2024年5月9日发(作者：守俊语)
DOI:10.13995/.11-1802/ts.026139
引用格式:解天慧,石慧.大肠杆菌O157∶H7噬菌体EC-p9的内溶酶和穿孔素的特性预测及克隆表达[J].食品与发酵工业,2021,
47(9):nhui,157∶
H7phageEC-p9[J].FoodandFermentationIndustries,2021,47(9):107-113.
大肠杆菌O157∶H7噬菌体EC-p9的内溶酶和穿孔素的
特性预测及克隆表达
解天慧,石慧
∗
(西南大学食品科学学院,重庆,400715)
摘 要 大肠杆菌O157∶H7是一种常见的能严重威胁公共卫生安全的食源性致病菌,噬菌体及其内溶酶、穿孔
素是新型的抑菌剂。该文利用十聚体寡核苷酸随机引物初步鉴定了噬菌体EC-p9;应用PCR技术获得该噬菌体
的内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的基因;利用生物学信息预测了这2种蛋白的特性;通过大肠杆菌表达体系表达
了这2种蛋白。结果表明,噬菌体EC-p9是dsDNA肌尾科噬菌体,具有“穿孔素-内溶酶”裂解体系。内溶酶Lys
9是一种不含跨膜结构的肽聚糖水解酶。穿孔素Hol9是Ⅲ型穿孔素,仅有1个跨膜结构。内溶酶Lys9和穿孔
导致表达量较少。最终获得了质量浓度为2.49g/L的内溶酶Lys9和0.95g/L的穿孔素Hol9。该研究为开展
内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的抑菌能力以及噬菌体EC-p9的裂解体系的研究奠定了基础。
关键词 大肠杆菌O157∶H7;噬菌体EC-p9;内溶酶Lys9;穿孔素Hol9
素Hol9都能通过大肠杆菌表达体系成功表达,但穿孔素Hol9的表达会对大肠杆菌BL21(DE3)产生毒害作用,
大肠杆菌O157∶H7是肠出血性大肠杆菌中最典
型的一种食源性致病菌,因产生志贺毒素从而引起腹
泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症等疾病,严重时
有可能导致死亡
[1-2]
。但用抗生素控制大肠杆菌
O157∶H7存在争议,因为抗生素可能导致志贺毒素被
大量释放
[3]
。临床实验表明,抗生素治疗可能增加
溶血性尿毒综合症的风险
[3-4]
。另外,抗生素的滥用
寻找新型的抗菌物质刻不容缓。
致使耐药性大肠杆菌O157的数量增加
[3,5]
。因此,
近几年,噬菌体作为一种新型的抑菌剂开始被大
量研究,食源性致病菌的噬菌体被分离,并应用于医
不易保存且不易被人们接受,而具有抑菌作用的内溶
酶和穿孔素能很好地解决这些问题
[8]
。穿孔素和内
溶酶在噬菌体裂解细菌中发挥着重要的作用,“穿孔
素-内溶酶”裂解体系是dsDNA噬菌体经典的裂解系
可降解细菌的肽聚糖并导致细菌死亡
[8,11]
。高效、抑
菌谱宽、不容易产生耐药性等优点使内溶酶开始应用
统
[9-10]
。内溶酶是一种由dsDNA噬菌体编码的酶,
于医疗、食品安全、病原菌检测等各个方面
[8,11-12]
。
疗、食品等多个领域
[3,6-7]
。但噬菌体作为活体病毒,
穿孔素是一种含有跨膜结构的疏水蛋白。在噬菌体
裂解细菌过程中,通过在细胞膜上形成孔径,协助内
溶酶与肽聚糖接触
[13]
。
本实验分离得到1株大肠杆菌O157∶H7噬菌体
EC-p9,通过十聚体寡核苷酸随机引物PCR扩增对该
噬菌体进行初步鉴定,并通过生物信息学对该噬菌体
的内溶酶和穿孔素的生理特征及跨膜结构等进行预
测。最后,用大肠杆菌表达体系获得内溶酶Lys9和
穿孔素Hol9。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株和质粒
O157∶H7噬菌体EC-p9。感受态大肠杆菌Trans1-T1、
BL21(DE3)和载体pEasy-BluntE1,北京全式金生物
1.1.2 试剂与培养基
有限公司。
LB肉汤和TSA培养基,青岛海博生物技术有限
噬菌体为本实验室分离保存的烈性大肠杆菌
公司;氨苄青霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(iso-
基金项目:国家自然科学基金面上项目(32072322);重庆市技术创新与应用发展项目面上项目(cstc2019jscx-msxmX0348);重庆市留学人员创
业创新计划优秀项目(cx2019017);中央高校基本科研业务费重点项目(XDJK2020B043)
收稿日期:2020-11-10,改回日期:2020-12-01
2021年第47卷第9期(总第429期)
第一作者:硕士研究生(石慧副教授为通讯作者,E-mail:shi_hui_1986@)
107
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
propyl-β-
PAGE
IDA
凝胶试剂盒
D-thiogalactopyranoside
,索莱宝生物
IPTG)、咪唑、SDS-
DNA
填料
技术有限公司;Ni-
生物有限公司
Marker,PCR
、胶回收试剂盒
;噬菌体
扩增所用的酶和试剂
、质粒提取试剂盒
DNA提取试剂盒
,
,
北京全式金
、蛋白和
艾德莱生物
有限公司;本研究所用DNA引物的合成和PCR产物
的测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司完
成,DNA引物见表1。其他试剂均为国产分析纯。
表1 本研究所用引物
Table1 Primersinthisstudy
引物名称
208
228
ACGGCCGACC
引物序列(5′-3′)来源
GCTGGGCCGA
[14]
十聚体寡
241GCCCGAGCGG
[14]
核苷酸
270TGCGCGCGGG
[14]
随机引物
272
275
AGCGGGCCAA
[14]
277
CCGGGCAAGC
[14]
AGGAAGGTGC
[14]
CGAACGGCGG
[14]
Lys
Lys9-F
287
ATGGCCATTCTAAAAC本实验室
[14]
Hol
9-RTTAACAGAAACTCTTGTA
Hol9-R
9-FATGGCAGCACCTGAAT
本实验室
TTATTTAGCCCTTCCTAA
本实验室
本实验室
1.
1.
2
2.1
实验方法
用试剂盒提取噬菌体
噬菌体的初步鉴定
EC-p9的DNA,以此为模
板,用引物208、228、242、270、272、275、277和287进
行
min;94
PCR扩增。PCR扩增条件如下:在94
min,
结果
共
,选择条带少且亮
45
℃变性
个循环
1
;
min,34
最后
℃复性1min,72
℃
℃
预变性
延伸
4
2
PCR
72℃
产物进行再次扩增
延伸10min。根据扩增
,将产
物胶回收后进行TA克隆并测序。通过国际生物技
术信
gov
息中心(NCBI)(.
似度最高的噬菌体内溶酶和穿孔素的基因设计噬菌
/)进行相似性比对,确定噬菌体的种类。
nlm.
根据相
nih.
体EC-p9的内溶酶Lys9和穿孔素Hol2的引物。以
噬菌体
(Hol
EC-p9的DNA为模板,Lys9-F
件如下
9-F
:95
和
℃
Hol
预变性
9-R)为引物进行
5min;95℃
PCR
和Lys9-R
变性
扩增
30s,55
。扩增条
℃复
性30s,72℃延伸1min,共30个循环;最后72℃延
1.
伸
2.
10
2
min。
内溶酶
检测
Lys
PCR
9和穿孔素
产物并送往上海生工测序
Hol9特性预测
。
(BLAST)(https:
利用NCBI提供的
进行相似性分析
/
。
/blast.
分别
ncbi.
局域
利用
nlm.
相
ExPASy
nih.
似性
gov
比
ProtParamtool
/Blast.
对工
cgi)
具
108
2021Vol.47No.9(Total429)
tps:
(https:
//npsa-prabi.
//.
ibcp.
org
fr/)
/protparam
和TMHMM
/)、
Server
SOPMA
v.
(
2.
ht-
(http:
0
素和穿孔素的理化特征
//
、
/
二级结构和跨膜结构进行
services/TMHMM/)对内溶
1.
预测
2.3
。
转化
质粒pEASY-Lys9和pEASY-Hol9的构建与
E1和内溶酶
按1∶7的摩尔质量比分别加入质粒
Lys9或穿孔素Hol9的基因,25
pEasy-Blunt
5min。然后加入50μLTrans1-T1感受态细胞
℃
(
反应
冻转化效果最好
刚解
s,
r
立刻置于冰中
)
2
混匀
min。
,冰浴
加入
30
250
min
μL
后
LB
,42
肉汤
℃水浴
,在200
30
IPTG
/min、37
TSA平板
和40
℃的条件下培养
(含
μL
100
20
g/
g
L
/
Amp
LX-gal
1h。
+
)上
混
将
,37
合
8
℃
均
μL
放置
匀。
500
30
并
mmol
涂
min
布
/
后
在
L
取200μL菌液涂布到平板上37℃过夜培养。随机挑
,
取白色的单克隆进行菌落
Blunt
游引物
E1
(Lys
中配套的
9-R或
T7
Hol
promoter
PCR、
9-R)。将验证正确的单克隆经
primer
引物为载体
和目的基因的下
pEasy-
摇瓶培养后提取质粒送到上海生工测序。将测序正确
1.
的质粒转到大肠杆菌BL21(DE3)。
1.
2.
2.
4
4.
挑取含有
1
内溶酶
最佳诱导时间
Lys9的最佳诱导时间和诱导剂浓度
LB(含100g/L
pEASY-Lys
Amp
9的BL21(DE3)到5mL
+
h。按1%的接种量接种到
)中,37
100
℃
mL
,120
的
r/min培养16
Amp
+
~0.6)。
),于
加入终浓度为
37℃,200r/min
1mmol
培养
/L
2
的
~3
LB(
IPTG,
h(OD
含
在
600
100
37
为0.
g/
℃
4
L
200r/min的条件下诱导蛋白表达。诱导过程中每隔
、
12
1h取1mL细菌样本,共8h。取样后,迅速在4℃、
36
000
Loading
μL无菌
r/min
ddH
的条件下离心
2
O重悬,加入
1
4
min。
μL
去除上清液,用
备完成后进行
Buffer混匀并煮沸
SDS-PAGE电泳
3~5
,从而检测不同诱导时
min。
的
待所有样本制
4×SDS-PAGE
1.
间对内溶酶
2.4.2 最佳
Lys
IPTG
9表达的影响
诱导浓度
。
(DE3
在
mmol
)
OD
中,
600
分
为
别
0.
加
4~
入
0.
终
6
浓
含有
度为
pEASY-Lys
0.1、0.
9
5、
的
1、
BL21
2、5
培养5
/L
h。
的IPTG,
每个浓度取
并在37
1mL
℃,200
细菌样本
r/min
,
的条件下振动
按1.2.3.1小
节的方法制备
PAGE
SDS-PAGE电泳上样液,并进行SDS-
Lys9表达的影响
电泳,从而检测不同浓度的诱导剂对内溶酶
。
1.2.5 穿孔素Hol9的诱导表达
的作用
1.2.5.1 穿孔素Hol9表达对大肠杆菌BL21(DE3)
的LB(含100g/LAmp
+
)中,37℃,120r/min培养
g/LAmp
+
),37℃培养5h(OD
600
为0.4~0.6),加入
终浓度为1mmol/L的IPTG。在37℃,200r/min的
条件下振动培养。在诱导过程中每隔20min取菌液
样品,并测定菌液OD
600
值,共测定2h。根据细菌生
长曲线的变化趋势,确定穿孔素Hol9最佳表达时间
1.2.5.2 最佳IPTG诱导浓度
并且描述Hol9表达对细菌生长速度的影响。
在OD
600
值为0.4~0.6,含有pEASY-Hol9的
挑取含有pEASY-Hol9的BL21(DE3)到5mL
将超声破碎后的产物在4℃、13000r/min下离心1
h,上清液用0.45μm的滤膜过滤。将5mLNi-NTA
填料装入柱子中,用25mLTris-NaCl缓冲液平衡柱
子;将过滤后的上清液加入柱子,填料重悬,上清液自
然流出并收集穿透液。再用25mLTris-NaCl缓冲液
清洗柱子并收集洗涤液后,分别用50mL20mmol/L
和50mmol/L的咪唑洗脱杂蛋白,并收集洗脱液。分
别用10mL200mmol/L和500mmol/L的咪唑洗脱
目的蛋白。将纯化好的目的蛋白用0.22μm的滤膜
过滤后加入20%的甘油,保存于-20℃,并进行
SDS-PAGE检测。用微量紫外分光光度计检测蛋白
浓度。
16h。按1%的接种量接种到100mL的LB(含100
BL21(DE3)中,按1.2.3.2小节的方法检测不同浓
度IPTG对穿孔素Hol9表达的影响。其中诱导时间
1.2.6 重组蛋白的纯化
为30min,其他条件不变。
按最佳诱导条件表达内溶酶Lys9和穿孔素Hol
2 实验结果
2.1 噬菌体的初步鉴定
如图1-b所示,用引物270扩增PCR产物的条带
少且亮,将产物再次进行PCR扩增,产物如图1-c所
示。最终回收到一段700~800bp的DNA片段,克
隆测序并将序列通过Blasts工具对比,结果显示,噬
81.20%。根据EscherichiaphagePE37内溶酶和穿
孔素的核苷酸序列设计引物,调取噬菌体EC-p9的
内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的核苷酸序列,获得长
度分别为800和700bp左右的PCR产物,见图1-d。
菌体EC-p9与大肠杆菌噬菌体PE37相识度最高为
9,诱导表达的菌液总体积为400mL。诱导结束后,
于8000r/min离心10min,收集细菌沉淀。细菌沉
HCl,500mmol/LNaCl,pH7.5)重悬,并在冰浴条件
淀用100mL无菌Tris-NaCl缓冲液(50mmol/LTris-
下超声破菌(120W,工作3s,间歇10s,共10min)。
图1 琼脂糖凝胶电泳检测噬菌体EC-p9的DNA(a)、噬菌体的随机引物扩增的PCR产物(b)、
Fig.1 EC-p9DNA(a),PCRproductsofrandomprimeramplificationofphage(b),PCRproducts
注:M为marker;图a中,1和2为DNA。图b中,1、2、3、4、5、6、7和8分别为引物208、228、241、270、272、275、277和287的产物;
图c中,1为引物270的PCR再扩增产物;图d中,1和2分别穿孔素Hol9和内溶酶Lys9的基因片段
引物270的在扩增后的PCR产物(c)和噬菌体内溶酶和穿孔素的PCR产物(d)
by270primer(c)andPCRproductsofLys9andHol9(d)byagarosegelelectrophoresis
2.2 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的特性预测
二级结构预测
2.2.1 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的理化性质和
利用ExPASyProtParamtool预测内溶酶Lys9和
穿孔素Hol9的特性,如表2所示。利用SOPMA内
溶酶Lys9和穿孔素Hol9的二级结构,内溶酶Lys9
的α-螺旋、β-折叠、延长链、β-转角和无规则卷曲分
别占氨基酸总数的54.62%、0%、9.62%、8.85%和
2021年第47卷第9期(总第429期)
109
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
36.
β-转角和无规则卷曲分别占氨基酸总数的
92%。穿孔素Hol9的α-螺旋、β-折叠、延长链、
0%、13.43%、5.09%和37.04%。
44.44%、
表2 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的理化性质
Table2 Thephysicochemicalpropertiesof
endolysinLys9andholinHol9
项目Hol9Lys9
碱基数/bp652785
氨基酸数216260
分子质量/kDa24.9728.46
等电点8.369.30
不稳定系数44.6924.20
亲水系数-0.17-0.093
2.2.2
利用
内溶酶
Pfam数据库检索
Lys9和穿孔素
,对内溶酶
Hol9的结构域预测
Lys9和穿孔素
的Hol9的结构域进行预测,见图2。结果表明,内溶
酶Lys9具有2个保守的结构域,其中1个为N端酶
活结构域,属于Muraidase家族,能裂解β-1,4-糖苷
键,是N-乙酰胞壁酸酶;另1个为肽聚糖结合域,属
于PG_binding_1家族。穿孔素Hol9含有1个保守
的结构域,属于BacteriophageTholin家族,能破坏细
胞,并传递信息来控制细胞的裂解时间。
图2 内溶酶Lys9(a)和穿孔素Hol9(b)的结构域
Fig.2 Thestructural
holin
domain
Hol
of
9(b)
endolysinLys9(a)and
2.2.3
利用
内溶酶
TMHMM
Lys9
Server
和穿孔素
v.2.0
Hol
对内溶酶
9的跨膜结构预测
Lys9和穿
孔素Hol9的跨膜结构进行预测,见图3。结果显示,
1
内溶酶Lys9没有跨膜结构;穿孔素Hol9在N端
外
~
,
26
在
位氨基酸处于胞内
27~46位氨基酸形成一个跨膜结构
,47~126位氨基酸处于胞
。
2.3 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9质粒的构建
pEASY-Lys
按照1.2.2小节的方法构建重组表达质粒
质粒pEASY-Lys
9和pEASY-Hol
9和pEASY-Hol
9,用菌落
9。结果如图
PCR验证重组
4所
示,PCR产物在700bp(泳道6)和800bp(泳道7、8
和9)左右有明显的条带,这与穿孔素和内溶酶的基
因大小一致,表明获得了表达方向正确的重组表达
质粒。
110
2021Vol.47No.9(Total429)
图3 内溶酶Lys9的跨膜结构(a)和穿孔素
Fig.3
Hol9的跨膜结构(b)
Lys
Transmembrane
9(a)andholin
structure
Hol9
of
(b)
endolysin
图4 琼脂糖凝胶电泳分析质粒(a)和菌落PCR产物(b)
Fig.4 Plasmid
byagarose
(a)and
gel
PCR
electrophoresis
productsofcolony(b)
注:M为marker;图a中,1和2分别为pEASY-Hol9和
pEASY-Lys
PCR产物,7-10
9;图
为内溶酶的白色单克隆的菌落
b中,1-6为穿孔素的白色单克隆的菌落
PCR产物
2.
2.
4
4.1
内溶酶Lys9的表达和纯化
内溶酶
内溶酶
Lys
Lys
9在表达感受态细胞
9最佳诱导条件的确定
BL21(DE3)中
大量表达,在30kDa左右出现明显条带,与预测的内
溶酶Lys9的分子质量一致。不含重组蛋白基因的
空质粒经诱导培养后无法检测到相应的蛋白,因此内
溶酶在含有pEASY-Lys9质粒的BL21(DE3)成功表
达。由图5-a可见,内溶酶的表达量随着诱导时间的
延长而逐渐增加,在诱导5h后表达量到达峰值,因
此最佳诱导时间为5h。由图5-b可见,当IPTG的浓
度在1和2mmol/L时表达量最大,出于经济方面的
考虑将最佳诱导浓度定为1mmol/L。
图5 不同诱导时间(a)和IPTG浓度(b)
对Lys9表达量的影响
concentration
Fig.5 Effect
注:M为marker;
(b)
ofdifferent
图a
on
中
the
:1-9
amount
induced
分别代表诱导时间
of
time
expression
(a)andIPTG
0h
of
到
Lys
8h,
9
其中时间间隔为1h;图b中,1-5分别代表浓度为0.1、0.5、
1、2、5mmol/L的IPTG诱导,6为不含内溶酶Lys9的空质粒
2.4.2
采用
内溶酶
超声
Lys
破碎
9的纯化
(DE3),
法破碎重组大肠杆菌BL21
有液体进行
将获得的沉淀
Lys9主要以可溶性蛋白的形式存在上清液中
SDS-PAGE
、上清液和镍柱纯化收集的所
电泳。如图6所示,内溶酶
33
,且在
200
kDa
mmol
到
/L
26
咪唑大量洗脱
kDa左右出现明显条带
,洗脱液中不含杂蛋白
,目的蛋白被
。
菌后的沉淀
M-marker;1-
;4-上清液的穿过峰
菌体;2-超声破菌后的上清液
;5-缓冲液洗脱峰
;3-超声破
;6-9分别
为浓度为20、50、200、500mmol/L的咪唑洗脱液
图6 内溶酶Lys9的纯化
Fig.6 ThepurificationofendolysinLys9
2.
2.
5
5.1
穿孔素的
穿孔素
Hol
Hol
9
9
表达纯化
BL21(DE3)生长抑制分析
表达对表达感受态大肠杆菌
pEASY-Blunt
将含有
E1
pEASY-Hol
的BL21(
9
DE3)
的BL21
在37
(DE3
℃、200
)和
r
含
/min
有
的条件下培养5h后,OD
在此基础上加入终浓度为
600
值分别为0.411和0.626。
1mmol/L的IPTG诱导穿
孔素表达
BL21(DE3)
。在诱导过程中
的浊度来监测穿孔素对表达蛋白的影
,通过测定表达感受态细胞
响,从而确定表达时间,如图7所示。结果显示,在加
入诱导剂诱导之前
OD
,pEASY-Hol9的BL21(DE3)的
600
值比含有EASY-BluntE1的BL21(DE3)OD
值低
(DE3)
了
诱导
0.2
20
左右
min
;含
后
有
,细菌的浓度最大
pEASY-Hol9质
,
粒
其
的
OD
BL21
600
为0.427。之后随着诱导时间的延长,pEASY-Hol
600
值
9
质粒的BL21(DE3)的OD值逐渐降低,在120min
后低至
(DE3)菌液浓度随着诱导时间的增加而增加
0.280。而含有pEASY-Blunt
600
E1质粒的
。因此
BL21
穿孔素Hol9的最佳表达时间为20min。
,
图7 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的表达对BL21生长的影响
Fig.7 Effect
holin
of
Hol
expression
9ongrowth
ofendolysin
ofBL21
Lys9and
2.
素的纯化
5.2 穿孔素Hol9表达的最佳IPTG浓度和穿孔
图8 不同IPTG浓度对穿孔素Hol9表达量的影响(a)
和穿孔素Hol9的纯化(b)
expression
Fig.8
注:M为
of
Effect
marker;
holin
图
Hol
ofdifferent
a中
9
1-5
(a)
分别代表浓度为
and
IPTG
the
concentrations
purification
0.1、0.
of
on
5、1、2、5
holin
amount
Hol
of
mmol
9
/
(b)
L
的IPTG诱导,6为不含穿孔素Hol9的空质粒;图b中,
1为上清液
20、50、200、500
,2为穿过峰,3
mmol
为洗脱液
/L的咪唑洗脱液
,4-7分别为浓度为
2021年第47卷第9期(总第429期)
111
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
Hol
由图8-a可见,不同浓度的IPTG诱导对穿孔素
表达导致了在分子质量为
9表达量没有明显差异
35
,与空质粒相比穿孔素的
kDa处的蛋白缺失。如
图8-b所示,重组蛋白在26kDa左右出现明显条带,
用200mmol/L咪唑洗涤镍柱时,目的蛋白被大量洗
脱,且洗脱液不含杂蛋白。
2.6 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的浓度测定
利用微量紫外分光光度计对纯化的内溶酶Lys9
和穿孔素Hol9的质量浓度进行测定,内溶酶Lys9
溶液的质量浓度为2.49g/L;穿孔素Hol9溶液的质
量浓度为0.95g/L。
3 讨论
大肠杆菌O157∶H7是一种严重危害公共卫生安
全的食源性致病菌,能在食品加工和贮藏中的相关胁
迫诱导下发生交叉适应,使细菌在后续杀菌或抑菌处
理中得以存活
[15]
人类大肠杆菌的风险
。耐药性大肠杆菌的出现也增加了
。噬菌体内溶酶和穿孔素作为
新型抑菌物质能用于控制对人体健康造成威胁的病
原菌。本研究中,对筛选的噬菌体EC-p9进行了初
步鉴定,发现其与大肠杆菌噬菌体PE37tRNA簇的
相识最高为81.20%。根据NCBI提供的信息可知,
噬菌体PE37属于dsDNA肌尾科噬菌体。因而,噬菌
体EC-p9可能是dsDNA肌尾科噬菌体,其裂解体系
为
dsDNA
“穿孔素-内溶酶”。“穿孔素-内溶酶”裂解体系是
穿孔素和内溶酶作为广谱抑菌剂
噬菌体的经典的裂解系统,如λ
,在控制食源性
和T4等
[16]
。
致病菌中表现出巨大的潜力。YU等
[12]
和SONG
等
[17]
分别研究了内溶酶LysSAP8和穿孔素GH15对
金黄色葡萄球菌抑制能力。本研究利用生物信息学
分析了EC-p9的内溶酶Lys9和穿孔素Hol9。革兰
氏阴性菌噬菌体的内溶酶通常为球形结构,并且缺乏
细胞结合域
[18-20]
具备两个结构域,
。
其催化活性结构域属于
但噬菌体EC-p9的内溶酶
N-乙酰胞
Lys9
壁酸酶,能裂解β-1,4-糖苷键;另外,还具有一个肽聚
糖结合域。穿孔素Hol9是典型Ⅲ型穿孔素
[21]
一个跨膜结构,N端在胞内,C端在胞内,主要作用是
,只有
破坏细胞膜,传递信息,控制噬菌体裂解细菌的时间。
本研究利用大肠杆菌表达体系获得内溶酶Lys9
37
和穿孔素
℃、1mmol
Hol
/
9。
LIPTG
内溶酶
诱导表达
Lys9的最佳表达条件是在
用镍柱纯化获得为2.49mg/mL
5
的内溶酶
h。在该条件下
Lys9
,利
溶
液。但穿孔素Hol9的表达对大肠杆菌BL21(DE3)
112
2021Vol.47No.9(Total429)
具有毒害作用
[18,21]
pEASY-Hol
含有空质粒和
9的大肠杆菌
。在加入IPTG诱导表达前,含有
pEASY-Lys
BL21(
9的BL21(
DE3)
DE3)
的生长速度比
的生长速
度慢。这可能是穿孔素Hol9在不含诱导剂的情况
下少量表达,导致BL21(DE3)裂解死亡。在IPTG表
达20min后菌液浓度达到最高点,因此穿孔素Hol9
的最佳表达时间是20min。且不同浓度的IPTG对穿
孔素Hol9的表达量没有影响。利用镍柱纯化穿孔
9
素
溶液
Hol
。
9获得质量浓度为0.95mg/mL的穿孔素Hol
EC-p9,
总之,本研究利用随机引物初步鉴定了噬菌体
穿孔素,
并利用生物信息学分析该噬菌体的内溶酶和
并成功表达了噬菌体EC-p9的内溶酶和穿
孔素。该研究为后续内溶酶和穿孔素的抑菌特性的
研究以及噬菌体EC-p9的裂解机制的研究奠定了
基础。
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Characteristicspredictionandexpressionofendolysinandholin
157∶H7phageEC-p9
(CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)
XIETianhui,SHIHui
∗
study,phageEC-p9wasidentifiedbyrandomprimerfordecammericoligonucleotide,genesof
nalysis,ultsindicatedthatphageEC-p9wasdsDNAphagewitha“holin-endoly-
endolysinLys9andholinHol9ofthephagewereobtainedthroughPCR,propertiesofthetwoproteinswerepredictedthroughin-silicoa-
sin”ol9wasatypeIIIholinwith
2.49and0.95g/L,ultslaida
foundationforresearchofthebacteriostaticabilityofendolysinLys9andholinHol9,andalsoforinvestigationofthelysissystemof
phageEC-p9.
Keywords 157∶H7;phageEC-p9;endolysinLys9;holinHol9
21(DE3),withyieldof
ABSTRACT EscherichiacoliO157∶,endolysinandho-
2021年第47卷第9期(总第429期)
113
2024年5月9日发(作者：守俊语)
DOI:10.13995/.11-1802/ts.026139
引用格式:解天慧,石慧.大肠杆菌O157∶H7噬菌体EC-p9的内溶酶和穿孔素的特性预测及克隆表达[J].食品与发酵工业,2021,
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大肠杆菌O157∶H7噬菌体EC-p9的内溶酶和穿孔素的
特性预测及克隆表达
解天慧,石慧
∗
(西南大学食品科学学院,重庆,400715)
摘 要 大肠杆菌O157∶H7是一种常见的能严重威胁公共卫生安全的食源性致病菌,噬菌体及其内溶酶、穿孔
素是新型的抑菌剂。该文利用十聚体寡核苷酸随机引物初步鉴定了噬菌体EC-p9;应用PCR技术获得该噬菌体
的内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的基因;利用生物学信息预测了这2种蛋白的特性;通过大肠杆菌表达体系表达
了这2种蛋白。结果表明,噬菌体EC-p9是dsDNA肌尾科噬菌体,具有“穿孔素-内溶酶”裂解体系。内溶酶Lys
9是一种不含跨膜结构的肽聚糖水解酶。穿孔素Hol9是Ⅲ型穿孔素,仅有1个跨膜结构。内溶酶Lys9和穿孔
导致表达量较少。最终获得了质量浓度为2.49g/L的内溶酶Lys9和0.95g/L的穿孔素Hol9。该研究为开展
内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的抑菌能力以及噬菌体EC-p9的裂解体系的研究奠定了基础。
关键词 大肠杆菌O157∶H7;噬菌体EC-p9;内溶酶Lys9;穿孔素Hol9
素Hol9都能通过大肠杆菌表达体系成功表达,但穿孔素Hol9的表达会对大肠杆菌BL21(DE3)产生毒害作用,
大肠杆菌O157∶H7是肠出血性大肠杆菌中最典
型的一种食源性致病菌,因产生志贺毒素从而引起腹
泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症等疾病,严重时
有可能导致死亡
[1-2]
。但用抗生素控制大肠杆菌
O157∶H7存在争议,因为抗生素可能导致志贺毒素被
大量释放
[3]
。临床实验表明,抗生素治疗可能增加
溶血性尿毒综合症的风险
[3-4]
。另外,抗生素的滥用
寻找新型的抗菌物质刻不容缓。
致使耐药性大肠杆菌O157的数量增加
[3,5]
。因此,
近几年,噬菌体作为一种新型的抑菌剂开始被大
量研究,食源性致病菌的噬菌体被分离,并应用于医
不易保存且不易被人们接受,而具有抑菌作用的内溶
酶和穿孔素能很好地解决这些问题
[8]
。穿孔素和内
溶酶在噬菌体裂解细菌中发挥着重要的作用,“穿孔
素-内溶酶”裂解体系是dsDNA噬菌体经典的裂解系
可降解细菌的肽聚糖并导致细菌死亡
[8,11]
。高效、抑
菌谱宽、不容易产生耐药性等优点使内溶酶开始应用
统
[9-10]
。内溶酶是一种由dsDNA噬菌体编码的酶,
于医疗、食品安全、病原菌检测等各个方面
[8,11-12]
。
疗、食品等多个领域
[3,6-7]
。但噬菌体作为活体病毒,
穿孔素是一种含有跨膜结构的疏水蛋白。在噬菌体
裂解细菌过程中,通过在细胞膜上形成孔径,协助内
溶酶与肽聚糖接触
[13]
。
本实验分离得到1株大肠杆菌O157∶H7噬菌体
EC-p9,通过十聚体寡核苷酸随机引物PCR扩增对该
噬菌体进行初步鉴定,并通过生物信息学对该噬菌体
的内溶酶和穿孔素的生理特征及跨膜结构等进行预
测。最后,用大肠杆菌表达体系获得内溶酶Lys9和
穿孔素Hol9。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株和质粒
O157∶H7噬菌体EC-p9。感受态大肠杆菌Trans1-T1、
BL21(DE3)和载体pEasy-BluntE1,北京全式金生物
1.1.2 试剂与培养基
有限公司。
LB肉汤和TSA培养基,青岛海博生物技术有限
噬菌体为本实验室分离保存的烈性大肠杆菌
公司;氨苄青霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(iso-
基金项目:国家自然科学基金面上项目(32072322);重庆市技术创新与应用发展项目面上项目(cstc2019jscx-msxmX0348);重庆市留学人员创
业创新计划优秀项目(cx2019017);中央高校基本科研业务费重点项目(XDJK2020B043)
收稿日期:2020-11-10,改回日期:2020-12-01
2021年第47卷第9期(总第429期)
第一作者:硕士研究生(石慧副教授为通讯作者,E-mail:shi_hui_1986@)
107
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
propyl-β-
PAGE
IDA
凝胶试剂盒
D-thiogalactopyranoside
,索莱宝生物
IPTG)、咪唑、SDS-
DNA
填料
技术有限公司;Ni-
生物有限公司
Marker,PCR
、胶回收试剂盒
;噬菌体
扩增所用的酶和试剂
、质粒提取试剂盒
DNA提取试剂盒
,
,
北京全式金
、蛋白和
艾德莱生物
有限公司;本研究所用DNA引物的合成和PCR产物
的测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司完
成,DNA引物见表1。其他试剂均为国产分析纯。
表1 本研究所用引物
Table1 Primersinthisstudy
引物名称
208
228
ACGGCCGACC
引物序列(5′-3′)来源
GCTGGGCCGA
[14]
十聚体寡
241GCCCGAGCGG
[14]
核苷酸
270TGCGCGCGGG
[14]
随机引物
272
275
AGCGGGCCAA
[14]
277
CCGGGCAAGC
[14]
AGGAAGGTGC
[14]
CGAACGGCGG
[14]
Lys
Lys9-F
287
ATGGCCATTCTAAAAC本实验室
[14]
Hol
9-RTTAACAGAAACTCTTGTA
Hol9-R
9-FATGGCAGCACCTGAAT
本实验室
TTATTTAGCCCTTCCTAA
本实验室
本实验室
1.
1.
2
2.1
实验方法
用试剂盒提取噬菌体
噬菌体的初步鉴定
EC-p9的DNA,以此为模
板,用引物208、228、242、270、272、275、277和287进
行
min;94
PCR扩增。PCR扩增条件如下:在94
min,
结果
共
,选择条带少且亮
45
℃变性
个循环
1
;
min,34
最后
℃复性1min,72
℃
℃
预变性
延伸
4
2
PCR
72℃
产物进行再次扩增
延伸10min。根据扩增
,将产
物胶回收后进行TA克隆并测序。通过国际生物技
术信
gov
息中心(NCBI)(.
似度最高的噬菌体内溶酶和穿孔素的基因设计噬菌
/)进行相似性比对,确定噬菌体的种类。
nlm.
根据相
nih.
体EC-p9的内溶酶Lys9和穿孔素Hol2的引物。以
噬菌体
(Hol
EC-p9的DNA为模板,Lys9-F
件如下
9-F
:95
和
℃
Hol
预变性
9-R)为引物进行
5min;95℃
PCR
和Lys9-R
变性
扩增
30s,55
。扩增条
℃复
性30s,72℃延伸1min,共30个循环;最后72℃延
1.
伸
2.
10
2
min。
内溶酶
检测
Lys
PCR
9和穿孔素
产物并送往上海生工测序
Hol9特性预测
。
(BLAST)(https:
利用NCBI提供的
进行相似性分析
/
。
/blast.
分别
ncbi.
局域
利用
nlm.
相
ExPASy
nih.
似性
gov
比
ProtParamtool
/Blast.
对工
cgi)
具
108
2021Vol.47No.9(Total429)
tps:
(https:
//npsa-prabi.
//.
ibcp.
org
fr/)
/protparam
和TMHMM
/)、
Server
SOPMA
v.
(
2.
ht-
(http:
0
素和穿孔素的理化特征
//
、
/
二级结构和跨膜结构进行
services/TMHMM/)对内溶
1.
预测
2.3
。
转化
质粒pEASY-Lys9和pEASY-Hol9的构建与
E1和内溶酶
按1∶7的摩尔质量比分别加入质粒
Lys9或穿孔素Hol9的基因,25
pEasy-Blunt
5min。然后加入50μLTrans1-T1感受态细胞
℃
(
反应
冻转化效果最好
刚解
s,
r
立刻置于冰中
)
2
混匀
min。
,冰浴
加入
30
250
min
μL
后
LB
,42
肉汤
℃水浴
,在200
30
IPTG
/min、37
TSA平板
和40
℃的条件下培养
(含
μL
100
20
g/
g
L
/
Amp
LX-gal
1h。
+
)上
混
将
,37
合
8
℃
均
μL
放置
匀。
500
30
并
mmol
涂
min
布
/
后
在
L
取200μL菌液涂布到平板上37℃过夜培养。随机挑
,
取白色的单克隆进行菌落
Blunt
游引物
E1
(Lys
中配套的
9-R或
T7
Hol
promoter
PCR、
9-R)。将验证正确的单克隆经
primer
引物为载体
和目的基因的下
pEasy-
摇瓶培养后提取质粒送到上海生工测序。将测序正确
1.
的质粒转到大肠杆菌BL21(DE3)。
1.
2.
2.
4
4.
挑取含有
1
内溶酶
最佳诱导时间
Lys9的最佳诱导时间和诱导剂浓度
LB(含100g/L
pEASY-Lys
Amp
9的BL21(DE3)到5mL
+
h。按1%的接种量接种到
)中,37
100
℃
mL
,120
的
r/min培养16
Amp
+
~0.6)。
),于
加入终浓度为
37℃,200r/min
1mmol
培养
/L
2
的
~3
LB(
IPTG,
h(OD
含
在
600
100
37
为0.
g/
℃
4
L
200r/min的条件下诱导蛋白表达。诱导过程中每隔
、
12
1h取1mL细菌样本,共8h。取样后,迅速在4℃、
36
000
Loading
μL无菌
r/min
ddH
的条件下离心
2
O重悬,加入
1
4
min。
μL
去除上清液,用
备完成后进行
Buffer混匀并煮沸
SDS-PAGE电泳
3~5
,从而检测不同诱导时
min。
的
待所有样本制
4×SDS-PAGE
1.
间对内溶酶
2.4.2 最佳
Lys
IPTG
9表达的影响
诱导浓度
。
(DE3
在
mmol
)
OD
中,
600
分
为
别
0.
加
4~
入
0.
终
6
浓
含有
度为
pEASY-Lys
0.1、0.
9
5、
的
1、
BL21
2、5
培养5
/L
h。
的IPTG,
每个浓度取
并在37
1mL
℃,200
细菌样本
r/min
,
的条件下振动
按1.2.3.1小
节的方法制备
PAGE
SDS-PAGE电泳上样液,并进行SDS-
Lys9表达的影响
电泳,从而检测不同浓度的诱导剂对内溶酶
。
1.2.5 穿孔素Hol9的诱导表达
的作用
1.2.5.1 穿孔素Hol9表达对大肠杆菌BL21(DE3)
的LB(含100g/LAmp
+
)中,37℃,120r/min培养
g/LAmp
+
),37℃培养5h(OD
600
为0.4~0.6),加入
终浓度为1mmol/L的IPTG。在37℃,200r/min的
条件下振动培养。在诱导过程中每隔20min取菌液
样品,并测定菌液OD
600
值,共测定2h。根据细菌生
长曲线的变化趋势,确定穿孔素Hol9最佳表达时间
1.2.5.2 最佳IPTG诱导浓度
并且描述Hol9表达对细菌生长速度的影响。
在OD
600
值为0.4~0.6,含有pEASY-Hol9的
挑取含有pEASY-Hol9的BL21(DE3)到5mL
将超声破碎后的产物在4℃、13000r/min下离心1
h,上清液用0.45μm的滤膜过滤。将5mLNi-NTA
填料装入柱子中,用25mLTris-NaCl缓冲液平衡柱
子;将过滤后的上清液加入柱子,填料重悬,上清液自
然流出并收集穿透液。再用25mLTris-NaCl缓冲液
清洗柱子并收集洗涤液后,分别用50mL20mmol/L
和50mmol/L的咪唑洗脱杂蛋白,并收集洗脱液。分
别用10mL200mmol/L和500mmol/L的咪唑洗脱
目的蛋白。将纯化好的目的蛋白用0.22μm的滤膜
过滤后加入20%的甘油,保存于-20℃,并进行
SDS-PAGE检测。用微量紫外分光光度计检测蛋白
浓度。
16h。按1%的接种量接种到100mL的LB(含100
BL21(DE3)中,按1.2.3.2小节的方法检测不同浓
度IPTG对穿孔素Hol9表达的影响。其中诱导时间
1.2.6 重组蛋白的纯化
为30min,其他条件不变。
按最佳诱导条件表达内溶酶Lys9和穿孔素Hol
2 实验结果
2.1 噬菌体的初步鉴定
如图1-b所示,用引物270扩增PCR产物的条带
少且亮,将产物再次进行PCR扩增,产物如图1-c所
示。最终回收到一段700~800bp的DNA片段,克
隆测序并将序列通过Blasts工具对比,结果显示,噬
81.20%。根据EscherichiaphagePE37内溶酶和穿
孔素的核苷酸序列设计引物,调取噬菌体EC-p9的
内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的核苷酸序列,获得长
度分别为800和700bp左右的PCR产物,见图1-d。
菌体EC-p9与大肠杆菌噬菌体PE37相识度最高为
9,诱导表达的菌液总体积为400mL。诱导结束后,
于8000r/min离心10min,收集细菌沉淀。细菌沉
HCl,500mmol/LNaCl,pH7.5)重悬,并在冰浴条件
淀用100mL无菌Tris-NaCl缓冲液(50mmol/LTris-
下超声破菌(120W,工作3s,间歇10s,共10min)。
图1 琼脂糖凝胶电泳检测噬菌体EC-p9的DNA(a)、噬菌体的随机引物扩增的PCR产物(b)、
Fig.1 EC-p9DNA(a),PCRproductsofrandomprimeramplificationofphage(b),PCRproducts
注:M为marker;图a中,1和2为DNA。图b中,1、2、3、4、5、6、7和8分别为引物208、228、241、270、272、275、277和287的产物;
图c中,1为引物270的PCR再扩增产物;图d中,1和2分别穿孔素Hol9和内溶酶Lys9的基因片段
引物270的在扩增后的PCR产物(c)和噬菌体内溶酶和穿孔素的PCR产物(d)
by270primer(c)andPCRproductsofLys9andHol9(d)byagarosegelelectrophoresis
2.2 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的特性预测
二级结构预测
2.2.1 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的理化性质和
利用ExPASyProtParamtool预测内溶酶Lys9和
穿孔素Hol9的特性,如表2所示。利用SOPMA内
溶酶Lys9和穿孔素Hol9的二级结构,内溶酶Lys9
的α-螺旋、β-折叠、延长链、β-转角和无规则卷曲分
别占氨基酸总数的54.62%、0%、9.62%、8.85%和
2021年第47卷第9期(总第429期)
109
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
36.
β-转角和无规则卷曲分别占氨基酸总数的
92%。穿孔素Hol9的α-螺旋、β-折叠、延长链、
0%、13.43%、5.09%和37.04%。
44.44%、
表2 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的理化性质
Table2 Thephysicochemicalpropertiesof
endolysinLys9andholinHol9
项目Hol9Lys9
碱基数/bp652785
氨基酸数216260
分子质量/kDa24.9728.46
等电点8.369.30
不稳定系数44.6924.20
亲水系数-0.17-0.093
2.2.2
利用
内溶酶
Pfam数据库检索
Lys9和穿孔素
,对内溶酶
Hol9的结构域预测
Lys9和穿孔素
的Hol9的结构域进行预测,见图2。结果表明,内溶
酶Lys9具有2个保守的结构域,其中1个为N端酶
活结构域,属于Muraidase家族,能裂解β-1,4-糖苷
键,是N-乙酰胞壁酸酶;另1个为肽聚糖结合域,属
于PG_binding_1家族。穿孔素Hol9含有1个保守
的结构域,属于BacteriophageTholin家族,能破坏细
胞,并传递信息来控制细胞的裂解时间。
图2 内溶酶Lys9(a)和穿孔素Hol9(b)的结构域
Fig.2 Thestructural
holin
domain
Hol
of
9(b)
endolysinLys9(a)and
2.2.3
利用
内溶酶
TMHMM
Lys9
Server
和穿孔素
v.2.0
Hol
对内溶酶
9的跨膜结构预测
Lys9和穿
孔素Hol9的跨膜结构进行预测,见图3。结果显示,
1
内溶酶Lys9没有跨膜结构;穿孔素Hol9在N端
外
~
,
26
在
位氨基酸处于胞内
27~46位氨基酸形成一个跨膜结构
,47~126位氨基酸处于胞
。
2.3 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9质粒的构建
pEASY-Lys
按照1.2.2小节的方法构建重组表达质粒
质粒pEASY-Lys
9和pEASY-Hol
9和pEASY-Hol
9,用菌落
9。结果如图
PCR验证重组
4所
示,PCR产物在700bp(泳道6)和800bp(泳道7、8
和9)左右有明显的条带,这与穿孔素和内溶酶的基
因大小一致,表明获得了表达方向正确的重组表达
质粒。
110
2021Vol.47No.9(Total429)
图3 内溶酶Lys9的跨膜结构(a)和穿孔素
Fig.3
Hol9的跨膜结构(b)
Lys
Transmembrane
9(a)andholin
structure
Hol9
of
(b)
endolysin
图4 琼脂糖凝胶电泳分析质粒(a)和菌落PCR产物(b)
Fig.4 Plasmid
byagarose
(a)and
gel
PCR
electrophoresis
productsofcolony(b)
注:M为marker;图a中,1和2分别为pEASY-Hol9和
pEASY-Lys
PCR产物,7-10
9;图
为内溶酶的白色单克隆的菌落
b中,1-6为穿孔素的白色单克隆的菌落
PCR产物
2.
2.
4
4.1
内溶酶Lys9的表达和纯化
内溶酶
内溶酶
Lys
Lys
9在表达感受态细胞
9最佳诱导条件的确定
BL21(DE3)中
大量表达,在30kDa左右出现明显条带,与预测的内
溶酶Lys9的分子质量一致。不含重组蛋白基因的
空质粒经诱导培养后无法检测到相应的蛋白,因此内
溶酶在含有pEASY-Lys9质粒的BL21(DE3)成功表
达。由图5-a可见,内溶酶的表达量随着诱导时间的
延长而逐渐增加,在诱导5h后表达量到达峰值,因
此最佳诱导时间为5h。由图5-b可见,当IPTG的浓
度在1和2mmol/L时表达量最大,出于经济方面的
考虑将最佳诱导浓度定为1mmol/L。
图5 不同诱导时间(a)和IPTG浓度(b)
对Lys9表达量的影响
concentration
Fig.5 Effect
注:M为marker;
(b)
ofdifferent
图a
on
中
the
:1-9
amount
induced
分别代表诱导时间
of
time
expression
(a)andIPTG
0h
of
到
Lys
8h,
9
其中时间间隔为1h;图b中,1-5分别代表浓度为0.1、0.5、
1、2、5mmol/L的IPTG诱导,6为不含内溶酶Lys9的空质粒
2.4.2
采用
内溶酶
超声
Lys
破碎
9的纯化
(DE3),
法破碎重组大肠杆菌BL21
有液体进行
将获得的沉淀
Lys9主要以可溶性蛋白的形式存在上清液中
SDS-PAGE
、上清液和镍柱纯化收集的所
电泳。如图6所示,内溶酶
33
,且在
200
kDa
mmol
到
/L
26
咪唑大量洗脱
kDa左右出现明显条带
,洗脱液中不含杂蛋白
,目的蛋白被
。
菌后的沉淀
M-marker;1-
;4-上清液的穿过峰
菌体;2-超声破菌后的上清液
;5-缓冲液洗脱峰
;3-超声破
;6-9分别
为浓度为20、50、200、500mmol/L的咪唑洗脱液
图6 内溶酶Lys9的纯化
Fig.6 ThepurificationofendolysinLys9
2.
2.
5
5.1
穿孔素的
穿孔素
Hol
Hol
9
9
表达纯化
BL21(DE3)生长抑制分析
表达对表达感受态大肠杆菌
pEASY-Blunt
将含有
E1
pEASY-Hol
的BL21(
9
DE3)
的BL21
在37
(DE3
℃、200
)和
r
含
/min
有
的条件下培养5h后,OD
在此基础上加入终浓度为
600
值分别为0.411和0.626。
1mmol/L的IPTG诱导穿
孔素表达
BL21(DE3)
。在诱导过程中
的浊度来监测穿孔素对表达蛋白的影
,通过测定表达感受态细胞
响,从而确定表达时间,如图7所示。结果显示,在加
入诱导剂诱导之前
OD
,pEASY-Hol9的BL21(DE3)的
600
值比含有EASY-BluntE1的BL21(DE3)OD
值低
(DE3)
了
诱导
0.2
20
左右
min
;含
后
有
,细菌的浓度最大
pEASY-Hol9质
,
粒
其
的
OD
BL21
600
为0.427。之后随着诱导时间的延长,pEASY-Hol
600
值
9
质粒的BL21(DE3)的OD值逐渐降低,在120min
后低至
(DE3)菌液浓度随着诱导时间的增加而增加
0.280。而含有pEASY-Blunt
600
E1质粒的
。因此
BL21
穿孔素Hol9的最佳表达时间为20min。
,
图7 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的表达对BL21生长的影响
Fig.7 Effect
holin
of
Hol
expression
9ongrowth
ofendolysin
ofBL21
Lys9and
2.
素的纯化
5.2 穿孔素Hol9表达的最佳IPTG浓度和穿孔
图8 不同IPTG浓度对穿孔素Hol9表达量的影响(a)
和穿孔素Hol9的纯化(b)
expression
Fig.8
注:M为
of
Effect
marker;
holin
图
Hol
ofdifferent
a中
9
1-5
(a)
分别代表浓度为
and
IPTG
the
concentrations
purification
0.1、0.
of
on
5、1、2、5
holin
amount
Hol
of
mmol
9
/
(b)
L
的IPTG诱导,6为不含穿孔素Hol9的空质粒;图b中,
1为上清液
20、50、200、500
,2为穿过峰,3
mmol
为洗脱液
/L的咪唑洗脱液
,4-7分别为浓度为
2021年第47卷第9期(总第429期)
111
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
Hol
由图8-a可见,不同浓度的IPTG诱导对穿孔素
表达导致了在分子质量为
9表达量没有明显差异
35
,与空质粒相比穿孔素的
kDa处的蛋白缺失。如
图8-b所示,重组蛋白在26kDa左右出现明显条带,
用200mmol/L咪唑洗涤镍柱时,目的蛋白被大量洗
脱,且洗脱液不含杂蛋白。
2.6 内溶酶Lys9和穿孔素Hol9的浓度测定
利用微量紫外分光光度计对纯化的内溶酶Lys9
和穿孔素Hol9的质量浓度进行测定,内溶酶Lys9
溶液的质量浓度为2.49g/L;穿孔素Hol9溶液的质
量浓度为0.95g/L。
3 讨论
大肠杆菌O157∶H7是一种严重危害公共卫生安
全的食源性致病菌,能在食品加工和贮藏中的相关胁
迫诱导下发生交叉适应,使细菌在后续杀菌或抑菌处
理中得以存活
[15]
人类大肠杆菌的风险
。耐药性大肠杆菌的出现也增加了
。噬菌体内溶酶和穿孔素作为
新型抑菌物质能用于控制对人体健康造成威胁的病
原菌。本研究中,对筛选的噬菌体EC-p9进行了初
步鉴定,发现其与大肠杆菌噬菌体PE37tRNA簇的
相识最高为81.20%。根据NCBI提供的信息可知,
噬菌体PE37属于dsDNA肌尾科噬菌体。因而,噬菌
体EC-p9可能是dsDNA肌尾科噬菌体,其裂解体系
为
dsDNA
“穿孔素-内溶酶”。“穿孔素-内溶酶”裂解体系是
穿孔素和内溶酶作为广谱抑菌剂
噬菌体的经典的裂解系统,如λ
,在控制食源性
和T4等
[16]
。
致病菌中表现出巨大的潜力。YU等
[12]
和SONG
等
[17]
分别研究了内溶酶LysSAP8和穿孔素GH15对
金黄色葡萄球菌抑制能力。本研究利用生物信息学
分析了EC-p9的内溶酶Lys9和穿孔素Hol9。革兰
氏阴性菌噬菌体的内溶酶通常为球形结构,并且缺乏
细胞结合域
[18-20]
具备两个结构域,
。
其催化活性结构域属于
但噬菌体EC-p9的内溶酶
N-乙酰胞
Lys9
壁酸酶,能裂解β-1,4-糖苷键;另外,还具有一个肽聚
糖结合域。穿孔素Hol9是典型Ⅲ型穿孔素
[21]
一个跨膜结构,N端在胞内,C端在胞内,主要作用是
,只有
破坏细胞膜,传递信息,控制噬菌体裂解细菌的时间。
本研究利用大肠杆菌表达体系获得内溶酶Lys9
37
和穿孔素
℃、1mmol
Hol
/
9。
LIPTG
内溶酶
诱导表达
Lys9的最佳表达条件是在
用镍柱纯化获得为2.49mg/mL
5
的内溶酶
h。在该条件下
Lys9
,利
溶
液。但穿孔素Hol9的表达对大肠杆菌BL21(DE3)
112
2021Vol.47No.9(Total429)
具有毒害作用
[18,21]
pEASY-Hol
含有空质粒和
9的大肠杆菌
。在加入IPTG诱导表达前,含有
pEASY-Lys
BL21(
9的BL21(
DE3)
DE3)
的生长速度比
的生长速
度慢。这可能是穿孔素Hol9在不含诱导剂的情况
下少量表达,导致BL21(DE3)裂解死亡。在IPTG表
达20min后菌液浓度达到最高点,因此穿孔素Hol9
的最佳表达时间是20min。且不同浓度的IPTG对穿
孔素Hol9的表达量没有影响。利用镍柱纯化穿孔
9
素
溶液
Hol
。
9获得质量浓度为0.95mg/mL的穿孔素Hol
EC-p9,
总之,本研究利用随机引物初步鉴定了噬菌体
穿孔素,
并利用生物信息学分析该噬菌体的内溶酶和
并成功表达了噬菌体EC-p9的内溶酶和穿
孔素。该研究为后续内溶酶和穿孔素的抑菌特性的
研究以及噬菌体EC-p9的裂解机制的研究奠定了
基础。
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(CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)
XIETianhui,SHIHui
∗
study,phageEC-p9wasidentifiedbyrandomprimerfordecammericoligonucleotide,genesof
nalysis,ultsindicatedthatphageEC-p9wasdsDNAphagewitha“holin-endoly-
endolysinLys9andholinHol9ofthephagewereobtainedthroughPCR,propertiesofthetwoproteinswerepredictedthroughin-silicoa-
sin”ol9wasatypeIIIholinwith
2.49and0.95g/L,ultslaida
foundationforresearchofthebacteriostaticabilityofendolysinLys9andholinHol9,andalsoforinvestigationofthelysissystemof
phageEC-p9.
Keywords 157∶H7;phageEC-p9;endolysinLys9;holinHol9
21(DE3),withyieldof
ABSTRACT EscherichiacoliO157∶,endolysinandho-
2021年第47卷第9期(总第429期)
113