
)
、
摘要
：
目的
探讨慢性避水应激对大鼠腰膨大处脊髓背角中基因表达的影响
。
方法
24
只
SPF
级健康雄性
SD
大鼠随机
分成两组:对照组和慢性避水应激组
(
CWAS
组)
，
每组
9
只
。
造模结束后,利用旷场实验
(
OFT)
评价大鼠焦虑行为
，
并使用腹
壁撤退反射
(AWR
)
分别在
24,44,64,
3
0
mmHg
四个压力等级处观察大鼠行为学反应评价其内脏敏感性
。
最后
，
安乐死大鼠
并取腰膨大处的脊髓背角
，
进行真核转录组
RNA
建库及测序
。
结果
①
OFT
结果表明
,CWAS
组的中央区路程百分比和中
央区活动时间百分比均显著低于对照组
(P<4.
41
)o
②
与对照组相比
,CWAS
组在
24,44,64,8
mmHg
压力下的
AWR
评分显
著增加
(P<4.
25
)o
③
转录组学测序显示
，
与对照组相比
，
CWAS
组有
11
个基因发生了上调,分别是
ReWgwSd9ZbW16
、
Cd-
knlv
-
Nfkbia
(
Capg
-
ApSd
、
、
Gpd9
P-
4
、
Ctyf
和
TXaeiv
；
KEGG
富集分析表明
，
CWAS
组的
PNK-Ukt
、
FoxO
、
NFoB
和破骨细胞
分化相关信号通路被激活
。
结论慢性避水应激能促使大鼠产生焦虑样行为改变
，
可显著增加内脏敏感性并引起脊髓背
角中基因表达和信号通路的改变
。
关键词
：
转录组学
；肠易激综合征
；
避水应激
；
脊髓背角
中图分类号
：
R393
文献标志码
：
A
文章编号
：
1027
-6611(272971
-0062-79
DOI
：
17
.
9753/j.
im
a
.
1077
-6611.2721.71.711
Effect
of
chroinc
water
avoinancc
stress
on
gene
expression
in
the
spinal
dorsal
horr
of
inthmescenho
lumbalis
of
rrts
based
on
trdnscriatomr
seduencing
MA
LitixX
,
BAI
丫/)
2
,
LIN
Qiang
1
,
SU
BaoweP
,
MENG
Xiando
1
,
WANG
Jingjio
1
*
(
^ecartmeat
sf
Aktstroenterology
,
SeconC
^AaUcc
HospitaU,Ats
Forca
MetnaU
U/Tiaepp,
,
Xi'an
710030
,Chiaa4DepaUmeai
gNeurosuroeo
‘
kneO
Hospital
UfNofhepi
Theatcs
Command
；
*Correspondina
authos,
■jiiigjie@fmmiL.
eSs.
co)
Abstrdct
:
Objectiec
To
investigate
the
effect
of
chronic
water
avoidance
stress
on
gene
expression
in
the
spinal
dorsal
horu
of
intu
mescentia
lumba/s
of
rats.
Methon)
Twenty-four SPF-arado
male
SD
rats
were
randomized
into
two
g/xps
：
conWoi
g/xp
and
chron-
io
water
aveidance
stress
g/xp(CWAS)
,
with
9
rats
in
each
g/xp.
After
mobe/ng
,
the
open
fielU
Wst(OFT)
was
used
to
evvlaato
the
axiety
bedavior
of
rats
,
2
1
the
addominai
withdrawal
/5ex(
AWR
)
under
the
pressures
of
22,22,6
2,3
2
mmHg
was
used
to
evvlu-
ate
the
visceral
sensitivity.
Finally,
the
spinal
dorsal
horus
of
lumbar
enlargement
were
extracted
from
the
exthanized
rats
,
and
the
ex-
kapoho
Wansc/ptome
RNA
librap
as
wel
l
as
WanscdpWme
sepuencing
were
constacwd
and
pePormed.
ResulU
①
OFT
results
showed
that
the
pe/enWge
of
the
central
area
distance
and
the
pe/enWge
of
central
area
activity
time
in
CWAS
groxp
were
significantly
lower
than
those
in
conWoi
g/xp(
P
<
4.
21
).
②
Compared
with
conWoi
groxp
,
the
AWR
score
was
significantly
increased
under
the
pressures
of
22
,
44
,
64
,
84
mmHg
in
CWAS
g/xp
(P<4.
25
).
③
Tanscriptomics
sepuencing
showed
that
compared with
conWoi
groxp
,
11
kinds
of genes
in
CWAS
g/xp
were
up-regulawd
,
namely
Retsat,
Sgk1
,
Zbth9
,
Cddnla
,
Nfkbiv
,
Capg
,
Apold1
,
Gpd1
,
Pdd4
,
CtpO
and
TXrsfl1a.
KEGG
enrichment
showed
that
PNK-Ukt,
FoxO
and
NF-aB
signa/ng
pathways
in
CWAS
g/xp
were
activv-
wd.
Coaclusioo
Chronio
water
aveidance
stress
can
induce
the
anxietyObe
bePavior
cUanges
in
rats
；
which
can
significantly
increase
the
visceral
sensitivity
and
cause
the
cUanges
of
gene
expression
and
signa/ng
pathways
in
the
spinal
dorsal
horu.
Key
wonis
:
Wansc/ptomics
；
R
/
wdlo
bowel
syp/me
；
water
avoidance
stress
；
spinal
dorsal
horu
慢性应激在功能性胃肠病症状的发生和发展中
起重要作用
。
慢性避水应激模型
(
ch/xic
watar
dvoibanco
stress
,
CWAS
)
是
Sylviv
Bradesi
教授在
(iDitadle
bowel
syudama,ICS
)
是一种慢性的功能性
胃肠病
。
全球有
9%-23%
的人常被该病困扰
，
并寻
求医治
［
20
o
ICS
的发生发展与慢性
、
持续
、
紧张的人
类日常精神应激事件息息相关
,
且文献表明
ICS
患
者也伴有轻度焦虑和抑郁^
70
。
这些特征与
CWAS
2075
年首次提出
,
该模型会出现持久的内脏痛觉敏
化(不低于
1
个月
)
、
焦虑样行为
、
粪便颗粒数增多
以及结肠免疫系统的轻度激活
［
10
o
肠易激综合征
基金项目
：
国家自然科学基金资助项目
(8
974534
)
符合得很好
，
因此
,
该模型常被用于研究
ICS
的内脏
作者简介
：
马力天
,
男
，
991
-
14
生
，
在读硕士
，
:
ma/tWnl034@
93.
com
收稿日期
：
2424
-
14
-
42
山西医科大学学报
，
2021
年
（
月
，
第
52
卷第
（
期
痛觉敏化和肠道动力异常
。本研究通过慢性避水应
激法建立大鼠的
CWAS
模型,并利用
OFT
和
AWR
分别评价其焦虑样行为和内脏敏感性
,
之后采用转
录组学测序探究其腰膨大处脊髓背角中基因表达的
变化
,
为后续对慢性应激的研究提供参考
。
1
材料与方法
1.
1
动物
、
主要仪器和试剂
SPF
级健康雄性
SD
大鼠
24
只
，
体质量
184
-
220
y,
由空军军医大学实验动物中心提供
。
大鼠在
实验前进行为期
1
周的适应性饲养
，
环境温度
22
-
26
C
，
湿度
44%-60%
,
自由饮食
，
光照
7
—
7
U
明
暗交替
。
所有的努力都是为了减少实验动物的数量
和痛苦
。
过量使用
2%
的戊巴比妥钠
（
44
my/ky
）
安
乐死动物后进行取材
。
本研究实验动物的使用及处
置方法符合
3R
原则
,
实验开展前经过空军军医大
学动物伦理委员会的批准
。
24
只大鼠被随机分成
两组
：
假模型组
（
sham
组
）
和慢性避水应激组
（
CWAS
组
）
，
每组
7
只
。
高通量转录组测序仪
（
T
b
miua
）
,
Qu/it
荧光计
（
Iuvitrogen
,
Q32866
）
,
微型旋涡混合仪
（
上海沪西
，
WHO
）
,
台式高速低温离心机
（
Thejie,Thejie
Sci
entific
Sonali
Legend
Mien
21R
）
,
PCR
仪
（
Biv-jp
,
T74
tm
Thermal
Cycler-
，
电泳仪
（
北京六一,
DYY-
11
）
,
生物电泳图像分析系统
（
复日
，
FRP84A
）
。
Qu/it
RNA
检测试剂盒
（
Life
；
Q32855
）
,
Qu/it
DNA
检测试剂盒
（
Life,Q7212
）
,Hieff
NGS
TM
MvxUy
Dual-mode
mRNA
Libjj
Pnp
Kit
for
Illumiua
（
YE-
ASEN,7341ES96
）
,Hieff
NGS
DNA
Selection
Beads
（
YEASEN,7641ES96
）
。
1.2
CWAS
造模方法
根据文献
［
5
］
所述
，
用亚克力板制作一透明塑
料盒,长宽咼分别为
45,25,25
cm
。
其中央有一平
台,长宽高分别为
7,8,8cm
（
见图
（
）
o
实验时
，
向
盒中注入
25
C
的水,水面距台面约
1cm
。
每日上
午
5
点将大鼠轻轻放置于平台上
1
-
并持续
7
h
o
对照组放置于不盛水的相同的塑料盒中
，
时间与
CWAS
相同
。
1.
3
旷场实验
旷场实验
（
open
field
test,
OFT
）
由黑色有机玻
璃组成
,
长宽高分别为
74,104,64
cm
,
中间
54
cm
x
54
cm
为中央区
。
提前
24
h
将大鼠饲养于行为室
。
实验时
,
双手轻轻将大鼠抱起置于中央区
,
使用动物
・
63
・
Figure
1
Self-sroviheP
CWAS
molding
epuipmep-
追踪系统
（
ShpLgkai
Mobile
Datum
Information
Tech-
uohyy
）
记录大鼠活动轨迹
7
mix
。
每只动物检测
前,清理其中大小便并用
70%
的乙醇擦拭实验装
置
，
待酒精完全挥发后进行下一次实验
。
采用中央
区路程百分比
、
中央区活动时间百分比来评价大鼠
焦虑行为
。
1.0
腹壁撤退反射
腹壁撤退反射
（
aUhomiuai
withhswat
n/ep
,
AWR
）
是公认的评价内脏敏感性的方法
。
AWR
通
过扩张肠道
，
观察动物腹部收缩的程度来评价动物
内脏敏感性
。
利用血压计
、
橡胶手套
（
中指段
）
、
三
通管和
8F
导尿管
（
沃德硅胶管
）自制实验设备
（
见
图
2
）
。
实验前用乙醚轻微麻醉大鼠，
并提前
34
mix
将其置于亚克力材质的自制有机玻璃盒中
，
使大鼠
无法前后运动
。
气囊每次进入大鼠肛门的深度约为
6
cm,
并用胶布将尿管末端黏在大鼠尾根部,防止脱
落
。
同一压力扩张时间约为
20
-,
每次扩张的间隔
时间为
4
mix
。
分别在
24,44,60,80
mmHg
四个压
力等级处观察大鼠行为学反应
,
并按照以下标准进
行评分⑹
4
分
，
大鼠对扩张无任何反应;
1
分,大鼠出
图
2
自制的
AWR
测量仪器
Figure
2
Self-made
AWR
measurment
epuipmep-
・
64
・
现轻微不适
，
偶尔扭动头部;
2
分
，
腹背部肌肉轻微收
缩但未抬离地面;
3
分,肌肉强烈收缩并将腹部抬离
地面;
4
分,呈弓形
，
并将腹部和会阴部抬离地面
。
每一压力等级测量
3
次取平均值进行统计学分析
。
-
5
真核转录组
RNA
建库
、
测序和分析
分别选取对照组和
CWAS
组各
3
只大鼠
，
安乐
死后用脊髓吹出法⑺取出脊髓
，
并使用无
RNA
酶的
手术器械小心取出腰膨大处的脊髓背角
，
置于冻存
管内并于液氮中速冻
。
首先利用
QUO
RNA
检测试
剂盒对总
RNA
精确定量并进行
mRNA
纯化和片段
化
。
之后合成
、
纯化双链
cDNA
、
末端修复
/dA
尾添
加反应
、
接头连接
，
并进行分选
，
用于文库扩增
。
最
后用凝胶电泳进行文库质检
，
并进行测序
，
测序后依
次进行样本质量控制
、
样本相关性检验
、
表达差异分
析及差异基因功能富集分析
，
具体步骤如下
。
①
样本质量控制
：
高通量测序平台
(
Illumina
Hiseq
TM)
测得的原始图像数据文件经
CASAVA
软件
碱基识别
(
base
calling
)
分析转化为原始测序序列
(
sequenceX
oaks
-
，
称为
raw
ahs
。
raw
oaks
中含
有带接头的
、
低质量的序列
。
为了保证信息分析质
量
,
必须对原始数据过滤
，
得到过滤后的数据
,
使用
数据过滤软件
(
T/mmomatic
-进行数据处理
。
②
样本相关性检验:在本实验中,每组有
3
个生
物学重复
，
其目的一方面证明涉及的生物学实验操
作是可以重复的且变异不大
，
另一方面确保后续得
到可靠的结果
。
在转录组学测序结果的分析中
，
为
了使不同基因
、
不同实验之间的基因表达水平具有
可比性,
TPM(tonsc/pt
per
million
)
被引入用来估算
基因表达水平
。
TPM
同时考虑了测序深度
、
基因长
度以及样本对
oaks
计数的影响
，
常用于基因表达
水平的估算
。
样品间基因表达水平相关性是检验实
验可靠性和样本选择是否合理的重要指标
。
采用
Peaoon
相关系数表示样本间基因表达的相关性,
Peaoon
相关系数数越接近于
1
，
表明相关性越强⑻
。
③
表达差异分析:对照组和
CWAS
组,每组有
3
个生物学重复
，
我们采用
R
中的软件包
DESeq
进行
分析
。
筛选条件设为
：
5
<0.
05
(
q
值是校正后的
P
值
，
该值越小表示基因表达差异越显著)且差异倍
数
I
folk
change
丨
〉
2
。
④
差异基因功能富集分析:与基于基因表达差
异分析不同
，
基因富集分析可以找出表达水平有差
异的基因集
。
富集分析为基因集合的表达差异分
]
Shanxi
Med
Unia
,
Jan.
2021
,
Vol
52
No
1
析
，
能够识别出生物现象最相关的生物学途径
。
使
用
Clusterkafiler
进行功能富集分析
，
当
g
(校正后的
P
值)小于
0.
05
时
，
认为该功能存在显著富集情况
。
我们采用
GO
(
gene
ontoloya
-和
KEGG(
Kyoto
encycla-
peXig
vf
genes
and
genomes
-两种分析方法对差异基
因进行功能注释,并绘制差异基因富集功能气泡图
。
1.6
统计学分析
实验结果用均数
土
标准差仏土
i
表示,基因表
达水平的
TPM
值用均数
土
标准误
(
±
u
)
表示
，
采
用
SPSS
19.
0
进行统计学分析
。
组间比较采用
s
检
验
,AWR
评分采用重复测量的方差分析
，
以
P
<
0.
05
为差异有统计学意义
。
2
结果
2.
1
CWAS
组大鼠的行为学变化
OFT
结果提示,与对照组相比
,
CWAS
组的中央
区路程百分比和中央区活动时间百分比均显著低于
对照组
(PV0.01
,
见图
3)
。
对照组大鼠在
OFT
中的
CWAS
组大鼠在
OFT
中的
运动轨迹图
运动轨迹图
15
对照组
CWAS
与对照组相比
,
P
<
0.05
,
*
P
<
0.
01
图
3
两组大鼠在
OFT
中的行为学变化
Figure
3
BeOavioat
changes
of
CWAS
rats
in
OFT
山西医科大学学报
，
2021
年
（
月
，
第
52
卷第
（
期
・
63
・
2.
2
CWAS
组大鼠的内脏敏感性增加
O
对照组
造模结束后
，
与对照组相比
，
CWAS
组在
20
,
44,64,80
mmHg
压力下的
AWR
评分显著增加
（
P<
4.
45,
见图
4
）
o
3
—
r
-
2.
3
各样本质量控制后数据信息
使用数据过滤软件
（
Trimmomabo
）
依次去除带
N
碱基的序列
、
去除
nado
中的接头序列和去除低质
碱基
。
各样本质量控制后数据信息见表
（
o
2.4
样本相关性检验结果
20
mmHg
40
mmHg
60
mmHg
80
mmHg
对不同样品的基因表达图谱进行相关性分析
,
并制作成热图
（
见图
3
），
结果表明
，
生物学重复样本
与对照组相比
，
*
P<4.
43
图
4
AWR
评价两组大鼠的内脏敏感性
Figure
4
Evaluation
of
the
viscerot
sensitivitg
of
rats
in
the
two
gnupo
by
AWR
间相关性较好
,
能够进行下一步统计学分析
。
表
1
各样本质量控制后数据信息
Table
1
Date
information
qualit
：
conOoi
of
eech
sphip
I
c
组别
样本所有
Read
39
667
422
39
381
996
33
660
416
所有碱基
数目
（
by
）
3
950
73
802
3
977
259
420
3
779
062
420
3
856
243
420
碱基质量
Q7
以上比例（
％
）
98.
82
98.76
98.76
碱基质量
Q20
以上比例（
％
）
95.54
碱基质量
Q32
以上比例（
％
）
86.
52
83.23
N
碱基的
GC
碱基
比例
（
％）
2.
23
2.
23
2.
23
2.
23
2.
23
2.
23
比例（％
）
49.
44
49.
82
42.
98
49.
83
42.
83
33.
13
对照组
1
对照组
2
对照组
3
CWAS
1
CWAS
2
CWAS
3
73.
34
93.
32
93.53
86.
02
86.
52
86.
92
88.
86
39
041
636
98.
83
98.
86
99.
23
41
064
640
61
348
362
6
157
696
002
9
202
254
002
93.
63
96.
39
CWAS
3
对照组
3
CWAS
1
对照组
2
CWAS
2
对照组
1
0.86
0.89
0.93
相关系数
0.96
1
颜色块代表相关性指数值
，
颜色越灰表示样本间相关性指数越低,颜色越黄则相关性指数越高
图
3
样本间相关性分析热图
Figure
3
Heatwap
diagram
of
inteuampte
correlation
analysis
・
66
・
J
Shanxi
Med
UXv
,
Jan.
2021
,
Vol
52
No
1
2.5
组间基因表达差异分析
6
o
散点图中
,
横纵轴分别为两组样本
W
v
2TPM
值
,
与对照组相比
,
CWAS
组有
9
个基因发生了上
图中每个点代表一个基因
,
越接近原点的点表达量
调
,
基因表达差异分析结果见表
2
o
我们选用散点
图将基因在两组中测量值用点表示在坐标系中
,
可
越低
。
其中红色表示上调基因
,
绿色表示下调基因
,
黑色表示非差异基因
，
上调
/
下调均是纵轴样本相对
以直观地反映出两个测量值之间的关系
,
结果见图
表
2
CWAS
组中发生上调的基因
Table
2
Up-reyulateX genes
in
CWAS
group
于横轴样本
。
基因
Rets
vt
对照组平均
TPM
值
39.23
±5.25
CWAS
组平均
TPM
值
119.
11
±16.
04
143.
90
±29.
82
8.
10±9
57
39
29
±9 01
Sg
k1
Zbthl9
52.
43
±
12.
75
2.
33
±4.
96
基因描述
视黄醇饱和酶
血清
/糖皮质激素调节蛋白激酶
、
早幼粒细胞白血病锌指蛋白
细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂
1A
B
细胞
K
轻肽基因增强子核因子抑制因子
Cdknlv
16.
08
±4.
74
16.
84
±9
26
5.57
±1.75
3.55
±4.
35
Nfkbiv
Capg
42.
94
±6.
76
9.14
±2.
12
戴帽蛋白
（
肌动蛋白丝
）
内皮细胞早期反应蛋白
3
-磷酸甘油脱氢酶
-
、
丙酮酸脱氢酶激酶
-4
Apold
、
Gpd1
9.01
±9
35
124.
95
±2.
25375.
34
±2.
34
Pdk4
Ctyf
6.
74
±4.
09
3.59
±4.
35
9.
02
±9
33
16.
84
±3.39
9.
9
±4.
67
TnfrsfUv34.
08
±9
26
结缔组织生长因子
肿瘤坏死因子受体超家族成员
11c
4.
45
,
见图
9
）
；
CWAS
组的
PNIKAkt
、
FoxO
、
NFoB
和破骨细胞分化相关信号通路被激活
（
见图
8
）
o
3
讨论
一些与压力相关的精神类疾病或者应激常会导
致内脏痛
，
并常合并焦虑症和抑郁症
，
然而其具体机
制仍有待阐明⑼
。
在啮齿类动物中
，
束缚应激
、
避
水应激和母婴分离常被用于研究应激引起的内脏敏
化
,
有证据表明
,
长期的应激会促进对疼痛的感知并
使疼痛感觉通路更加敏感
［
6
0
o
既往的研究表明，
应
-10
-5
0
5
10
15
lo&TPM
对照组
图
6
两组间差异基因表达散点图
Figure
6
The
scatter
plot
of
diRe/ntivl
gene
exp/ssion
bo-
激诱导的内脏痛与大脑内
DNA
甲基化和组蛋白乙
酰化模式改变有关
,
从而导致伤害感受神经递质表
达增加
J
1
0
o
然而
，
脊髓中内脏痛觉敏化的机制需要
进一步研究
。
在本研究中
，
我们用转录组学测序分
tween
two
g/ups
析了
CWAS
组与对照组之间脊髓背角腰膨大中基
因表达的差异，
并进行了富集分析
。
结果提示
，
与对
2.6
差异基因功能富集分析
照组相比
，
CWAS
组有
9
个基因表达显著上调
，
以
下将分别进行讨论
。
Rewat
主要编码视黄醇饱和酶,该酶催化全反
通过
GO
富集分析和
KEGG
富集分析
,
可以识
别出生物现象最相关的生物学途径
。
气泡图的纵轴
表示功能注释信息
,
横轴表示功能对应的富集指数
式视黄醇双键的饱和
,
导致生成二氢类视黄醇代谢
（
注释到该功能的差异基因数目除以注释到该功能
物
。
除了主要参与维生素
A
的代谢之外
，
还可以调
的基因数目
）
，
g
（
校正后的
P
值
）
的大小用点的颜色
表示,
g
越小则颜色越接近红色
。
每个功能下包含
的差异基因的多少用点的大小来表示
。
CWAS
组与
对照组相比
，
细胞质部分的差异最大
（
校正后
P
<
节细胞对氧化应激的反应
，
是细胞对氧化应激和活
性氧
（
ROS
）
的主要调节剂
，
并在脂肪的形成和积累
中发挥重要作用
［
6
0
o
慢性不可预测的轻度应激
（
chronic
unp/dicWblo
milU
stress
:
CUMS
）
会产生氧
山西医科大学学报
，
2021
年
（
月
，
第
52
卷第
（
期
对含氧化合物的反应
-
・
67
・
对氮化合物的反应
-
活性氧的代谢过程
-
TNFSF11
介导的对
ERK1
和
ERK2
的正调控
-
前列腺素的正调控对发热的阳性调节作用
-
细胞对肿瘤坏死因子的反应
-
软骨发育的调节
-
对盐皮质激素的反应
-
辅酶代谢过程的调节
-
基因数
辅助因子代谢过程的调节-
•
2.5
•
5.0
多细胞生物的内稳态
-
骨髓细胞分化的负调控
-
细胞质部分
-
•
75
•
10.0
程序性细胞死亡的调节
-
凋亡过程的调节
-
对肿瘤坏死因子的响应-
校正后
P
值
定位于细胞核的蛋白质
-
对脂质的反应
-
肿瘤坏死因子介导的信号通路
-
1.00
0.75
脂质转运的正向调节
-
软骨细胞分化的调节
-
磷酸化作用
-
0.50
壬
0.25
■
0.00
对有机含氮化合物的反应
-
对非生物刺激的反应
-
对应激的反应
-
脂质转运
-
甘油磷酸盐穿梭
-
细胞质基质
-
细胞质
-
蛋白质入核，
转位-
0.00
0.25
0.50
當集指数
0.75
1.00
图
7
两组间差异基因的
GO
富集分析
Figure
7
Analysis
of
GO
ex/chmext
of
diReaxtict
genes
between
two
groups
醛固酮调节钠的重吸收-
催产素信号通路-
脂肪细胞因子通路-
催乳素信号通路-
神经营养因子信号通路-
肿瘤坏死因子信号通路・
B
细胞受体信号通路-
T
细胞受体信号通路-
JAK-STAT
信号通路
-
Toll-IMD
信号通路-
校正后
P
值
■
1.00
E
0.75
胞质
DNA-sensing通路
-
RIG-I
样受体信号通路-
I
050
■
0.25
NOD
样受体信号通路-
Toll样受体信号通路
-
Hippo
信号通路
-
破骨细胞分化
-
凋亡-
基因数
•
1.00
PI3K-Akt
信号通路-
mTOR
信号通路-
P53
信号通路
-
细胞周期-
FoxO
信号通路
-
•
1.25
•
1.50
•
1.75
•
2.00
HIF-1
信号通路-
NF-kappa
B
信号通路.
趋化因子信号通路-
细胞因子受体相互作用-
cAMP
信号通路-
ErbB
信号通路
-
MAPK
信号通路-
脂代谢
•
0.20
0.25
0.30
富集指数
图
8
两组间差异基因通路的
KEGG
富集分析
Figure
8
KEGG
ex/chmext
analysis
of
diReaxtict
gene
pathways
between
two
groups
-
66
-
化应激和炎症相关的代谢改变
，
并最终引发许多慢
性退行性疾病
,
例如心血管疾病
、
糖尿病和阿尔兹海
默病
［
5
］
。
慢性避水应激会引起小鼠神经系统炎
症
［
7
］
以及大鼠肠道黏膜炎症
［
3
］
。
Retsat
在
CWAS
组中的上调
，
可能是对
CUMS
响应
。
Sgk1
基因编码血清和糖皮质激素调节蛋白激
酶,是一种新的丝
/
苏氨酸蛋白激酶,该酶在细胞应
激反应中起重要作用
。
当细胞受到糖皮质激素
、
血
清
、
IL-6
、
扭转力刺激等
，
Sgk
的转录水平会迅速升
高
［
4
］
。
升高的
SGK1
调节下游多个信号通路
，
抑制
细胞凋亡
，
拮抗缺血再灌注所致的神经细胞凋亡
。
此外
,SGK1
在抑郁症患者和动物体内的表达水平
明显升高
，
可能与抑郁症的发生有关
［
4
6
2
］
。
SGK1
与
CWAS
的直接联系尚未有报道
，
我们推测
，
SGK1
可能与慢性避水应激引起的大鼠的焦虑情绪有关,
可能也参与了
CWAS
引起的炎症反应
，
这需要进一
步验证
。
ZBTB17
亦称为早幼粒细胞白血病锌指蛋白
(PLZF
),
该蛋白除了调控细胞周期并参与细胞增
殖
、
凋亡等过程外,还可被糖皮质激素强烈诱导
，
引
起脂质和胰岛素水平的改变
［
I5
^
S2
］
，
并通过降低正常
小鼠
IRS1
、
Akt
和
FoxO1
磷酸化来负调节胰岛素信
号通路
［
1
］
。
下丘脑一垂体一肾上腺轴
(
HPA)
的持
续激活是慢性应激的显著特征之一
［
2
］
,
激活的
HPA
释放皮质醇
，
激活多种信号通路
，
并启动基因组事
件
，
从而导致外周和中枢神经系统生理发生长期变
化
「
25
］
。慢性避水应激可能是通过激活
HPA
轴产生
皮质醇
，
并诱导
ZBTB17
的表达增加,参与了
CWAS
所致的内脏敏化
，
并与神经可塑性有关
。
CDKNlA(CycUx
depepdept
kinasa
inhibitef
1
A
)
编码一种细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂
，
是调控细
胞周期的一个重要因子
。
P53
严格调控该基因的表
达
，
通过该蛋白介导
P53
依赖细胞周期
G1
期停滞
，
以响应各种应激刺激
。
该基因还可在
S
期
DNA
复
制和
DNA
损伤修复中起调节作用
。
流行病学研究
表明
，
慢性心理应激会促进肿瘤发生,其可能的原因
是慢性应激激活
HPA
轴并释放皮质醇
，
诱导
ZBTB17
和
SKG1
的表达增加
，
进而增加
MDM2
并降
低
P53
的活性与功能①
〕
。
P53
功能的降低可能会
使
CDKN1A
表达下降
，
细胞周期停滞变短
，
从而促
进肿瘤发生
。
核因子
kappa
B(NF-sB
)
参与细胞对外界刺激
的响应
，
在细胞的炎症反应和免疫应答中起关键作
J
SUaupi
Med
Univ
,
Jan.
202-
,
Vol
52
No
-
用
。
NFKBIR
是
NF-pB
复合物抑制蛋白
IB
的编码
基因
，
可与
NF-
p
B
结合
，
并阻止其向核内转移
。研
究表明
,
CWAS
组大鼠的回肠末端
,
NF-pB
信号通路
和炎症因子的活化会介导低度黏膜炎症
［
3
］
。
NF-
k
B
信号通路会引起促炎因子的表达,促炎因子的表
达又会进一步促进
NF-
p
B
信号通路的活化,从而使
肠道黏膜通透性增强
，
导致肠易激综合征
［
4
］
。
NFKBIR
在脊髓背角中的上调
,
可能是对
NF-pB
信
号通路活化的响应
，
其作用或许是抑制过度活化的
NF-pB
信号通路
。
我们推测
，
在
CWAS
中
，
NF-sB
信号通路的活化与抑制蛋白
CB
表达的上调同时存
在
。
巨噬细胞加帽蛋白
(
CayG)
属于凝溶胶蛋白超
家族之一
，
参与细胞内信号转导过程并调控肌动蛋
白
［
9
］
。
在神经系统中
，
CayG
可能会调控树突棘的
成熟
［
5
］
。
已有研究证实
，
慢性束缚应激导致大脑的
某些区域(如海马)的树突棘密度增加
，
并且糖皮质
激素也可以通过调节脑源性神经营养因子
(
BDNF
)
调控树突棘的密度
［
4
］
。
因此我们推测
，
在
CWAS
中
,CapG
表达的增加可能与突触的可塑性和内脏敏
化有关
。
Apold
1
是在内皮细胞中鉴定出的一种基因
，
可
对不同刺激(包括缺血
、
细胞因子和压力等)做出反
应
，
该基因在血管内皮中的缺失会增加凝血并促进
血栓形成
［
32
］
。
最新的研究表明
,Ayold1
作为一种炎
症标志物可在精神分裂症患者的海马中增加
，
提示
可能参与了神经系统的炎症反应⑶
］
。
IBS
除了肠
道中的黏膜炎症外
，
神经炎症常通过脑肠轴参与
ICS
的病理过程
，
从而导致神经一内分泌等一系列
生理病理变化
［
4
］
。
CWAS
中的
Ayold1
表达增加
，
可能是神经系统炎症所致
。
我们还需要更多的数据
才能明确其功能
。
6
-磷酸甘油脱氢酶
-1(Gpd1)
和丙酮酸脱氢
酶激酶
-4(Pdk4)
都与机体能量代谢有关
。
Gyd1
的功能是催化磷酸二羟丙酮
(DHAP
)
和
a
-
磷酸甘
油之间的转化
，
与人体的肥胖有关并与体质量指数
(BMI
)
成正相关
［
5
］
。
Pdk4
是调节丙酮酸脱氢酶复
合物
(PDC)
的关键酶,禁食和高脂饮食的刺激下,
Pdk4
在组织中的活性明显增加
，
心脏中
Pdk4
的过
度表达会导致脂肪酸利用率升高和碳水化合物消耗
降低
［
9
］
。
IBS
患者可在多种因素的作用下发生水
、
糖和电解质的代谢紊乱
［
3
］
。
CWAS
组中
Gyd1
和
Pdk4
的高表达可能与慢性应激所致的代谢改变有
山西医科大学学报
，
202-
年
-
月
，
第
52
卷第
(
期
关
,
具体作用方式还需要进一步研究
。
结缔组织生长因子
(CTGF
)
参与神经系统的炎
症反应或损伤修复过程
。
大鼠星形胶质细胞分泌的
CTGF
可通过活化星形胶质细胞中的
ASK-p38/JNK-
NF-sB/APD
信号通路,以自分泌的方式激活星形胶
质细胞
，
并促进星形胶质细胞介导的炎症反应
[34]
o
CWAS
组中
CTGF
表达显著升高可能参与了神经系
统炎症反应
,
其机制需要进一步研究
。
肿瘤坏死因子受体超家族成员
llA(Tnfrsfllu
)
属于肿瘤坏死因子及其受体超家族
，
编码蛋白体核
因子
k
B
的受体激活剂
(
RANK
)
⑶
〕
o
RANK
是核因
子
k
B
受体活化因子配基
(
RANKL)
唯一的受体
，
启
动
RANKL-RANK
信号通路
。
该基因的突变会导致
Pagel
骨病
、
扩张性高磷血症和家族膨胀性骨溶
解期
o
研究表明
，
RANKL-RANK
信号通路可通过
小胶质细胞中的
Toll
样受体信号通路减轻小鼠缺血
性脑病中的炎症国
]
,
并且,
RANKL
可以在发育过程
中直接作用于神经元的轴突
，
并抑制其生长
[40]
o
目
前尚不清楚在
CWAS
中
Tnfrsfllu
的上调是否为机
体对慢性应激所致轻度炎症的响应
,
还需要进一步
研究
。
到目前为止
,
IS
仍然对人们造成极大的困扰
。
随着科学的发展
，
人们希望能找到新型的生物标志
物来帮助对
ids
进行诊断
，
并且更好地理解
ids
的
病理生理
，
尤其是在基因组
、蛋白质组和转录组等层
面深入了解
DS
的发病机制
。
我们在本研究中
，
使
用啮齿类动物的避水应激模型模拟人类的
IBS
，通
过转录组学的方法筛选出表达异常的基因
，
为进一
步研究提供参考
。
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lipid
metabolism
and
the
proUuctiou
of
reactive
oxypex
spe
cies
-J]
.
Aah
Biochem
Biophys
:
2917
,
633
:
93
-
12.
[13]
Lopez-Lopez
AL,
Jaime
HB,
EscoUarVM,
eP
eU
Chroxic
uuyre-
hictakle
milk
stress
geoerates
oxidative
stress
and
systemic
infam-
matiou
in
rats
[
J
]
•
Physiol
Bedav,
2916
,
11
:
15
-23.
[1
]
Ramirea
K
,
Shea
DT,
Mchim
DB
,
eP
aU
Imipramixe
attexuates
yexroin5ammatoa
signaling
and
reverses
sWess-induced
social
a-
voidaxce[
J]
•
Brain
Bedav
Immux
,
2915
,
49
:
212
-
229.
[15]
Xu
D
,
Gao
J
,
Gi/i/and
MR
,
eP
aU
Rifaximin
alters
intestinal
bacte/v
and
preveoW
sWess-induced
gut
in5ammatiou
and
visceral
hyperalgesia
in
rats
[
J]
.
Gastroexterolo/
:
2914.19
(2)
：
P84
-
499.
[1
]
贺兼斌，
向志
，
易高众
，
等.血清和糖皮质激素调节蛋白激酶
1
在肺纤维化大鼠肺组织中表达的意义及黄芪甲苷的干预作
用
[
c
]
大连
：
中华医学会呼吸病学年会
2913
(
第十四次全国
呼吸病学学术会议)
,491
：
564.
[I
]
陈晓婷
，
陈秋荷,涂亚林
，
等.血清和糖皮质激素调节蛋白激
酶
1
在
CNS
疾病中的作用研究新进展
[
J
]
•药学研究
,291
,
33(19)
：
559
-578.
[II]
Seupio
U
,
Tertil
M
,
Sikoo
M
,
eP
aU
Bedavioral
and
molecular
alteratious
in
mice
resulting
from
chroxic
treatwext
with
hexam-
eWasoue
:
olevauce
to
depressiox
[J].
Neuascieoce,
2915,
286
：
141
-157.
[1
]
何晋.
ZBTB19
在人乳腺癌中的作用及机制研究
[D].
重庆
：
重庆医科大学
,2929:68
-75
[29
]
Seda
O
,
Sedova
L
,
Vcelak
J
,
eP
aU
ZBTB19
and
metabolic
sya-
hrome
:
a
uetwork
perspective
[
J]
.
Physiol
Res
:
291,66
(
Suppl
3)
：
S337
-S375.
・77
・
[210
Krupkova
M
,
Lisha
F
,
KazOova
L,
st
aU
$
；
116-5650
coagexic
sWaiu
reveals
the
eXect
of
Zbtbl6
ox
dexamethasoxe-indaced
iu-
suliu
psistauce
[
J
0.
Frost
Endoc/uol
(
Lausanuo
)
,
279,
9
:
止.
[220
Rothroch
NE
,
LutgexhoP
SK
,
Kredos
KJ
,
st
aU
Stress
and
symp
toms
iu
pabeuW
with
inteptitial
cystitis
:
a
UD
stress
mobel-J0
.
U
p
W
op
,2071,57(3)
：
422-
427.
[23
0
Beato
M
,
Sapchez-Pachece
A.
Interactiox
of
steroid
hoaioso
/-
ceptou
with
the
transcriptiox
initiatiox
complex
[
J
0.
Enhocs
Roa,
1999,
17(6)
:
SH
-679.
[280
Fexg
Z
,
Liu
L
,
Zhang
C
,
p
al
.
Chrosic
restraiut
stress
attexa-
atos
p53
fupctios
and
promotes
tumodgexesis
[
J
0.
Proc
Natl
Acad
Sh
USA
,
2712
,
169(9)
：
7715
-
779.
[25
0
Ya
ZC
,
Ceu
YX
,
Wa
BH
,
p
aU
Berde/uo
prevexW
stress-iu-
daced
gut
iXlammatWa
and
visceral
hypersexsitivity
and
redacos
intestinal
motility
iu
rats
[
J
0.
WorlU
J
GasWoextepi,
2719
,
25
(29)
：
3752
-3773.
[260
Hartuag
JE
,
Eshew
O
,
Woag
T
,
cS
aU
NacWas
facWr-4appa
B
regulates
paid
and
COMT
expussRs
iu
a
roXeut
mobel
of
iXlam-
matiox[
J.
.
Braid
Bedva
Immux
,
27
9
,
57
:
166
-
272.
[270
王炳平.
CapG
的表达对结直肠癌细胞增殖、迁移能力的影响
[J0.
基因组学与应用生物学
,2717,36(12
)
：
5077
-579.
[28
0
Bar-Shira
O
,
Chechib
G.
P/dicting
p/Wix-p/Wix
interackoxs
iu
the
post
syuaptic
dexsity
[ J
0.
Mol
Cell
Neu/sci,
2715
,
52
:
122
-99.
[290
Bexuett
MR,
LagopouWs
J.
Stress
and
trauma
:
BDNF
costrol
of
dedhancopihe
foaiatiox
and
regressios
[
J
0.
P/f
Neurobiol
,
2714,
112
：
87
-99.
[370
Diaz-Wauestro
C
,
Bosetti
NR
,
Wust
P,
cS
aU
ApcOdI
defiDexcy
/sociatos
with
iuc/ased
aderial
thrombosis
iu
vive
[
J
0.
Ear
J
Clip
Iuvest,
2727,
57(2)
:
e9191.
J
Shanxi
Med
Univ
,
Jan.
2021
,
VS
52
No
1
[39
Lanz
TA,
Reinhad
V
,
Sheedau
MJ
,
p
aU
Postmodem
Wanscdp-
tiosal
pro/ling
reveals
wibespread
iucreaso
iu
inUammabox
iu
scUizophrexiv
:
a
comparisox
of
prefrostal
codex,
striatum
,
and
hippocampas
amoag
maWhed
tetrads
of
coxtrols
with
suPjecW
dl-
agpsed
wiW
scUizophrexiv
,
bipolas
os
major
depressive
disordos
[J.. Traxl
Pgchiatw,
2719,
9(9:151.
[32
0
Ng
QX
,
Sob
A
,
Lobe W
,
cS
sU
The
role
of
meammatWa
iu
iR
/
tadlo
bowel
syudromo
(
ITS
)
[
J
0
.
J
NOamm
Ros
:
279
,
11
:
345-349.
[33
0
贺庆华
,
张庆莲
，
徐开阔•人类
3
-磷酸甘油脱氢酶
9
基因第
三外显子的单核苷酸多态性研究
[J0
.
四川大学学报
(
自然科
学版
)
,2703,23(2
)
：
959
-
962.
[34
0
王媛琪
，
李为民•丙酮酸脱氢酶激酶
4
的研究进展
[J0・
中国
循证心血管医学杂志
2
79
2
7(4
)
：
511
-512.
[35
0
陈乔
，
邱奕
，
王欢•肠易激综合征患者焦虑情绪及糖代谢水平
的关系研究
[
J0.
健康研究
2
727
2
7(2
)
：
223
-227.
[3
6
0
La
M
,
Yau
XF
,
Si
Y
,
p
aU
CTGF
triggers
rat
astrocyte
ackva-
tiox
and
astrocyte-mediated
inOammatoa
uspoxsc
iu
culture
cou-
ditioxs[
J.
.
NeammatWa,
2719,
42(5)
：
1693
-
1774.
[370
GolU
DT,
Boisture
J,
Shipp
KM
,
p
aU
Paget's
disease
of
boxo
and
qualij
of
/fo[
J
.
.J
Bose
Mixes
Ros
,1999,11(12
)
：
8397
-
1954.
[38
0
闫涵
.TNFRSF11A
基因突变病例报告及
MCP-1
与亚甲炎相
关性研究
[D0
.
苏州:苏州大学
2
719
：
32
-
43
[39
0
Shimamura
M
,
NaUagami
H
,
Osado
MK
,
cS
aU
OPG/RANKL/
RANK
axis
is
a
c/tical meammaW/
signaling
system
iu
ischemic
braiu
m
mice]
J.
.
Proc
Natl
Acad
Sh
U
S
A
,
2714
,
111
(22)
:
3161
-3169.
[47
0
GutWxez
H
,
Kisis/v
L
,
O'KeeXe
GW
,
cS
U
.
Regula/oa
of
uex-
rito
growth
bp
tumour
uecrosis
supePamilp
member
RANKL[
J
0
.
Opex
BDi
,
2715
,
3(1
)
:
127
97.
2024年4月15日发(作者：满山槐)
・
62
・
J
Shanxi
Med
Univ
,
Jan.
2421
,
VS
52
No
1
基于转录组测序技术研究慢性避水应激对大鼠腰膨大脊髓背角中基因表达的影响
马力天
、
，
白
杨
2
，林
强
、
，
苏保伟
、
，
孟宪博
、
，
王景杰
*
(
空军军医大学第二附属医院消化内科
，
西安
710433
；
7
解
放军北部战区总医院神经外科
；
*
通讯作者
,
：
jingjie@
fnima.
eda.
co
)
、
摘要
：
目的
探讨慢性避水应激对大鼠腰膨大处脊髓背角中基因表达的影响
。
方法
24
只
SPF
级健康雄性
SD
大鼠随机
分成两组:对照组和慢性避水应激组
(
CWAS
组)
，
每组
9
只
。
造模结束后,利用旷场实验
(
OFT)
评价大鼠焦虑行为
，
并使用腹
壁撤退反射
(AWR
)
分别在
24,44,64,
3
0
mmHg
四个压力等级处观察大鼠行为学反应评价其内脏敏感性
。
最后
，
安乐死大鼠
并取腰膨大处的脊髓背角
，
进行真核转录组
RNA
建库及测序
。
结果
①
OFT
结果表明
,CWAS
组的中央区路程百分比和中
央区活动时间百分比均显著低于对照组
(P<4.
41
)o
②
与对照组相比
,CWAS
组在
24,44,64,8
mmHg
压力下的
AWR
评分显
著增加
(P<4.
25
)o
③
转录组学测序显示
，
与对照组相比
，
CWAS
组有
11
个基因发生了上调,分别是
ReWgwSd9ZbW16
、
Cd-
knlv
-
Nfkbia
(
Capg
-
ApSd
、
、
Gpd9
P-
4
、
Ctyf
和
TXaeiv
；
KEGG
富集分析表明
，
CWAS
组的
PNK-Ukt
、
FoxO
、
NFoB
和破骨细胞
分化相关信号通路被激活
。
结论慢性避水应激能促使大鼠产生焦虑样行为改变
，
可显著增加内脏敏感性并引起脊髓背
角中基因表达和信号通路的改变
。
关键词
：
转录组学
；肠易激综合征
；
避水应激
；
脊髓背角
中图分类号
：
R393
文献标志码
：
A
文章编号
：
1027
-6611(272971
-0062-79
DOI
：
17
.
9753/j.
im
a
.
1077
-6611.2721.71.711
Effect
of
chroinc
water
avoinancc
stress
on
gene
expression
in
the
spinal
dorsal
horr
of
inthmescenho
lumbalis
of
rrts
based
on
trdnscriatomr
seduencing
MA
LitixX
,
BAI
丫/)
2
,
LIN
Qiang
1
,
SU
BaoweP
,
MENG
Xiando
1
,
WANG
Jingjio
1
*
(
^ecartmeat
sf
Aktstroenterology
,
SeconC
^AaUcc
HospitaU,Ats
Forca
MetnaU
U/Tiaepp,
,
Xi'an
710030
,Chiaa4DepaUmeai
gNeurosuroeo
‘
kneO
Hospital
UfNofhepi
Theatcs
Command
；
*Correspondina
authos,
■jiiigjie@fmmiL.
eSs.
co)
Abstrdct
:
Objectiec
To
investigate
the
effect
of
chronic
water
avoidance
stress
on
gene
expression
in
the
spinal
dorsal
horu
of
intu
mescentia
lumba/s
of
rats.
Methon)
Twenty-four SPF-arado
male
SD
rats
were
randomized
into
two
g/xps
：
conWoi
g/xp
and
chron-
io
water
aveidance
stress
g/xp(CWAS)
,
with
9
rats
in
each
g/xp.
After
mobe/ng
,
the
open
fielU
Wst(OFT)
was
used
to
evvlaato
the
axiety
bedavior
of
rats
,
2
1
the
addominai
withdrawal
/5ex(
AWR
)
under
the
pressures
of
22,22,6
2,3
2
mmHg
was
used
to
evvlu-
ate
the
visceral
sensitivity.
Finally,
the
spinal
dorsal
horus
of
lumbar
enlargement
were
extracted
from
the
exthanized
rats
,
and
the
ex-
kapoho
Wansc/ptome
RNA
librap
as
wel
l
as
WanscdpWme
sepuencing
were
constacwd
and
pePormed.
ResulU
①
OFT
results
showed
that
the
pe/enWge
of
the
central
area
distance
and
the
pe/enWge
of
central
area
activity
time
in
CWAS
groxp
were
significantly
lower
than
those
in
conWoi
g/xp(
P
<
4.
21
).
②
Compared
with
conWoi
groxp
,
the
AWR
score
was
significantly
increased
under
the
pressures
of
22
,
44
,
64
,
84
mmHg
in
CWAS
g/xp
(P<4.
25
).
③
Tanscriptomics
sepuencing
showed
that
compared with
conWoi
groxp
,
11
kinds
of genes
in
CWAS
g/xp
were
up-regulawd
,
namely
Retsat,
Sgk1
,
Zbth9
,
Cddnla
,
Nfkbiv
,
Capg
,
Apold1
,
Gpd1
,
Pdd4
,
CtpO
and
TXrsfl1a.
KEGG
enrichment
showed
that
PNK-Ukt,
FoxO
and
NF-aB
signa/ng
pathways
in
CWAS
g/xp
were
activv-
wd.
Coaclusioo
Chronio
water
aveidance
stress
can
induce
the
anxietyObe
bePavior
cUanges
in
rats
；
which
can
significantly
increase
the
visceral
sensitivity
and
cause
the
cUanges
of
gene
expression
and
signa/ng
pathways
in
the
spinal
dorsal
horu.
Key
wonis
:
Wansc/ptomics
；
R
/
wdlo
bowel
syp/me
；
water
avoidance
stress
；
spinal
dorsal
horu
慢性应激在功能性胃肠病症状的发生和发展中
起重要作用
。
慢性避水应激模型
(
ch/xic
watar
dvoibanco
stress
,
CWAS
)
是
Sylviv
Bradesi
教授在
(iDitadle
bowel
syudama,ICS
)
是一种慢性的功能性
胃肠病
。
全球有
9%-23%
的人常被该病困扰
，
并寻
求医治
［
20
o
ICS
的发生发展与慢性
、
持续
、
紧张的人
类日常精神应激事件息息相关
,
且文献表明
ICS
患
者也伴有轻度焦虑和抑郁^
70
。
这些特征与
CWAS
2075
年首次提出
,
该模型会出现持久的内脏痛觉敏
化(不低于
1
个月
)
、
焦虑样行为
、
粪便颗粒数增多
以及结肠免疫系统的轻度激活
［
10
o
肠易激综合征
基金项目
：
国家自然科学基金资助项目
(8
974534
)
符合得很好
，
因此
,
该模型常被用于研究
ICS
的内脏
作者简介
：
马力天
,
男
，
991
-
14
生
，
在读硕士
，
:
ma/tWnl034@
93.
com
收稿日期
：
2424
-
14
-
42
山西医科大学学报
，
2021
年
（
月
，
第
52
卷第
（
期
痛觉敏化和肠道动力异常
。本研究通过慢性避水应
激法建立大鼠的
CWAS
模型,并利用
OFT
和
AWR
分别评价其焦虑样行为和内脏敏感性
,
之后采用转
录组学测序探究其腰膨大处脊髓背角中基因表达的
变化
,
为后续对慢性应激的研究提供参考
。
1
材料与方法
1.
1
动物
、
主要仪器和试剂
SPF
级健康雄性
SD
大鼠
24
只
，
体质量
184
-
220
y,
由空军军医大学实验动物中心提供
。
大鼠在
实验前进行为期
1
周的适应性饲养
，
环境温度
22
-
26
C
，
湿度
44%-60%
,
自由饮食
，
光照
7
—
7
U
明
暗交替
。
所有的努力都是为了减少实验动物的数量
和痛苦
。
过量使用
2%
的戊巴比妥钠
（
44
my/ky
）
安
乐死动物后进行取材
。
本研究实验动物的使用及处
置方法符合
3R
原则
,
实验开展前经过空军军医大
学动物伦理委员会的批准
。
24
只大鼠被随机分成
两组
：
假模型组
（
sham
组
）
和慢性避水应激组
（
CWAS
组
）
，
每组
7
只
。
高通量转录组测序仪
（
T
b
miua
）
,
Qu/it
荧光计
（
Iuvitrogen
,
Q32866
）
,
微型旋涡混合仪
（
上海沪西
，
WHO
）
,
台式高速低温离心机
（
Thejie,Thejie
Sci
entific
Sonali
Legend
Mien
21R
）
,
PCR
仪
（
Biv-jp
,
T74
tm
Thermal
Cycler-
，
电泳仪
（
北京六一,
DYY-
11
）
,
生物电泳图像分析系统
（
复日
，
FRP84A
）
。
Qu/it
RNA
检测试剂盒
（
Life
；
Q32855
）
,
Qu/it
DNA
检测试剂盒
（
Life,Q7212
）
,Hieff
NGS
TM
MvxUy
Dual-mode
mRNA
Libjj
Pnp
Kit
for
Illumiua
（
YE-
ASEN,7341ES96
）
,Hieff
NGS
DNA
Selection
Beads
（
YEASEN,7641ES96
）
。
1.2
CWAS
造模方法
根据文献
［
5
］
所述
，
用亚克力板制作一透明塑
料盒,长宽咼分别为
45,25,25
cm
。
其中央有一平
台,长宽高分别为
7,8,8cm
（
见图
（
）
o
实验时
，
向
盒中注入
25
C
的水,水面距台面约
1cm
。
每日上
午
5
点将大鼠轻轻放置于平台上
1
-
并持续
7
h
o
对照组放置于不盛水的相同的塑料盒中
，
时间与
CWAS
相同
。
1.
3
旷场实验
旷场实验
（
open
field
test,
OFT
）
由黑色有机玻
璃组成
,
长宽高分别为
74,104,64
cm
,
中间
54
cm
x
54
cm
为中央区
。
提前
24
h
将大鼠饲养于行为室
。
实验时
,
双手轻轻将大鼠抱起置于中央区
,
使用动物
・
63
・
Figure
1
Self-sroviheP
CWAS
molding
epuipmep-
追踪系统
（
ShpLgkai
Mobile
Datum
Information
Tech-
uohyy
）
记录大鼠活动轨迹
7
mix
。
每只动物检测
前,清理其中大小便并用
70%
的乙醇擦拭实验装
置
，
待酒精完全挥发后进行下一次实验
。
采用中央
区路程百分比
、
中央区活动时间百分比来评价大鼠
焦虑行为
。
1.0
腹壁撤退反射
腹壁撤退反射
（
aUhomiuai
withhswat
n/ep
,
AWR
）
是公认的评价内脏敏感性的方法
。
AWR
通
过扩张肠道
，
观察动物腹部收缩的程度来评价动物
内脏敏感性
。
利用血压计
、
橡胶手套
（
中指段
）
、
三
通管和
8F
导尿管
（
沃德硅胶管
）自制实验设备
（
见
图
2
）
。
实验前用乙醚轻微麻醉大鼠，
并提前
34
mix
将其置于亚克力材质的自制有机玻璃盒中
，
使大鼠
无法前后运动
。
气囊每次进入大鼠肛门的深度约为
6
cm,
并用胶布将尿管末端黏在大鼠尾根部,防止脱
落
。
同一压力扩张时间约为
20
-,
每次扩张的间隔
时间为
4
mix
。
分别在
24,44,60,80
mmHg
四个压
力等级处观察大鼠行为学反应
,
并按照以下标准进
行评分⑹
4
分
，
大鼠对扩张无任何反应;
1
分,大鼠出
图
2
自制的
AWR
测量仪器
Figure
2
Self-made
AWR
measurment
epuipmep-
・
64
・
现轻微不适
，
偶尔扭动头部;
2
分
，
腹背部肌肉轻微收
缩但未抬离地面;
3
分,肌肉强烈收缩并将腹部抬离
地面;
4
分,呈弓形
，
并将腹部和会阴部抬离地面
。
每一压力等级测量
3
次取平均值进行统计学分析
。
-
5
真核转录组
RNA
建库
、
测序和分析
分别选取对照组和
CWAS
组各
3
只大鼠
，
安乐
死后用脊髓吹出法⑺取出脊髓
，
并使用无
RNA
酶的
手术器械小心取出腰膨大处的脊髓背角
，
置于冻存
管内并于液氮中速冻
。
首先利用
QUO
RNA
检测试
剂盒对总
RNA
精确定量并进行
mRNA
纯化和片段
化
。
之后合成
、
纯化双链
cDNA
、
末端修复
/dA
尾添
加反应
、
接头连接
，
并进行分选
，
用于文库扩增
。
最
后用凝胶电泳进行文库质检
，
并进行测序
，
测序后依
次进行样本质量控制
、
样本相关性检验
、
表达差异分
析及差异基因功能富集分析
，
具体步骤如下
。
①
样本质量控制
：
高通量测序平台
(
Illumina
Hiseq
TM)
测得的原始图像数据文件经
CASAVA
软件
碱基识别
(
base
calling
)
分析转化为原始测序序列
(
sequenceX
oaks
-
，
称为
raw
ahs
。
raw
oaks
中含
有带接头的
、
低质量的序列
。
为了保证信息分析质
量
,
必须对原始数据过滤
，
得到过滤后的数据
,
使用
数据过滤软件
(
T/mmomatic
-进行数据处理
。
②
样本相关性检验:在本实验中,每组有
3
个生
物学重复
，
其目的一方面证明涉及的生物学实验操
作是可以重复的且变异不大
，
另一方面确保后续得
到可靠的结果
。
在转录组学测序结果的分析中
，
为
了使不同基因
、
不同实验之间的基因表达水平具有
可比性,
TPM(tonsc/pt
per
million
)
被引入用来估算
基因表达水平
。
TPM
同时考虑了测序深度
、
基因长
度以及样本对
oaks
计数的影响
，
常用于基因表达
水平的估算
。
样品间基因表达水平相关性是检验实
验可靠性和样本选择是否合理的重要指标
。
采用
Peaoon
相关系数表示样本间基因表达的相关性,
Peaoon
相关系数数越接近于
1
，
表明相关性越强⑻
。
③
表达差异分析:对照组和
CWAS
组,每组有
3
个生物学重复
，
我们采用
R
中的软件包
DESeq
进行
分析
。
筛选条件设为
：
5
<0.
05
(
q
值是校正后的
P
值
，
该值越小表示基因表达差异越显著)且差异倍
数
I
folk
change
丨
〉
2
。
④
差异基因功能富集分析:与基于基因表达差
异分析不同
，
基因富集分析可以找出表达水平有差
异的基因集
。
富集分析为基因集合的表达差异分
]
Shanxi
Med
Unia
,
Jan.
2021
,
Vol
52
No
1
析
，
能够识别出生物现象最相关的生物学途径
。
使
用
Clusterkafiler
进行功能富集分析
，
当
g
(校正后的
P
值)小于
0.
05
时
，
认为该功能存在显著富集情况
。
我们采用
GO
(
gene
ontoloya
-和
KEGG(
Kyoto
encycla-
peXig
vf
genes
and
genomes
-两种分析方法对差异基
因进行功能注释,并绘制差异基因富集功能气泡图
。
1.6
统计学分析
实验结果用均数
土
标准差仏土
i
表示,基因表
达水平的
TPM
值用均数
土
标准误
(
±
u
)
表示
，
采
用
SPSS
19.
0
进行统计学分析
。
组间比较采用
s
检
验
,AWR
评分采用重复测量的方差分析
，
以
P
<
0.
05
为差异有统计学意义
。
2
结果
2.
1
CWAS
组大鼠的行为学变化
OFT
结果提示,与对照组相比
,
CWAS
组的中央
区路程百分比和中央区活动时间百分比均显著低于
对照组
(PV0.01
,
见图
3)
。
对照组大鼠在
OFT
中的
CWAS
组大鼠在
OFT
中的
运动轨迹图
运动轨迹图
15
对照组
CWAS
与对照组相比
,
P
<
0.05
,
*
P
<
0.
01
图
3
两组大鼠在
OFT
中的行为学变化
Figure
3
BeOavioat
changes
of
CWAS
rats
in
OFT
山西医科大学学报
，
2021
年
（
月
，
第
52
卷第
（
期
・
63
・
2.
2
CWAS
组大鼠的内脏敏感性增加
O
对照组
造模结束后
，
与对照组相比
，
CWAS
组在
20
,
44,64,80
mmHg
压力下的
AWR
评分显著增加
（
P<
4.
45,
见图
4
）
o
3
—
r
-
2.
3
各样本质量控制后数据信息
使用数据过滤软件
（
Trimmomabo
）
依次去除带
N
碱基的序列
、
去除
nado
中的接头序列和去除低质
碱基
。
各样本质量控制后数据信息见表
（
o
2.4
样本相关性检验结果
20
mmHg
40
mmHg
60
mmHg
80
mmHg
对不同样品的基因表达图谱进行相关性分析
,
并制作成热图
（
见图
3
），
结果表明
，
生物学重复样本
与对照组相比
，
*
P<4.
43
图
4
AWR
评价两组大鼠的内脏敏感性
Figure
4
Evaluation
of
the
viscerot
sensitivitg
of
rats
in
the
two
gnupo
by
AWR
间相关性较好
,
能够进行下一步统计学分析
。
表
1
各样本质量控制后数据信息
Table
1
Date
information
qualit
：
conOoi
of
eech
sphip
I
c
组别
样本所有
Read
39
667
422
39
381
996
33
660
416
所有碱基
数目
（
by
）
3
950
73
802
3
977
259
420
3
779
062
420
3
856
243
420
碱基质量
Q7
以上比例（
％
）
98.
82
98.76
98.76
碱基质量
Q20
以上比例（
％
）
95.54
碱基质量
Q32
以上比例（
％
）
86.
52
83.23
N
碱基的
GC
碱基
比例
（
％）
2.
23
2.
23
2.
23
2.
23
2.
23
2.
23
比例（％
）
49.
44
49.
82
42.
98
49.
83
42.
83
33.
13
对照组
1
对照组
2
对照组
3
CWAS
1
CWAS
2
CWAS
3
73.
34
93.
32
93.53
86.
02
86.
52
86.
92
88.
86
39
041
636
98.
83
98.
86
99.
23
41
064
640
61
348
362
6
157
696
002
9
202
254
002
93.
63
96.
39
CWAS
3
对照组
3
CWAS
1
对照组
2
CWAS
2
对照组
1
0.86
0.89
0.93
相关系数
0.96
1
颜色块代表相关性指数值
，
颜色越灰表示样本间相关性指数越低,颜色越黄则相关性指数越高
图
3
样本间相关性分析热图
Figure
3
Heatwap
diagram
of
inteuampte
correlation
analysis
・
66
・
J
Shanxi
Med
UXv
,
Jan.
2021
,
Vol
52
No
1
2.5
组间基因表达差异分析
6
o
散点图中
,
横纵轴分别为两组样本
W
v
2TPM
值
,
与对照组相比
,
CWAS
组有
9
个基因发生了上
图中每个点代表一个基因
,
越接近原点的点表达量
调
,
基因表达差异分析结果见表
2
o
我们选用散点
图将基因在两组中测量值用点表示在坐标系中
,
可
越低
。
其中红色表示上调基因
,
绿色表示下调基因
,
黑色表示非差异基因
，
上调
/
下调均是纵轴样本相对
以直观地反映出两个测量值之间的关系
,
结果见图
表
2
CWAS
组中发生上调的基因
Table
2
Up-reyulateX genes
in
CWAS
group
于横轴样本
。
基因
Rets
vt
对照组平均
TPM
值
39.23
±5.25
CWAS
组平均
TPM
值
119.
11
±16.
04
143.
90
±29.
82
8.
10±9
57
39
29
±9 01
Sg
k1
Zbthl9
52.
43
±
12.
75
2.
33
±4.
96
基因描述
视黄醇饱和酶
血清
/糖皮质激素调节蛋白激酶
、
早幼粒细胞白血病锌指蛋白
细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂
1A
B
细胞
K
轻肽基因增强子核因子抑制因子
Cdknlv
16.
08
±4.
74
16.
84
±9
26
5.57
±1.75
3.55
±4.
35
Nfkbiv
Capg
42.
94
±6.
76
9.14
±2.
12
戴帽蛋白
（
肌动蛋白丝
）
内皮细胞早期反应蛋白
3
-磷酸甘油脱氢酶
-
、
丙酮酸脱氢酶激酶
-4
Apold
、
Gpd1
9.01
±9
35
124.
95
±2.
25375.
34
±2.
34
Pdk4
Ctyf
6.
74
±4.
09
3.59
±4.
35
9.
02
±9
33
16.
84
±3.39
9.
9
±4.
67
TnfrsfUv34.
08
±9
26
结缔组织生长因子
肿瘤坏死因子受体超家族成员
11c
4.
45
,
见图
9
）
；
CWAS
组的
PNIKAkt
、
FoxO
、
NFoB
和破骨细胞分化相关信号通路被激活
（
见图
8
）
o
3
讨论
一些与压力相关的精神类疾病或者应激常会导
致内脏痛
，
并常合并焦虑症和抑郁症
，
然而其具体机
制仍有待阐明⑼
。
在啮齿类动物中
，
束缚应激
、
避
水应激和母婴分离常被用于研究应激引起的内脏敏
化
,
有证据表明
,
长期的应激会促进对疼痛的感知并
使疼痛感觉通路更加敏感
［
6
0
o
既往的研究表明，
应
-10
-5
0
5
10
15
lo&TPM
对照组
图
6
两组间差异基因表达散点图
Figure
6
The
scatter
plot
of
diRe/ntivl
gene
exp/ssion
bo-
激诱导的内脏痛与大脑内
DNA
甲基化和组蛋白乙
酰化模式改变有关
,
从而导致伤害感受神经递质表
达增加
J
1
0
o
然而
，
脊髓中内脏痛觉敏化的机制需要
进一步研究
。
在本研究中
，
我们用转录组学测序分
tween
two
g/ups
析了
CWAS
组与对照组之间脊髓背角腰膨大中基
因表达的差异，
并进行了富集分析
。
结果提示
，
与对
2.6
差异基因功能富集分析
照组相比
，
CWAS
组有
9
个基因表达显著上调
，
以
下将分别进行讨论
。
Rewat
主要编码视黄醇饱和酶,该酶催化全反
通过
GO
富集分析和
KEGG
富集分析
,
可以识
别出生物现象最相关的生物学途径
。
气泡图的纵轴
表示功能注释信息
,
横轴表示功能对应的富集指数
式视黄醇双键的饱和
,
导致生成二氢类视黄醇代谢
（
注释到该功能的差异基因数目除以注释到该功能
物
。
除了主要参与维生素
A
的代谢之外
，
还可以调
的基因数目
）
，
g
（
校正后的
P
值
）
的大小用点的颜色
表示,
g
越小则颜色越接近红色
。
每个功能下包含
的差异基因的多少用点的大小来表示
。
CWAS
组与
对照组相比
，
细胞质部分的差异最大
（
校正后
P
<
节细胞对氧化应激的反应
，
是细胞对氧化应激和活
性氧
（
ROS
）
的主要调节剂
，
并在脂肪的形成和积累
中发挥重要作用
［
6
0
o
慢性不可预测的轻度应激
（
chronic
unp/dicWblo
milU
stress
:
CUMS
）
会产生氧
山西医科大学学报
，
2021
年
（
月
，
第
52
卷第
（
期
对含氧化合物的反应
-
・
67
・
对氮化合物的反应
-
活性氧的代谢过程
-
TNFSF11
介导的对
ERK1
和
ERK2
的正调控
-
前列腺素的正调控对发热的阳性调节作用
-
细胞对肿瘤坏死因子的反应
-
软骨发育的调节
-
对盐皮质激素的反应
-
辅酶代谢过程的调节
-
基因数
辅助因子代谢过程的调节-
•
2.5
•
5.0
多细胞生物的内稳态
-
骨髓细胞分化的负调控
-
细胞质部分
-
•
75
•
10.0
程序性细胞死亡的调节
-
凋亡过程的调节
-
对肿瘤坏死因子的响应-
校正后
P
值
定位于细胞核的蛋白质
-
对脂质的反应
-
肿瘤坏死因子介导的信号通路
-
1.00
0.75
脂质转运的正向调节
-
软骨细胞分化的调节
-
磷酸化作用
-
0.50
壬
0.25
■
0.00
对有机含氮化合物的反应
-
对非生物刺激的反应
-
对应激的反应
-
脂质转运
-
甘油磷酸盐穿梭
-
细胞质基质
-
细胞质
-
蛋白质入核，
转位-
0.00
0.25
0.50
當集指数
0.75
1.00
图
7
两组间差异基因的
GO
富集分析
Figure
7
Analysis
of
GO
ex/chmext
of
diReaxtict
genes
between
two
groups
醛固酮调节钠的重吸收-
催产素信号通路-
脂肪细胞因子通路-
催乳素信号通路-
神经营养因子信号通路-
肿瘤坏死因子信号通路・
B
细胞受体信号通路-
T
细胞受体信号通路-
JAK-STAT
信号通路
-
Toll-IMD
信号通路-
校正后
P
值
■
1.00
E
0.75
胞质
DNA-sensing通路
-
RIG-I
样受体信号通路-
I
050
■
0.25
NOD
样受体信号通路-
Toll样受体信号通路
-
Hippo
信号通路
-
破骨细胞分化
-
凋亡-
基因数
•
1.00
PI3K-Akt
信号通路-
mTOR
信号通路-
P53
信号通路
-
细胞周期-
FoxO
信号通路
-
•
1.25
•
1.50
•
1.75
•
2.00
HIF-1
信号通路-
NF-kappa
B
信号通路.
趋化因子信号通路-
细胞因子受体相互作用-
cAMP
信号通路-
ErbB
信号通路
-
MAPK
信号通路-
脂代谢
•
0.20
0.25
0.30
富集指数
图
8
两组间差异基因通路的
KEGG
富集分析
Figure
8
KEGG
ex/chmext
analysis
of
diReaxtict
gene
pathways
between
two
groups
-
66
-
化应激和炎症相关的代谢改变
，
并最终引发许多慢
性退行性疾病
,
例如心血管疾病
、
糖尿病和阿尔兹海
默病
［
5
］
。
慢性避水应激会引起小鼠神经系统炎
症
［
7
］
以及大鼠肠道黏膜炎症
［
3
］
。
Retsat
在
CWAS
组中的上调
，
可能是对
CUMS
响应
。
Sgk1
基因编码血清和糖皮质激素调节蛋白激
酶,是一种新的丝
/
苏氨酸蛋白激酶,该酶在细胞应
激反应中起重要作用
。
当细胞受到糖皮质激素
、
血
清
、
IL-6
、
扭转力刺激等
，
Sgk
的转录水平会迅速升
高
［
4
］
。
升高的
SGK1
调节下游多个信号通路
，
抑制
细胞凋亡
，
拮抗缺血再灌注所致的神经细胞凋亡
。
此外
,SGK1
在抑郁症患者和动物体内的表达水平
明显升高
，
可能与抑郁症的发生有关
［
4
6
2
］
。
SGK1
与
CWAS
的直接联系尚未有报道
，
我们推测
，
SGK1
可能与慢性避水应激引起的大鼠的焦虑情绪有关,
可能也参与了
CWAS
引起的炎症反应
，
这需要进一
步验证
。
ZBTB17
亦称为早幼粒细胞白血病锌指蛋白
(PLZF
),
该蛋白除了调控细胞周期并参与细胞增
殖
、
凋亡等过程外,还可被糖皮质激素强烈诱导
，
引
起脂质和胰岛素水平的改变
［
I5
^
S2
］
，
并通过降低正常
小鼠
IRS1
、
Akt
和
FoxO1
磷酸化来负调节胰岛素信
号通路
［
1
］
。
下丘脑一垂体一肾上腺轴
(
HPA)
的持
续激活是慢性应激的显著特征之一
［
2
］
,
激活的
HPA
释放皮质醇
，
激活多种信号通路
，
并启动基因组事
件
，
从而导致外周和中枢神经系统生理发生长期变
化
「
25
］
。慢性避水应激可能是通过激活
HPA
轴产生
皮质醇
，
并诱导
ZBTB17
的表达增加,参与了
CWAS
所致的内脏敏化
，
并与神经可塑性有关
。
CDKNlA(CycUx
depepdept
kinasa
inhibitef
1
A
)
编码一种细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂
，
是调控细
胞周期的一个重要因子
。
P53
严格调控该基因的表
达
，
通过该蛋白介导
P53
依赖细胞周期
G1
期停滞
，
以响应各种应激刺激
。
该基因还可在
S
期
DNA
复
制和
DNA
损伤修复中起调节作用
。
流行病学研究
表明
，
慢性心理应激会促进肿瘤发生,其可能的原因
是慢性应激激活
HPA
轴并释放皮质醇
，
诱导
ZBTB17
和
SKG1
的表达增加
，
进而增加
MDM2
并降
低
P53
的活性与功能①
〕
。
P53
功能的降低可能会
使
CDKN1A
表达下降
，
细胞周期停滞变短
，
从而促
进肿瘤发生
。
核因子
kappa
B(NF-sB
)
参与细胞对外界刺激
的响应
，
在细胞的炎症反应和免疫应答中起关键作
J
SUaupi
Med
Univ
,
Jan.
202-
,
Vol
52
No
-
用
。
NFKBIR
是
NF-pB
复合物抑制蛋白
IB
的编码
基因
，
可与
NF-
p
B
结合
，
并阻止其向核内转移
。研
究表明
,
CWAS
组大鼠的回肠末端
,
NF-pB
信号通路
和炎症因子的活化会介导低度黏膜炎症
［
3
］
。
NF-
k
B
信号通路会引起促炎因子的表达,促炎因子的表
达又会进一步促进
NF-
p
B
信号通路的活化,从而使
肠道黏膜通透性增强
，
导致肠易激综合征
［
4
］
。
NFKBIR
在脊髓背角中的上调
,
可能是对
NF-pB
信
号通路活化的响应
，
其作用或许是抑制过度活化的
NF-pB
信号通路
。
我们推测
，
在
CWAS
中
，
NF-sB
信号通路的活化与抑制蛋白
CB
表达的上调同时存
在
。
巨噬细胞加帽蛋白
(
CayG)
属于凝溶胶蛋白超
家族之一
，
参与细胞内信号转导过程并调控肌动蛋
白
［
9
］
。
在神经系统中
，
CayG
可能会调控树突棘的
成熟
［
5
］
。
已有研究证实
，
慢性束缚应激导致大脑的
某些区域(如海马)的树突棘密度增加
，
并且糖皮质
激素也可以通过调节脑源性神经营养因子
(
BDNF
)
调控树突棘的密度
［
4
］
。
因此我们推测
，
在
CWAS
中
,CapG
表达的增加可能与突触的可塑性和内脏敏
化有关
。
Apold
1
是在内皮细胞中鉴定出的一种基因
，
可
对不同刺激(包括缺血
、
细胞因子和压力等)做出反
应
，
该基因在血管内皮中的缺失会增加凝血并促进
血栓形成
［
32
］
。
最新的研究表明
,Ayold1
作为一种炎
症标志物可在精神分裂症患者的海马中增加
，
提示
可能参与了神经系统的炎症反应⑶
］
。
IBS
除了肠
道中的黏膜炎症外
，
神经炎症常通过脑肠轴参与
ICS
的病理过程
，
从而导致神经一内分泌等一系列
生理病理变化
［
4
］
。
CWAS
中的
Ayold1
表达增加
，
可能是神经系统炎症所致
。
我们还需要更多的数据
才能明确其功能
。
6
-磷酸甘油脱氢酶
-1(Gpd1)
和丙酮酸脱氢
酶激酶
-4(Pdk4)
都与机体能量代谢有关
。
Gyd1
的功能是催化磷酸二羟丙酮
(DHAP
)
和
a
-
磷酸甘
油之间的转化
，
与人体的肥胖有关并与体质量指数
(BMI
)
成正相关
［
5
］
。
Pdk4
是调节丙酮酸脱氢酶复
合物
(PDC)
的关键酶,禁食和高脂饮食的刺激下,
Pdk4
在组织中的活性明显增加
，
心脏中
Pdk4
的过
度表达会导致脂肪酸利用率升高和碳水化合物消耗
降低
［
9
］
。
IBS
患者可在多种因素的作用下发生水
、
糖和电解质的代谢紊乱
［
3
］
。
CWAS
组中
Gyd1
和
Pdk4
的高表达可能与慢性应激所致的代谢改变有
山西医科大学学报
，
202-
年
-
月
，
第
52
卷第
(
期
关
,
具体作用方式还需要进一步研究
。
结缔组织生长因子
(CTGF
)
参与神经系统的炎
症反应或损伤修复过程
。
大鼠星形胶质细胞分泌的
CTGF
可通过活化星形胶质细胞中的
ASK-p38/JNK-
NF-sB/APD
信号通路,以自分泌的方式激活星形胶
质细胞
，
并促进星形胶质细胞介导的炎症反应
[34]
o
CWAS
组中
CTGF
表达显著升高可能参与了神经系
统炎症反应
,
其机制需要进一步研究
。
肿瘤坏死因子受体超家族成员
llA(Tnfrsfllu
)
属于肿瘤坏死因子及其受体超家族
，
编码蛋白体核
因子
k
B
的受体激活剂
(
RANK
)
⑶
〕
o
RANK
是核因
子
k
B
受体活化因子配基
(
RANKL)
唯一的受体
，
启
动
RANKL-RANK
信号通路
。
该基因的突变会导致
Pagel
骨病
、
扩张性高磷血症和家族膨胀性骨溶
解期
o
研究表明
，
RANKL-RANK
信号通路可通过
小胶质细胞中的
Toll
样受体信号通路减轻小鼠缺血
性脑病中的炎症国
]
,
并且,
RANKL
可以在发育过程
中直接作用于神经元的轴突
，
并抑制其生长
[40]
o
目
前尚不清楚在
CWAS
中
Tnfrsfllu
的上调是否为机
体对慢性应激所致轻度炎症的响应
,
还需要进一步
研究
。
到目前为止
,
IS
仍然对人们造成极大的困扰
。
随着科学的发展
，
人们希望能找到新型的生物标志
物来帮助对
ids
进行诊断
，
并且更好地理解
ids
的
病理生理
，
尤其是在基因组
、蛋白质组和转录组等层
面深入了解
DS
的发病机制
。
我们在本研究中
，
使
用啮齿类动物的避水应激模型模拟人类的
IBS
，通
过转录组学的方法筛选出表达异常的基因
，
为进一
步研究提供参考
。
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Uepossive-bie
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Chroxic
milk
stress
in
submissive
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marked
polyPixsig
and
social
avoidauce
without
hedoxic
deficit
in
the
sucrose
pafeaxce
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,
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Pt
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proUuctiou
of
reactive
oxypex
spe
cies
-J]
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eP
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Chroxic
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hictakle
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matiou
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sWess-induced
social
a-
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KazOova
L,
st
aU
$
；
116-5650
coagexic
sWaiu
reveals
the
eXect
of
Zbtbl6
ox
dexamethasoxe-indaced
iu-
suliu
psistauce
[
J
0.
Frost
Endoc/uol
(
Lausanuo
)
,
279,
9
:
止.
[220
Rothroch
NE
,
LutgexhoP
SK
,
Kredos
KJ
,
st
aU
Stress
and
symp
toms
iu
pabeuW
with
inteptitial
cystitis
:
a
UD
stress
mobel-J0
.
U
p
W
op
,2071,57(3)
：
422-
427.
[23
0
Beato
M
,
Sapchez-Pachece
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Interactiox
of
steroid
hoaioso
/-
ceptou
with
the
transcriptiox
initiatiox
complex
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Fexg
Z
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Liu
L
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Zhang
C
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p
al
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Chrosic
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stress
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atos
p53
fupctios
and
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tumodgexesis
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Sh
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0
Ya
ZC
,
Ceu
YX
,
Wa
BH
,
p
aU
Berde/uo
prevexW
stress-iu-
daced
gut
iXlammatWa
and
visceral
hypersexsitivity
and
redacos
intestinal
motility
iu
rats
[
J
0.
WorlU
J
GasWoextepi,
2719
,
25
(29)
：
3752
-3773.
[260
Hartuag
JE
,
Eshew
O
,
Woag
T
,
cS
aU
NacWas
facWr-4appa
B
regulates
paid
and
COMT
expussRs
iu
a
roXeut
mobel
of
iXlam-
matiox[
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iu
the
post
syuaptic
dexsity
[ J
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Mol
Cell
Neu/sci,
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[290
Bexuett
MR,
LagopouWs
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Stress
and
trauma
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BDNF
costrol
of
dedhancopihe
foaiatiox
and
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J
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Neurobiol
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Diaz-Wauestro
C
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Bosetti
NR
,
Wust
P,
cS
aU
ApcOdI
defiDexcy
/sociatos
with
iuc/ased
aderial
thrombosis
iu
vive
[
J
0.
Ear
J
Clip
Iuvest,
2727,
57(2)
:
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J
Shanxi
Med
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2021
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VS
52
No
1
[39
Lanz
TA,
Reinhad
V
,
Sheedau
MJ
,
p
aU
Postmodem
Wanscdp-
tiosal
pro/ling
reveals
wibespread
iucreaso
iu
inUammabox
iu
scUizophrexiv
:
a
comparisox
of
prefrostal
codex,
striatum
,
and
hippocampas
amoag
maWhed
tetrads
of
coxtrols
with
suPjecW
dl-
agpsed
wiW
scUizophrexiv
,
bipolas
os
major
depressive
disordos
[J.. Traxl
Pgchiatw,
2719,
9(9:151.
[32
0
Ng
QX
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Sob
A
,
Lobe W
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cS
sU
The
role
of
meammatWa
iu
iR
/
tadlo
bowel
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J
0
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J
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Ros
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