2024年4月26日发(作者：茂听安)
)436)
重庆医科大学学报2003年第28卷第4期(.28No.4)
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04
大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定
李 静,王亚平
(重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆 400016)
=摘 要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。方法:分
离获取大鼠骨髓细胞,在60%DMEM培养液,20%马血清,20%(v/v)L
929
培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天
时获得纯度较高的贴壁细胞。采用倒置显微镜下观察生活状态、Wrightcs染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态
学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染
色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且
具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD
68
。结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨
髓巨噬细胞的方法。
=关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定
=中国图书分类法分类号>R32.43 =文献标识码>A =收稿日期>2002-09-24
Methodologyofseparation,purification,cultivationand
identificationofratbonemarrowmacrophage
LIJing,etal
(DepartmentofHistologyandEmbryology,CollegeofBasicMedicalSciences,ChongqingMedicalUniversity)
=Abstract> Objective:Tostudythebiologicalfunctionsofbonemarrowmacrophage(BMM5)andtoestablishthemethodologyof
separation,purification,s:Usingthetechniquesofanchorage-dependentcultureof
separatedratbonemarrowcell(rBMC)inDMEMculturemedia(contain20%horseserum,20%(v/v)L
929
conditionedmedia)in
vitro,alotofpurifiedanchorcellswereobtained,andthesecellswereidentifiedwithspecificallybiologicalmarkerofmacrophage,
suchas1,morphologicalobservation:invertphasecontrastmicroscopy,lightandelectronmicroscopy;2,enzymecytochemistry:acid
phosphatase(ACP),A-aceticacidnaphtholesterase(A-ANE);3,phagocyticexperiment:phagocytosisofchickenerythrocytesand
preparedChineseink;4,immunocytochemistry:surfacespecificantigenofmacrophage(CD
68
stain).Results:Thecellswerepurified
havingfunctionalsatisfactorymacrophageaccordingtomorphologicalobservation,enzymecytochemistry,phagocyticexperimentand
sion:Thisisasimpleandeasymethodforseparation,purification,cultivationandidentificationofrat
marrowmacrophage.
=Keywords>Bonemarrowmacrophage;Separation;Purification;Identification
巨噬细胞是机体的重要防御细胞。大量研究已
证明
[1,2]
,巨噬细胞在吞噬与清除异物和衰老死亡
细胞、分泌生物活性物质,调节血细胞生成与参与免
疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用。深入研究
巨噬细胞的生物学功能不仅能阐述诸多生理与病理
生理学机理,而且对临床相关疾病的治疗也有重要
价值。深入探讨巨噬细胞生物学功能的前提或核心
作者介绍:李 静(1973- ),女,讲师,硕士,
主要研究方向:血细胞发生及其调控机理。
问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞。尽管
国内外不少文献报道
[3,4]
已能从多种组织和器官中
分离、纯化巨噬细胞,但这些方法十分繁琐、复杂,且
所需时间较长,耗资较大。为研究一种既简便又经
济的巨噬细胞分离与纯化的方法,我们通过诱导骨
髓细胞分化,成功的建立了骨髓巨噬细胞的分离、纯
化、培养和鉴定方法,为研究巨噬细胞的生物学功能
奠定了基础。
重庆医科大学学报2003年第28卷第4期(.28No.4)
)437)
黑色沉淀为酯酶阳性,浆内无沉淀者为阴性。光镜下每张载
1 材料与方法
1.1 大鼠骨髓细胞(ratbonemarrowcell,rBMC)
8~12周龄Wistar大鼠,雄性和雌性各半,体重200~
250g(重庆医科大学实验动物中心提供)。断头处死,消毒条
件下,取出完整股骨,用7号针头在股骨的两端打孔,RPMI
-1640培养液冲出全部骨髓细胞,过4号针头制成单细胞
悬液,离心洗涤后,计数BMC数,调整细胞至所需浓度。
1.2 L
929
培养上清(L
929
conditionedmedia,L
929
-CM)制备
L
929
细胞株(本校肝炎研究所提供)在含10%小牛血清,
青链霉素(100U/ml)的RPMI-1640培养液中常规培养3
天,收集上清液,离心,-20e冰箱保存备用。
1.3 大鼠骨髓巨噬细胞的分离、培养
取大鼠骨髓细胞(rBMC),用含20%马血清,20%L
929
-
CM(v/v)的DMEM培养液调整细胞浓度为1@10
6
/ml,按
4ml/孔接种于无菌六孔塑料培养板中(先在培养板孔内放置
2.5cm@2cm的长方形血盖片),置37e、含5%CO
2
培养箱
中培养4天,换液去除悬浮细胞,继续加入同种培养液培养
3天后,可见培养板底部血盖片上逐步铺满了椭圆形的细
胞。
1.4 培养细胞的形态学检查
1.4.1 倒置显微镜观察 在种植BMC后的1~4天分别观
察贴壁细胞形态。
1.4.2 光学显微镜检查 取已铺满细胞的血盖片,清水冲
洗去掉表面的悬浮细胞,晾干后进行Wrightcs染色,光学显
微镜下观察。
1.4.3 电子显微镜检查 用橡皮刮将血盖片上的细胞刮
下,离心洗涤后,用2.5%戊二醛固定。按常规方法制备半
薄切片、超薄切片,H600型透射电子显微镜观察、摄片。
1.5 细胞吞噬功能检测
1.5.1 墨汁吞噬试验
[5]
待贴壁细胞铺满皿底时,在培养
体系中加入10%墨汁0.05ml,培养箱中孵育3h,取出血盖
片,用等渗液洗去悬浮的墨汁颗粒,晾干,Wrightcs染色,镜
下计数200个细胞,计算其吞噬率及吞噬指数。
1.5.2 鸡红细胞吞噬试验
[6]
待贴壁细胞铺满皿底时,在
培养体系中加入鸡红细胞悬液0.1ml,培养箱中孵育1~3.5h,
取出血盖片,用等渗液洗去浮在上面的红细胞,晾干,
Wrightc染色。油镜下计数200个细胞,记录吞有鸡红细胞
的细胞数,并鉴定吞噬级别、吞噬指数、吞噬率。
1.6 细胞的酶化学检测
1.6.1 酸性磷酸酶染色
[7]
按Gomori硫化铅染色法进行,
阳性反应为棕黄色或棕黑色颗粒或片块状沉淀,定位于细胞
胞浆中。光镜下每张载片计数200个细胞,计数5张载片,
求出阳性率。
1.6.2 A-醋酸萘酚酯酶染色(A-ANE)
[5]
细胞浆内有棕
片计数200个细胞,计数5张载片,求出阳性率。
1.7 免疫细胞化学检测CD
68
表达
采用SP免疫细胞化学法检测细胞表面标志CD
68
的表
达。并设置不加一抗的阴性对照。阳性细胞染色位于细胞
膜,呈棕黄色颗粒状。在光镜下每张载片计数300个细胞,
计算CD
68
表达阳性细胞。
1.8 实验数据的统计学处理
所获实验数据均输入计算机,经SAS统计软件进行直
线相关回归分析,方差分析和t检验。
2 结 果
2.1 培养细胞的形态学观察
培养48h后,可观察到呈椭圆形、三角形或不规
则形的贴壁细胞,胞浆丰富,6~7天时,细胞贴满培
养板底的血盖片,细胞呈星形,有许多伪足和突起。
Wrightcs染色光镜观察,可见细胞形状多样,界
限清楚,有钝圆形突起。胞浆丰富,富含颗粒及少许
空泡。核为卵圆形、肾形或不规则形,偏居于细胞的
一端,着色较深,异染色质颗粒分散在核内或依附在
核膜的内面,有1~2个核仁(图1)。
图1 骨髓巨噬细胞(瑞氏染色,@400)
图2 骨髓巨噬细胞(@600)
2024年4月26日发(作者：茂听安)
)436)
重庆医科大学学报2003年第28卷第4期(.28No.4)
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04
大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定
李 静,王亚平
(重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆 400016)
=摘 要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。方法:分
离获取大鼠骨髓细胞,在60%DMEM培养液,20%马血清,20%(v/v)L
929
培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天
时获得纯度较高的贴壁细胞。采用倒置显微镜下观察生活状态、Wrightcs染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态
学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染
色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且
具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD
68
。结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨
髓巨噬细胞的方法。
=关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定
=中国图书分类法分类号>R32.43 =文献标识码>A =收稿日期>2002-09-24
Methodologyofseparation,purification,cultivationand
identificationofratbonemarrowmacrophage
LIJing,etal
(DepartmentofHistologyandEmbryology,CollegeofBasicMedicalSciences,ChongqingMedicalUniversity)
=Abstract> Objective:Tostudythebiologicalfunctionsofbonemarrowmacrophage(BMM5)andtoestablishthemethodologyof
separation,purification,s:Usingthetechniquesofanchorage-dependentcultureof
separatedratbonemarrowcell(rBMC)inDMEMculturemedia(contain20%horseserum,20%(v/v)L
929
conditionedmedia)in
vitro,alotofpurifiedanchorcellswereobtained,andthesecellswereidentifiedwithspecificallybiologicalmarkerofmacrophage,
suchas1,morphologicalobservation:invertphasecontrastmicroscopy,lightandelectronmicroscopy;2,enzymecytochemistry:acid
phosphatase(ACP),A-aceticacidnaphtholesterase(A-ANE);3,phagocyticexperiment:phagocytosisofchickenerythrocytesand
preparedChineseink;4,immunocytochemistry:surfacespecificantigenofmacrophage(CD
68
stain).Results:Thecellswerepurified
havingfunctionalsatisfactorymacrophageaccordingtomorphologicalobservation,enzymecytochemistry,phagocyticexperimentand
sion:Thisisasimpleandeasymethodforseparation,purification,cultivationandidentificationofrat
marrowmacrophage.
=Keywords>Bonemarrowmacrophage;Separation;Purification;Identification
巨噬细胞是机体的重要防御细胞。大量研究已
证明
[1,2]
,巨噬细胞在吞噬与清除异物和衰老死亡
细胞、分泌生物活性物质,调节血细胞生成与参与免
疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用。深入研究
巨噬细胞的生物学功能不仅能阐述诸多生理与病理
生理学机理,而且对临床相关疾病的治疗也有重要
价值。深入探讨巨噬细胞生物学功能的前提或核心
作者介绍:李 静(1973- ),女,讲师,硕士,
主要研究方向:血细胞发生及其调控机理。
问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞。尽管
国内外不少文献报道
[3,4]
已能从多种组织和器官中
分离、纯化巨噬细胞,但这些方法十分繁琐、复杂,且
所需时间较长,耗资较大。为研究一种既简便又经
济的巨噬细胞分离与纯化的方法,我们通过诱导骨
髓细胞分化,成功的建立了骨髓巨噬细胞的分离、纯
化、培养和鉴定方法,为研究巨噬细胞的生物学功能
奠定了基础。
重庆医科大学学报2003年第28卷第4期(.28No.4)
)437)
黑色沉淀为酯酶阳性,浆内无沉淀者为阴性。光镜下每张载
1 材料与方法
1.1 大鼠骨髓细胞(ratbonemarrowcell,rBMC)
8~12周龄Wistar大鼠,雄性和雌性各半,体重200~
250g(重庆医科大学实验动物中心提供)。断头处死,消毒条
件下,取出完整股骨,用7号针头在股骨的两端打孔,RPMI
-1640培养液冲出全部骨髓细胞,过4号针头制成单细胞
悬液,离心洗涤后,计数BMC数,调整细胞至所需浓度。
1.2 L
929
培养上清(L
929
conditionedmedia,L
929
-CM)制备
L
929
细胞株(本校肝炎研究所提供)在含10%小牛血清,
青链霉素(100U/ml)的RPMI-1640培养液中常规培养3
天,收集上清液,离心,-20e冰箱保存备用。
1.3 大鼠骨髓巨噬细胞的分离、培养
取大鼠骨髓细胞(rBMC),用含20%马血清,20%L
929
-
CM(v/v)的DMEM培养液调整细胞浓度为1@10
6
/ml,按
4ml/孔接种于无菌六孔塑料培养板中(先在培养板孔内放置
2.5cm@2cm的长方形血盖片),置37e、含5%CO
2
培养箱
中培养4天,换液去除悬浮细胞,继续加入同种培养液培养
3天后,可见培养板底部血盖片上逐步铺满了椭圆形的细
胞。
1.4 培养细胞的形态学检查
1.4.1 倒置显微镜观察 在种植BMC后的1~4天分别观
察贴壁细胞形态。
1.4.2 光学显微镜检查 取已铺满细胞的血盖片,清水冲
洗去掉表面的悬浮细胞,晾干后进行Wrightcs染色,光学显
微镜下观察。
1.4.3 电子显微镜检查 用橡皮刮将血盖片上的细胞刮
下,离心洗涤后,用2.5%戊二醛固定。按常规方法制备半
薄切片、超薄切片,H600型透射电子显微镜观察、摄片。
1.5 细胞吞噬功能检测
1.5.1 墨汁吞噬试验
[5]
待贴壁细胞铺满皿底时,在培养
体系中加入10%墨汁0.05ml,培养箱中孵育3h,取出血盖
片,用等渗液洗去悬浮的墨汁颗粒,晾干,Wrightcs染色,镜
下计数200个细胞,计算其吞噬率及吞噬指数。
1.5.2 鸡红细胞吞噬试验
[6]
待贴壁细胞铺满皿底时,在
培养体系中加入鸡红细胞悬液0.1ml,培养箱中孵育1~3.5h,
取出血盖片,用等渗液洗去浮在上面的红细胞,晾干,
Wrightc染色。油镜下计数200个细胞,记录吞有鸡红细胞
的细胞数,并鉴定吞噬级别、吞噬指数、吞噬率。
1.6 细胞的酶化学检测
1.6.1 酸性磷酸酶染色
[7]
按Gomori硫化铅染色法进行,
阳性反应为棕黄色或棕黑色颗粒或片块状沉淀,定位于细胞
胞浆中。光镜下每张载片计数200个细胞,计数5张载片,
求出阳性率。
1.6.2 A-醋酸萘酚酯酶染色(A-ANE)
[5]
细胞浆内有棕
片计数200个细胞,计数5张载片,求出阳性率。
1.7 免疫细胞化学检测CD
68
表达
采用SP免疫细胞化学法检测细胞表面标志CD
68
的表
达。并设置不加一抗的阴性对照。阳性细胞染色位于细胞
膜,呈棕黄色颗粒状。在光镜下每张载片计数300个细胞,
计算CD
68
表达阳性细胞。
1.8 实验数据的统计学处理
所获实验数据均输入计算机,经SAS统计软件进行直
线相关回归分析,方差分析和t检验。
2 结 果
2.1 培养细胞的形态学观察
培养48h后,可观察到呈椭圆形、三角形或不规
则形的贴壁细胞,胞浆丰富,6~7天时,细胞贴满培
养板底的血盖片,细胞呈星形,有许多伪足和突起。
Wrightcs染色光镜观察,可见细胞形状多样,界
限清楚,有钝圆形突起。胞浆丰富,富含颗粒及少许
空泡。核为卵圆形、肾形或不规则形,偏居于细胞的
一端,着色较深,异染色质颗粒分散在核内或依附在
核膜的内面,有1~2个核仁(图1)。
图1 骨髓巨噬细胞(瑞氏染色,@400)
图2 骨髓巨噬细胞(@600)