α7胆碱能受体激动剂PNU刺激SD大鼠星形胶质细胞钙调蛋白的表达

2024年4月26日发(作者：林青文)

α7胆碱能受体激动剂PNU刺激SD大鼠星形胶质细胞钙调

蛋白的表达

何婧;任真奎;官志忠;禹文峰;吴昌学

【摘要】目的：探讨α7胆碱能受体（α7nAChRs）激动剂（ PNU）对SD大鼠

星形胶质细胞钙调蛋白（ CaM）表达水平的影响。方法：将培养第3~4代的星形

胶质细胞分为对照组、PNU处理组（ PNU组）、α7nAChRs阻断剂（ MLA）联

合PNU处理组（联合组）；对照组不加PNU和MLA处理，PNU组以1、5及

10μmol/L的PNU处理星形胶质细胞6、12、18及24 h，联合组以0.05、0.1

及0.15μmol/L浓度的MLA预先处理星形胶质细胞2 h后，选择加入上调CaM

蛋白表达水平最高的PNU浓度和最佳时间（ PNU组筛选后所得）处理细胞；运

用蛋白印迹（ West-ern blotting）方法检测3组星形胶质细胞CaM的蛋白表达

水平。结果：与对照组比较，1、5及10μmol/L PNU 刺激星形胶质细胞6、12、

18及24 h可使CaM蛋白表达水平升高（ P﹤0.05）；加入5μmol/L PNU培养

12 h后，上调作用最明显；联合组（0.05、0.1及0.15μmol/L的MLA预先处理

星形胶质细胞2 h后，再加入PNU 5μmol/L培养12 h）与PNU组比较，星形胶

质细胞裂解液中CaM蛋白的表达受到抑制，差异有统计学意义（ P﹤0.05）。结

论：PNU激活星形胶质细胞后可提高CaM的蛋白表达水平，MLA可阻断该表

达。%Objective:To Detect the influence of α7 cholinergic receptor(α7

nAChRs)PNU on calmodulin( CaM)expression level in SD rat astrocytes.

Methods:The 3-4 generations of astrocytes were divided into PNU

treatment group(group P),α7nAChRs blocking agent(MLA)combined with

PNU treatment group( group MP ),and normal control group( group C ).

Group C did not receive PNU or MLA. PNU was used to treat astrocytes at

doses of 1,5 and 10 μmol/L for 6 h,12 h,18 h and 24 h in group P. In group

MP,PNU of optimal concentration was used to cultivate the astrocytes

after MLA treated astrocytes at doses of 0 . 05 ,0 . 1 and 0 . 15 μmol/L for 2

h and in optimal time for cultivation. CaM expression level was detected by

western blotting. Results:CaM expression levels were significantly higher in

group P than in group C( P﹤0 . 05 ),and the expression peak obtained in

12 h after 5 μmol/L of PNU was added. While In group MP,the CaM

expression level was markedly lower than that in group P when cells

treated by 5 μmol/L of PNU for 12 h( P﹤0 . 05 ). Conclusion:The activation

of PNU to Astrocytes might increase expression levels of CaM

protein,which can be blocked by α7nAChRs blocker MLA.

【期刊名称】《贵阳医学院学报》

【年(卷),期】2017(042)001

【总页数】4页(P7-10)

【关键词】星形胶质细胞;α7胆碱能受体;激动剂;钙调蛋白;阿尔茨海默病

【作者】何婧;任真奎;官志忠;禹文峰;吴昌学

【作者单位】贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州贵阳 550004; 贵州医科

大学地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室，贵州贵阳 550004;贵州医科大

学分子生物学重点实验室，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学地方病与少数民族性

疾病教育部重点实验室，贵州贵阳 550004;贵州医科大学分子生物学重点实验室，

贵州贵阳 550004; 贵州医科大学地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室，贵

州贵阳 550004; 贵州医科大学病理学教研室，贵州贵阳 550004;贵州医科大学分

子生物学重点实验室，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学病理学教研室，贵州贵阳

550004;贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学

地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室，贵州贵阳 550004

【正文语种】中文

【中图分类】R34-33;R749.16

β-淀粉样多肽(Aβ)的聚集和沉积是阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)的

核心发病机制，它不仅可以导致神经细胞的凋亡，也可以破坏神经突触的结构和功

能，从而导致AD患者的记忆和认知功能障碍[1-2]。α7胆碱能受体(α7nAChRs)

是神经型尼古丁受体中重要的成员，是拮抗Aβ神经毒性的一个重要靶点，主要位

于海马、丘脑、前额叶皮层、皮层下基底节、中脑腹侧多巴胺能神经元和中缝背核

5-羟色胺能神经元等部位 [3-4]。α7nAChRs具有较高的钙离子(Ca2+)通透性，

细胞内升高的Ca2+可作为第二信使参与介导α7nAChRs对大脑神经递质传递、

认知、学习和神经保护等功能的调控[5-7] 。钙调蛋白(CaM)是一种能与钙结合而

调节细胞功能作用的蛋白质，CaM本身无酶活性，无Ca2+时也无生物学活性；

但在与胞内Ca2+结合后，CaM暴露出疏水区与依赖于CaM的靶标酶结合，发挥

调节酶的作用；不同浓度的Ca2+可与CaM上不同的结合位点结合而影响酶的活

性[8]。α7nAChRs激动剂(PNU)对α7nAChRs具有高度选择性，可以选择性的激

活α7nAChRs[9]。本研究使用SD大鼠星形胶质细胞(这种细胞在病理状态下可从

静息状态下激活，可局限、分解、吞噬病变的神经元，维护细胞微环境，如转运兴

奋性氨基酸、清除自由基、对神经元发挥保护作用[1])，采用PNU激活SD大鼠

星形胶质细胞中的α7nAChRs，观察CaM蛋白水平的变化。

1.1 材料及试剂

α7nAChRs激活剂PNU 282987和阻断剂MLA均购于美国Sigma公司，胎牛血

清及DMEM培养基购于美国Gibco公司，DMSO购自美国Sigma公司，青-链

霉素及胰蛋白酶购于美国Hyclone公司，兔抗CaM Calmodulin单克隆抗体购自

美国Abcam公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔、抗鼠二抗、鼠抗β-肌动

蛋白β-actin单克隆抗体、抗体稀释液以及封闭液、聚丙烯酰胺凝胶购自碧云天

公司；ECL plus 试剂及聚乙烯二氟 (PVDF) 膜购于美国Milliporo公司，BCA蛋

白浓度测定试剂盒购自美国Thermo公司，高效显影胶片、显影液以及定影液购

自柯达公司。

1.2 方法

1.2.1 原代星形胶质细胞的培养及传代参考文献[9]的方法，取24～48 h的新生乳

鼠(由贵州医科大学动物实验中心提供)大脑皮质剪成泥状，加入DMEM(含青霉素

100 000 U/L、链霉素100 000 U/L、10%FBS)吹打成细胞悬液，接种至培养瓶，

5% CO2、37 ℃恒温培养箱培养(中途换液)至细胞铺满培养瓶底部(约8 d)，纯化

并传3～4代。

1.2.2 分组及处理将第3～4代星形胶质细胞分为正常对照组(对照组)、PNU处理

组(PNU组)和MLA联合PNU处理组(联合组)，对照组不加PNU和MLA处理，

PNU组以1、5及10 μmol/L PNU处理星形胶质细胞6 、12、18及24 h；联合

组以0.05、 0.1 及0.15 μmol/L浓度的MLA预先处理星形胶质细胞2 h后，选

择加入上调CaM蛋白表达水平最高的PNU浓度和最佳时间(PNU组筛选后所得)

处理细胞。

1.2.3 CaM蛋白表达将处理好的细胞用细胞裂解液裂解(100 μL/孔)，4 ℃离心30

min后提取蛋白质，用蛋白印迹(Western-Blot)方法检测CaM的表达水平。采用

12% SDS-PAGE电泳分离5 μg蛋白样品，分离后转移至PVDF膜，5%牛奶室温

封闭1 h，TBS-T漂洗，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜，TBS-T漂洗后加入辣根过

氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，TBS-T漂洗后ECL显影，暗室压片曝光。以

Image J软件处理图像，以β-actin蛋白条带作为内参照，计算CaM蛋白与β-

actin蛋白条带像素灰度的百分比作为CaM蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学分析

所有数据用SPSS 22.0统计软件处理，数据用均数±标准差表示，数据比较采用单

因素方差分析(one way ANOVA)，两两比较采用t检验， P<0.05为差异有统计

学意义。

2.1 PNU显著上调CaM蛋白表达水平

与对照组比较，1、5及10 μmol/L PNU 刺激星形胶质细胞6、12、18及24 h

可使CaM蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；加入PNU 5 μmol/L

培养12 h后，上调作用最明显，见图1。

2.2 MLA阻断后CaM蛋白表达水平

以0.05、0.1及0.15 μmol/L浓度的α7nAChRs阻断剂MLA预先处理星形胶质

细胞2 h后，再加入PNU 5 μmol/L培养12 h，与同浓度、同时段PNU组比较，

CaM蛋白的表达受到抑制，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

Aβ的聚集和沉积是AD发病机制中的核心机制，可导致患者的记忆和认知功能障

碍[10]。Aβ的聚集和沉积还能够激活星形胶质细胞释放细胞炎性因子而导致脑内

的神经炎症[11]。阻止Aβ的聚集及其发生和发展，对防治AD具有一定的作用。

星形胶质细胞在中枢神经系统具有支持和隔离、调节细胞离子浓度、调节神经递质

的释放、营养修复、抗氧化、形成和维持血脑屏障等多种生理功能[12-13]。活化

的星形胶质细胞能够对Aβ进行有效的吞噬和降解。神经型尼古丁受体广泛分布于

中枢神经系统，α7nAChRs在皮层神经元中高表达而且是其中较为特殊的亚型，

激活的α7nAChRs 除参与多种生理调节外，还对改善神经退行性疾病，特别是

AD的学习和认知障碍具有一定的作用[14-15] 。但有关星形胶质细胞中

α7nAChRs的功能，特别是调控星形胶质细胞对Aβ 聚集和沉积的研究，目前未

见报道。激活的α7nAChRs能够直接或者通过激活下游的肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)

受体，引起肌浆网库内的Ca2+释放，使细胞内的Ca2+浓度升高，升高的Ca2+

浓度作为第二信使参与介导α7nAChRs对大脑神经递质传递、认知、学习和神经

保护等功能的调控[16]。CaM在结构上具有高度的灵活性，是一种能与Ca2+结

合后起着调节细胞功能作用的蛋白质。

本研究采用PNU刺激星形胶质细胞激活α7nAChRs后，观察其对CaM蛋白表达

的影响。结果发现PNU刺激星形胶质细胞后，能上调CaM蛋白表达。这可能与

激活α7nAChRs能够直接或者通过激活其下游的IP3受体，引起肌浆网库内的

Ca2+释放，使细胞内的Ca2+浓度升高有关。本研究还发现MLA和PNU联合处

理星形胶质细胞后，发现PNU上调的CaM蛋白表达的效应能被α7nAChRs的特

异阻断剂MLA 所抑制；说明PNU是通过星形胶质细胞上的α7nAChRs活性而上

调 CaM 蛋白的表达水平。而星形胶质细胞α7nAChRs通过哪些细胞内信号通路，

对CaM表达进行调控，有待进一步研究。

综上，在激活星形胶质细胞中α7nAChRs后，CaM蛋白表达水平升高，说明

CaM 蛋白可能是抑制Aβ聚集的一个重要环节。这将为α7nAChRs抑制Aβ聚集

提供新的思路和靶点。

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