2024年5月15日发(作者：招语山)
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２６０・
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００８，Ｖｏ１．１３，Ｎｏ．５
・
论 著・
人端粒相关蛋白ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１的
筛选及其在胃癌细胞中的表达
周 平 房殿春 陈 兵 毛高平 匦ｚ 曹传平一 张启杰 步晓华
中国人民解放军空军总医院消化内科、（１０００３６） 第三军医大学西南医院消化内科２
山东省淄博市中心医院内科３
背景：端粒酶与肿瘤的发生有十分密切的联系，研究与人端粒酶逆转录酶（ｈＴＥＲＴ）相互作用的端粒相关蛋白将
有助于了解端粒酶在肿瘤细胞中的生物学特性和分子机制。目的：筛选新的人端粒相关蛋白，为进一步了解端粒酶
的全酶结构、生物学特性及其作用机制奠定实验基础。方法：采用酵母双杂交技术进行人端粒相关蛋白分子的筛选
构建诱饵融合蛋白表达载体ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ，筛选人睾丸ｃＤＮＡ文库；以蛋白质印迹法测定ＤＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ融合
蛋白的表达。对筛选得到的阳性克隆质粒进行测序，在ＧｅｎＢａｎｋ中行同源性比较。采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ．
ＰＣＲ）检测ｈＴＥＲＴ、ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢｌ ｍＲＮＡ在胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１中的表达。结果：融合蛋白表达载体ＤＧＢＫＴ７一
ｈＴＥＲＴ可在酵母菌株ＡＨ１０９中有效、稳定地表达。ｃＤＮＡ文库筛选获得ＧｅｎＢａｎｋ已收录的人ｃＤＮＡ序列ＨＫＲ３和
ＳＭＡＲＣＢｌ。ｈＴＥＲＴ、ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢｌ ｍＲＮＡ在胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１中表达一致，均呈高表达。结论：ＨＫＲ３、
ＳＭＡＲＣＢｌ是人端粒相关蛋白成员，与ｈＴＥＲＴ有十分密切的联系，可能在胃癌的发生过程中存在相互调节或协同作用。
关键词端粒； 端粒，末端转移酶； 端粒结合蛋白质类； 细胞系，肿瘤； 酵母双杂交技术
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＨＫＲ３，ＳＭＡＲＣＢ１ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｌｌｓ ＺＨＯＵ ＦＡＮＧ Ｄｉａｎｃｈｕｎ，ＣＨＥＮ Ｂｉｎｇ，ＭＡ０ Ｇａｏｐｉｎｇ，ＬＩＵ Ｗｅｉｗｅｎ，ＣＡ０ Ｃｈｕａｎｐｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｑｉｊｉｅ，ＢＵ
Ｘｉａｏｈｕ￣Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ａ ｉｒ Ｆｏｒｃｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈａｓｐｉｔａｌ ｆ ｏＣｈｉｅｓｅｎ ＰＬＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ ａｏｏｏ３６）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｔｏ：ＦＡＮＧ Ｄｉａｎｃｈｕｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ（４０００３８），Ｅｍａｉｈ ｆａｎｇｄｉａｎｃｈｕｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｎ
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｉＳ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ．Ｔｈｅ ｆｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｎｅｗ ｔｅｌｏｍｅｒｅ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｗｈｉｃｈ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ） ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｈｅｌｐｆｕｌ ｆｏｒ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ａｉｍｓ：Ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｅ—
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳＯ ａｓ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ
ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ
ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｅ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂａｉｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｈｕｍａｎ ｔｅｓｔｉｃｌｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ。Ｔｈｅ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．
ｈＴＥＲＴ．
Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ
ＨＫＲ３ ａｎｄ ＳＭＡＲＣＢ １ ｍＲＮＡ ｉｎ ｇａｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｒｌ ｌｉｎｅ ＳＧＣ一７９０１ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ—
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ ｗａｓ ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ
ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ ＡＨ １ ０９．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｈａｄ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＨＫＲ３ ａｎｄ ＳＭＡＲＣＢ １．ｈＴＥＲＴ ａｓ
ｗｅｌｌ ａｓ ＨＫＲ３，ＳＭＡＲＣＢ１ ｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＧＣ一７９０１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＨＫＲ３，
ＳＭＡＲＣＢ １ ａｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｅ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｒｅ ｃｌｏｓｅｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈＴＥＲＴ， ａｎｄ ｍａｙ ｈａｖｅ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｇａｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．ｒ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ；Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ；Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ—Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ．Ｔｕｍｏｒ；Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ—Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ
在肿瘤的发生、发展过程中，端粒酶和端粒相
关蛋白发挥了十分重要的作用１’－４］。因此，以端粒酶
本文通讯作者，第三军医大学西南医院消化内科（４０００３８），
Ｅｍａｉｌ：ｆａｎｇｄｉａｎｃｈｕｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｎ
或端粒相关蛋白为靶向进行肿瘤检测或治疗已成
为肿瘤研究的重点。但端粒酶、端粒相关蛋白在肿
瘤发生过程中的分子机制仍不十分清楚，且目前对
端粒酶组分或与端粒酶作用相关的分子仍存在较
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胃肠病学２００８年第ｌ３卷第５期
多疑问有待解释。为此本研究对人端粒相关蛋白分
的构建和转化：ＥｃｏＲ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ酶切质粒ｐＧＲＮ１４５，
子进行筛选，并对筛选得到的基因在胃癌细胞中的
电洗脱法获得ｈＴＥＲＴ ｃＤＮＡ片段，定向克隆人载
表达进行初步检测，以期为端粒酶作用的分子机制
体ｐＧＢＫＴ７的多克隆位点ＥｃｏＲ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ。采用乙
研究奠定理论基础。
酸锂法将ｐＧＢＫＴ７．ｈＴＥＲＴ以及ｐＧＢＫＴ７、ｐＧＢＫＴ７．
５３、ｐＧＢＫＴ７．Ｌａｍ质粒转化人酵母菌株ＡＨ１０９中，
材料与方法
将ｐＧＡＤＴ７、ｐＧＡＤＴ７．Ｔ、ｐＣＬ．１质粒转化人酵母菌
株Ｙ１８７中。
一
、
材料
３．诱饵融合蛋白表达载体ｐＧＢＫＴ７．ｈＴＥＲＴ的
１．质粒：酵母双杂交系统．３质粒ｐＧＢＫＴ７、
鉴定：以Ｂ．半乳糖苷酶菌落影印滤膜分析检测
ｐＧＢＫＴ７－５３ ｐＧＢＫＴ７－Ｌａｍ ｐＧＡＤＴ７ ｐＧＡＤＴ７－Ｔ
ｐＧＢＫＴ７．ｈＴＥＲＴ是否具有自身激活报告基因ＬａｃＺ
ｐＣＬ．１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司）；真核表达载体质粒ｐｃＤＮＡ３
的作用。将消毒滤膜放在生长有转化菌落的平板
（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；人端粒酶逆转录酶（ｈＴＥＲＴ）ｃＤＮＡ
上，待滤膜浸湿后取出并置于液氮中浸泡１０ ｓ，放
质粒ｐＧＲＮ１４５由Ｇｅｒｏｎ公司惠赠。
在经Ｚ缓冲液，Ｘ．ｇａｌ浸泡的另一滤膜上，室温放
２．菌株：预转化人睾丸ｃＤＮＡ文库的酵母菌
置，记录菌落显色时间（连续观察８ ｈ。阳性呈蓝
株Ｙ１８７、酵母菌株ＡＨ１０９、Ｙ１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司）； 色，阴性无色）。蛋白质印迹法测定ｐＧＢＫＴ７．
大肠杆菌ＤＨ５ｏｔ（第三军医大学分子遗传教研室
ｈＴＥＲＴ融合蛋白的表达。
保存）。 ４．酵母双杂交技术筛选ｃＤＮＡ文库：将ｐＧＢＫＴ７．
３．引物：ｈＴＥＲＴ、ＧＡＰＤＨ和筛选出的人端粒相 ｈＴＥＲＴ转化菌株ＡＨ１０９与人睾丸ｃＤＮＡ文库预转
关蛋白基因引物的设计、合成由上海基康生物技术 化菌株Ｙ１８７混合培养，培养物铺于ＳＤ！．Ａｄｅ／．Ｌｅｕ／
有限公司进行。
．
Ｔｒｐ／．Ｈｉｓ平板上，筛选Ａｄｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ阳性克
４．主要试剂：酵母培养基（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司），Ｔ４
隆，以Ｂ．半乳糖苷酶菌落影印滤膜分析筛选ＬａｃＺ
ＤＮＡ连接酶、质粒提取试剂盒、ＰＶＤＦ膜（Ｒｏｃｈｅ公
阳性克隆。提取、纯化文库质粒，互换酵母菌株后行
司）；Ｔｒｉｐｕｒｅ Ｋｉｔ、逆转录聚合酶链反应（ＲＴ．ＰＣＲ）
酵母交配实验，验证文库质粒和ｈＴＥＲＴ作用的特
Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；Ｘ－ｇａｌ、３－ＡＴ（Ｓｉｇｍａ公司）；限
异性，进一步弃除假阳性。对获得的真阳性克隆质
制性核酸内切酶ＨｉｎｄＩＵ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、
粒进行测序，将其ｃＤＮＡ序列输入计算机，应用
Ｓａｌ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ公司）；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（华 ＢＬＡＳＴ软件与ＧｅｎＢａｎｋ中的所有核酸序列进行同
美生物工程公司）。
源性比较。
５．细胞株：中分化胃腺癌细胞株ＳＧＣ．７９０１
５．胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１中ｈＴＥＲＴ以及筛选
（第三军医大学西南医院全军消化专科中心实验
基因ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１ ｍＲＮＡ的表达：采用ＲＴ．
室保种）。
ＰＣＲ方法进行检测。ＳＧＣ．７９０１细胞在ＤＭＥＭ培养
二、方法
液（含１０％／ｂ牛血清）中于３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度
１．质粒的转化和扩增：采用氯化钙法行质粒 下培养。采用Ｔｒｉｐｕｒｅ法提取细胞总ＲＮＡ。ｈＴＥＲＴ
转化。将ｐＧＢＫＴ７、ｐＧＢＫＴ７．５３、ｐＧＢＫＴ７－Ｌａｍ、
以及筛选出的基因引物序列见表１。ＰＣＲ反应体
ｐＧＡＤＴ７、ｐＧＡＤＴ７一Ｔ、ｐＣＬ－１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＧＲＮ１４５质
系：９４℃５ ｍｉｎ；９４℃４０ ｓ，５６℃５０ ｓ，６８℃６０ Ｓ，
粒转化人大肠杆菌ＤＨ５ｏｔ中。相应抗生素筛选阳性 ￣３５个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ；４℃浸泡。采用２％
克隆，以质粒提取试剂盒纯化质粒后经ＨｉｎｄＩＵ、
琼脂糖凝胶，加入ＰＣＲ产物５ ｌ（以ＧＡＰＤＨ为内
ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ酶切鉴定。
参照）进行电泳，电压５～１０ Ｖ／ｃｍ，电泳２０ ｍｉｎ，紫
２．诱饵融合蛋白表达载体ｐＧＢＫＴ７．ｈＴＥＲＴ
外透射仪下观察。计算机扫描记录。
表１ ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１、ｈＴＥＲＴ和ＧＡＤＰＨ引物序列和扩增片段大小
基因 上游 下游 长度
５’一ＣＧＡ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＡＧ ＧＣＣ ＧＴＡ ＧＡ一３’ ５’一ＧＣＴＴＣＡ ＧＴＴＴＣＣ ＣＡＣ ＡＧＡ ＧＧ一３’
２７６ ｂｐ
５’一ＡＴＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＡＧ ＴＣ一３’
５’一ＴＣＴ ＣＧＣ ＴＧＡ ＡＧＧ ＣＧＴ ＡＧＧ ＴＣ一３’ ２７０ ｂｐ
５’．ＣＧＧ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＴＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＡＡ－３’
５’一ＧＧＡ ＴＧＡ ＡＧＣ ＧＧＡ ＧＴＣ ＴＧＧ Ａ．３’
１４５ ｂｐ
５’．ＣＣＡ ＣＣＣ Ｇ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＡ．３’
５．’ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＧＧ ＴＣＣ ＡＣ－３ ５９８ ｂｐ
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结 果
一
、
酵母双杂交质粒的转化和酶切鉴定
ｐＧＢＫＴ７、ｐＧＢＫＴ７—５３ ｐＧＢＫＴ７一Ｌａｍ ｐＧＡＤＴ７
ｐＧＡＤＴ７一Ｔ、ｐＣＬ一１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＧＲＮ１４５质粒转化人
大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ均筛选出阳性克隆。提取质粒后均
经Ｈｉｎｄ ｍ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ酶切鉴定
证实。
二、诱饵融合蛋白表达载体ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ的
自身激活和表达鉴定
Ｂ一半乳糖苷酶菌落影印滤膜分析检测显示
ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ无自身激活报告基因ＬａｃＺ的作
用，该结果经酵母交配实验进一步证实。重组阳
性菌在分子质量约１４０ ｋＤａ（１ Ｄａ＝０．９９２１ ｕ）处可
见一蛋白条带，与预期融合蛋白分子质量相符。
而宿主菌在同一位置未见有蛋白条带．表明
ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ融合蛋白能在酵母菌株ＡＨ１０９中
有效、稳定地表达。
三、ｃＤＮＡ文库的筛选
对ｃＤＮＡ文库筛选获得的阳性克隆质粒进行
测序．并在ＧｅｎＢａｎｋ中进行同源性比较．结果获得
２个已收录的人ｃＤＮＡ序列：ＨＫＲ３（ｈｕｍａｎ ｋｒｕｐｐｅｌ—
ｒｅｌａｔｅｄ ３。ＨＫＲ３： ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ ００５３４１．１）和
ＳＭＡＲＣＢ１（ＳＷＩ／ＳＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ。ｍａｔｒｉｘ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ａｃｔｉｎ－
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ， ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｂ，
ｍｅｍｂｅｒ １，ＳＭＡＲＣＢ１；ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ ００３０７３．１）。
四、ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢｌ和ｈＴＥＲＴ在胃癌细胞株
ＳＧＣ一７９０１中的表达
ＲＴ—ＰＣＲ检测显示．ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１ ｍＲＮＡ
在ＳＧＣ一７９０１细胞中的表达与ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ的表
达一致．均呈高表达（见图１～３）。
１ ２
１５４３ ｂｐ
９９４ ｂｐ
６９７ ｂｐ
５１５ ｂｐ
ＧＡＰＤＨ
３７７ ｂｐ
ＨＫＲ３
泳道ｌ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；泳道２：胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１
图１ 胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１中ＨＫＲ３的表达
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００８，Ｖｏ１．１３，Ｎｏ．５
２
１５４３ ｂｐ
９９４ ｂｐ
６９７ ｂｐ
５１５ ｂｐ
３７７ ｂｐ
泳道１：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ：泳道２：胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１
图２ 胃癌细胞株ＳＧＣ－７９０１中ＳＭＡＲＣＢ１的表达
ｌ ２
１５４３ ｂｐ
９９４ ｂｐ
６９７ ｂｐ
５１５ ｂｐ
３７７ ｂｐ
泳道ｌ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ：泳道２：胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１
图３ 胃癌细胞株ＳＧＣ－７ｇＯ１中ｈＴＥＲＴ的表达
讨 论
ｈＴＥＲＴ对端粒酶活性的发挥具有重要调控作
用，其参与了肿瘤的发生和发展过程．在肿瘤组织
中呈高表达。本研究显示胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１中
ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ呈高表达，与国外研究结果 一致．
因此认为与ｈＴＥＲＴ发生相互作用的蛋白分子很可
能参与了对端粒酶活性的调控。由此。以酵母双杂
交技术为平台．以ｈＴＥＲＴ为诱饵．可从ｃＤＮＡ文库
中获取新的与ｈＴＥＲＴ相互作用的蛋白分子编码基
因，或新的端粒相关蛋白分子编码基因，从而为了
解端粒酶的全酶结构及其生物学特性和作用机制
奠定重要的理论基础。
以ｈＴＥＲＴ为靶位构建ＤＮＡ结合域（ＤＮＡ—
ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．ＤＮＡ—ＢＤ）诱饵融合蛋白表达载体
ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ可在酵母菌株ＡＨ１０９中稳定表
达．符合筛选ｃＤＮＡ文库的需要。通过对ｃＤＮＡ文
库的筛选．利用二级报告基因ＬａｃＺ表达弃除部分
假阳性．互换酵母菌株行酵母交配实验确定ＬａｃＺ
阳性克隆．经测序确定了２个与ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ发
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胃肠病学２００８年第１３卷第５期
生作用的阳性克隆，通过在ＧｅｎＢａｎｋ中进行同源性
比较获得２个ｃＤＮＡ序列：ＨＫＲ３和ＳＭＡＲＣＢ１
ＨＫＲ３是一较为保守的转录因子家族中的
Ｋｒｕｐｐｅｌ型锌指蛋白，定位于染色体ｌｐ３６．３．全长
９．５ ｋｂ，含有ｌ１个外显子，在５’端有一ＣｐＧ岛。
ＨＫＲ３在人体组织中至少存在两种转录体形式，一
种为全长转录体，另一种为不含有保守的锌指相关
盒和酸性激活域的截断体［７１。ＨＫＲ３在人体组织中
广泛表达，尤其是在人胚胎和成人神经组织中呈高
表达。在神经母细胞瘤细胞株ＳＫ—Ｎ—ＡＳ以及来源于
神经母细胞瘤患者的成淋巴细胞系中，ＨＫＲ３存在
杂合缺失。有研究［８１显示，ｌｐ３６．３缺失的１５例原发
性神经母细胞瘤样本的Ｄ１Ｓ２１４位点存在等位缺
失。ＨＫＲ３可能与人神经母细胞瘤或其他肿瘤发生
染色体重排或缺失相关。
人ＳＭＡＲＣＢ１为一肿瘤抑制基因，定位于染
色体２２ｑｌ１．２，人、鼠ＳＭＡＲＣＢ１蛋白高度保守
（１００％）［９１。恶性杆状瘤频发ＳＭＡＲＣＢ１等位缺失。
慢性髓细胞性白血病常发生ＳＭＡＲＣＢ１基因缺
失，可能与ＳＭＡＲＣＢ１基因表达降低有关¨０１。Ｂｒｕｄｅｒ
等［９１检测了４１例脑膜瘤、２３例神经鞘瘤ＳＭＡＲＣＢ１
基因的７个外显子，未发现缺失或突变。Ｗｅｂｅｒ等…１
分析了２００例脑肿瘤患者的ＳＭＡＲＣＢ１基因单链
构象多态性（ＳＳＣＰ）及其第３、８外显子纯合缺失，结
果显示在星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、少突神经胶
质瘤、神经鞘瘤、成神经管细胞瘤等肿瘤中未发现
该基因突变或纯合缺失，仅在１例脉络丛肿瘤中发
现单位点突变，提示ＳＭＡＲＣＢ１基因突变或缺失不
是大多数脑肿瘤的频发事件。Ｓｃｈｍｉｔｚ等［１２呗Ⅱ在１２６
例脑膜瘤中发现有４例在第９外显子的同一位点
发生突变，即第３７７位的精氨酸由组氨酸取代，这
一
位置可能是脑膜瘤发生的突变热点，认为
ＳＭＡＲＣＢ１在脑膜瘤的发生中起有一定作用。
综上所述，ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１参与了肿瘤的发
生，但其作用机制尚不清楚，至今人们尚未认识到
其与端粒酶有何内在联系。本研究显示ＨＫＲ３、
ＳＭＡＲＣＢ１与ｈＴＥＲＴ有十分密切的联系，在胃癌
细胞株ＳＧＣ一７９０１中，ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１ ｍＲＮＡ与
ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ的表达一致，均呈高表达，提示这些
分子可能在胃癌的发生过程中存在相互调节或协
同作用。因此，深入研究ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１及其与
ｈＴＥＲＴ的关系将有助于进一步了解调控端粒酶活
性作用的分子机制。
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（２００７．１２．２８收稿；２００８．０２－０５修回）
2024年5月15日发(作者：招语山)
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・
２６０・
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００８，Ｖｏ１．１３，Ｎｏ．５
・
论 著・
人端粒相关蛋白ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１的
筛选及其在胃癌细胞中的表达
周 平 房殿春 陈 兵 毛高平 匦ｚ 曹传平一 张启杰 步晓华
中国人民解放军空军总医院消化内科、（１０００３６） 第三军医大学西南医院消化内科２
山东省淄博市中心医院内科３
背景：端粒酶与肿瘤的发生有十分密切的联系，研究与人端粒酶逆转录酶（ｈＴＥＲＴ）相互作用的端粒相关蛋白将
有助于了解端粒酶在肿瘤细胞中的生物学特性和分子机制。目的：筛选新的人端粒相关蛋白，为进一步了解端粒酶
的全酶结构、生物学特性及其作用机制奠定实验基础。方法：采用酵母双杂交技术进行人端粒相关蛋白分子的筛选
构建诱饵融合蛋白表达载体ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ，筛选人睾丸ｃＤＮＡ文库；以蛋白质印迹法测定ＤＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ融合
蛋白的表达。对筛选得到的阳性克隆质粒进行测序，在ＧｅｎＢａｎｋ中行同源性比较。采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ．
ＰＣＲ）检测ｈＴＥＲＴ、ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢｌ ｍＲＮＡ在胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１中的表达。结果：融合蛋白表达载体ＤＧＢＫＴ７一
ｈＴＥＲＴ可在酵母菌株ＡＨ１０９中有效、稳定地表达。ｃＤＮＡ文库筛选获得ＧｅｎＢａｎｋ已收录的人ｃＤＮＡ序列ＨＫＲ３和
ＳＭＡＲＣＢｌ。ｈＴＥＲＴ、ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢｌ ｍＲＮＡ在胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１中表达一致，均呈高表达。结论：ＨＫＲ３、
ＳＭＡＲＣＢｌ是人端粒相关蛋白成员，与ｈＴＥＲＴ有十分密切的联系，可能在胃癌的发生过程中存在相互调节或协同作用。
关键词端粒； 端粒，末端转移酶； 端粒结合蛋白质类； 细胞系，肿瘤； 酵母双杂交技术
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＨＫＲ３，ＳＭＡＲＣＢ１ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｌｌｓ ＺＨＯＵ ＦＡＮＧ Ｄｉａｎｃｈｕｎ，ＣＨＥＮ Ｂｉｎｇ，ＭＡ０ Ｇａｏｐｉｎｇ，ＬＩＵ Ｗｅｉｗｅｎ，ＣＡ０ Ｃｈｕａｎｐｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｑｉｊｉｅ，ＢＵ
Ｘｉａｏｈｕ￣Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ａ ｉｒ Ｆｏｒｃｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈａｓｐｉｔａｌ ｆ ｏＣｈｉｅｓｅｎ ＰＬＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ ａｏｏｏ３６）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｔｏ：ＦＡＮＧ Ｄｉａｎｃｈｕｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ（４０００３８），Ｅｍａｉｈ ｆａｎｇｄｉａｎｃｈｕｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｎ
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｉＳ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ．Ｔｈｅ ｆｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｎｅｗ ｔｅｌｏｍｅｒｅ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｗｈｉｃｈ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ） ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｈｅｌｐｆｕｌ ｆｏｒ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ａｉｍｓ：Ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｅ—
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳＯ ａｓ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ
ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ
ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｅ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂａｉｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｈｕｍａｎ ｔｅｓｔｉｃｌｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ。Ｔｈｅ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．
ｈＴＥＲＴ．
Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ
ＨＫＲ３ ａｎｄ ＳＭＡＲＣＢ １ ｍＲＮＡ ｉｎ ｇａｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｒｌ ｌｉｎｅ ＳＧＣ一７９０１ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ—
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ ｗａｓ ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ
ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ ＡＨ １ ０９．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｈａｄ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＨＫＲ３ ａｎｄ ＳＭＡＲＣＢ １．ｈＴＥＲＴ ａｓ
ｗｅｌｌ ａｓ ＨＫＲ３，ＳＭＡＲＣＢ１ ｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＧＣ一７９０１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＨＫＲ３，
ＳＭＡＲＣＢ １ ａｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｅ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｒｅ ｃｌｏｓｅｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈＴＥＲＴ， ａｎｄ ｍａｙ ｈａｖｅ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｇａｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．ｒ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ；Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ；Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ—Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ．Ｔｕｍｏｒ；Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ—Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ
在肿瘤的发生、发展过程中，端粒酶和端粒相
关蛋白发挥了十分重要的作用１’－４］。因此，以端粒酶
本文通讯作者，第三军医大学西南医院消化内科（４０００３８），
Ｅｍａｉｌ：ｆａｎｇｄｉａｎｃｈｕｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｎ
或端粒相关蛋白为靶向进行肿瘤检测或治疗已成
为肿瘤研究的重点。但端粒酶、端粒相关蛋白在肿
瘤发生过程中的分子机制仍不十分清楚，且目前对
端粒酶组分或与端粒酶作用相关的分子仍存在较
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胃肠病学２００８年第ｌ３卷第５期
多疑问有待解释。为此本研究对人端粒相关蛋白分
的构建和转化：ＥｃｏＲ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ酶切质粒ｐＧＲＮ１４５，
子进行筛选，并对筛选得到的基因在胃癌细胞中的
电洗脱法获得ｈＴＥＲＴ ｃＤＮＡ片段，定向克隆人载
表达进行初步检测，以期为端粒酶作用的分子机制
体ｐＧＢＫＴ７的多克隆位点ＥｃｏＲ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ。采用乙
研究奠定理论基础。
酸锂法将ｐＧＢＫＴ７．ｈＴＥＲＴ以及ｐＧＢＫＴ７、ｐＧＢＫＴ７．
５３、ｐＧＢＫＴ７．Ｌａｍ质粒转化人酵母菌株ＡＨ１０９中，
材料与方法
将ｐＧＡＤＴ７、ｐＧＡＤＴ７．Ｔ、ｐＣＬ．１质粒转化人酵母菌
株Ｙ１８７中。
一
、
材料
３．诱饵融合蛋白表达载体ｐＧＢＫＴ７．ｈＴＥＲＴ的
１．质粒：酵母双杂交系统．３质粒ｐＧＢＫＴ７、
鉴定：以Ｂ．半乳糖苷酶菌落影印滤膜分析检测
ｐＧＢＫＴ７－５３ ｐＧＢＫＴ７－Ｌａｍ ｐＧＡＤＴ７ ｐＧＡＤＴ７－Ｔ
ｐＧＢＫＴ７．ｈＴＥＲＴ是否具有自身激活报告基因ＬａｃＺ
ｐＣＬ．１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司）；真核表达载体质粒ｐｃＤＮＡ３
的作用。将消毒滤膜放在生长有转化菌落的平板
（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；人端粒酶逆转录酶（ｈＴＥＲＴ）ｃＤＮＡ
上，待滤膜浸湿后取出并置于液氮中浸泡１０ ｓ，放
质粒ｐＧＲＮ１４５由Ｇｅｒｏｎ公司惠赠。
在经Ｚ缓冲液，Ｘ．ｇａｌ浸泡的另一滤膜上，室温放
２．菌株：预转化人睾丸ｃＤＮＡ文库的酵母菌
置，记录菌落显色时间（连续观察８ ｈ。阳性呈蓝
株Ｙ１８７、酵母菌株ＡＨ１０９、Ｙ１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司）； 色，阴性无色）。蛋白质印迹法测定ｐＧＢＫＴ７．
大肠杆菌ＤＨ５ｏｔ（第三军医大学分子遗传教研室
ｈＴＥＲＴ融合蛋白的表达。
保存）。 ４．酵母双杂交技术筛选ｃＤＮＡ文库：将ｐＧＢＫＴ７．
３．引物：ｈＴＥＲＴ、ＧＡＰＤＨ和筛选出的人端粒相 ｈＴＥＲＴ转化菌株ＡＨ１０９与人睾丸ｃＤＮＡ文库预转
关蛋白基因引物的设计、合成由上海基康生物技术 化菌株Ｙ１８７混合培养，培养物铺于ＳＤ！．Ａｄｅ／．Ｌｅｕ／
有限公司进行。
．
Ｔｒｐ／．Ｈｉｓ平板上，筛选Ａｄｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ阳性克
４．主要试剂：酵母培养基（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司），Ｔ４
隆，以Ｂ．半乳糖苷酶菌落影印滤膜分析筛选ＬａｃＺ
ＤＮＡ连接酶、质粒提取试剂盒、ＰＶＤＦ膜（Ｒｏｃｈｅ公
阳性克隆。提取、纯化文库质粒，互换酵母菌株后行
司）；Ｔｒｉｐｕｒｅ Ｋｉｔ、逆转录聚合酶链反应（ＲＴ．ＰＣＲ）
酵母交配实验，验证文库质粒和ｈＴＥＲＴ作用的特
Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；Ｘ－ｇａｌ、３－ＡＴ（Ｓｉｇｍａ公司）；限
异性，进一步弃除假阳性。对获得的真阳性克隆质
制性核酸内切酶ＨｉｎｄＩＵ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、
粒进行测序，将其ｃＤＮＡ序列输入计算机，应用
Ｓａｌ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ公司）；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（华 ＢＬＡＳＴ软件与ＧｅｎＢａｎｋ中的所有核酸序列进行同
美生物工程公司）。
源性比较。
５．细胞株：中分化胃腺癌细胞株ＳＧＣ．７９０１
５．胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１中ｈＴＥＲＴ以及筛选
（第三军医大学西南医院全军消化专科中心实验
基因ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１ ｍＲＮＡ的表达：采用ＲＴ．
室保种）。
ＰＣＲ方法进行检测。ＳＧＣ．７９０１细胞在ＤＭＥＭ培养
二、方法
液（含１０％／ｂ牛血清）中于３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度
１．质粒的转化和扩增：采用氯化钙法行质粒 下培养。采用Ｔｒｉｐｕｒｅ法提取细胞总ＲＮＡ。ｈＴＥＲＴ
转化。将ｐＧＢＫＴ７、ｐＧＢＫＴ７．５３、ｐＧＢＫＴ７－Ｌａｍ、
以及筛选出的基因引物序列见表１。ＰＣＲ反应体
ｐＧＡＤＴ７、ｐＧＡＤＴ７一Ｔ、ｐＣＬ－１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＧＲＮ１４５质
系：９４℃５ ｍｉｎ；９４℃４０ ｓ，５６℃５０ ｓ，６８℃６０ Ｓ，
粒转化人大肠杆菌ＤＨ５ｏｔ中。相应抗生素筛选阳性 ￣３５个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ；４℃浸泡。采用２％
克隆，以质粒提取试剂盒纯化质粒后经ＨｉｎｄＩＵ、
琼脂糖凝胶，加入ＰＣＲ产物５ ｌ（以ＧＡＰＤＨ为内
ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ酶切鉴定。
参照）进行电泳，电压５～１０ Ｖ／ｃｍ，电泳２０ ｍｉｎ，紫
２．诱饵融合蛋白表达载体ｐＧＢＫＴ７．ｈＴＥＲＴ
外透射仪下观察。计算机扫描记录。
表１ ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１、ｈＴＥＲＴ和ＧＡＤＰＨ引物序列和扩增片段大小
基因 上游 下游 长度
５’一ＣＧＡ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＡＧ ＧＣＣ ＧＴＡ ＧＡ一３’ ５’一ＧＣＴＴＣＡ ＧＴＴＴＣＣ ＣＡＣ ＡＧＡ ＧＧ一３’
２７６ ｂｐ
５’一ＡＴＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＡＧ ＴＣ一３’
５’一ＴＣＴ ＣＧＣ ＴＧＡ ＡＧＧ ＣＧＴ ＡＧＧ ＴＣ一３’ ２７０ ｂｐ
５’．ＣＧＧ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＴＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＡＡ－３’
５’一ＧＧＡ ＴＧＡ ＡＧＣ ＧＧＡ ＧＴＣ ＴＧＧ Ａ．３’
１４５ ｂｐ
５’．ＣＣＡ ＣＣＣ Ｇ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＡ．３’
５．’ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＧＧ ＴＣＣ ＡＣ－３ ５９８ ｂｐ
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结 果
一
、
酵母双杂交质粒的转化和酶切鉴定
ｐＧＢＫＴ７、ｐＧＢＫＴ７—５３ ｐＧＢＫＴ７一Ｌａｍ ｐＧＡＤＴ７
ｐＧＡＤＴ７一Ｔ、ｐＣＬ一１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＧＲＮ１４５质粒转化人
大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ均筛选出阳性克隆。提取质粒后均
经Ｈｉｎｄ ｍ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ酶切鉴定
证实。
二、诱饵融合蛋白表达载体ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ的
自身激活和表达鉴定
Ｂ一半乳糖苷酶菌落影印滤膜分析检测显示
ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ无自身激活报告基因ＬａｃＺ的作
用，该结果经酵母交配实验进一步证实。重组阳
性菌在分子质量约１４０ ｋＤａ（１ Ｄａ＝０．９９２１ ｕ）处可
见一蛋白条带，与预期融合蛋白分子质量相符。
而宿主菌在同一位置未见有蛋白条带．表明
ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ融合蛋白能在酵母菌株ＡＨ１０９中
有效、稳定地表达。
三、ｃＤＮＡ文库的筛选
对ｃＤＮＡ文库筛选获得的阳性克隆质粒进行
测序．并在ＧｅｎＢａｎｋ中进行同源性比较．结果获得
２个已收录的人ｃＤＮＡ序列：ＨＫＲ３（ｈｕｍａｎ ｋｒｕｐｐｅｌ—
ｒｅｌａｔｅｄ ３。ＨＫＲ３： ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ ００５３４１．１）和
ＳＭＡＲＣＢ１（ＳＷＩ／ＳＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ。ｍａｔｒｉｘ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ａｃｔｉｎ－
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ， ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｂ，
ｍｅｍｂｅｒ １，ＳＭＡＲＣＢ１；ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ ００３０７３．１）。
四、ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢｌ和ｈＴＥＲＴ在胃癌细胞株
ＳＧＣ一７９０１中的表达
ＲＴ—ＰＣＲ检测显示．ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１ ｍＲＮＡ
在ＳＧＣ一７９０１细胞中的表达与ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ的表
达一致．均呈高表达（见图１～３）。
１ ２
１５４３ ｂｐ
９９４ ｂｐ
６９７ ｂｐ
５１５ ｂｐ
ＧＡＰＤＨ
３７７ ｂｐ
ＨＫＲ３
泳道ｌ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；泳道２：胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１
图１ 胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１中ＨＫＲ３的表达
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００８，Ｖｏ１．１３，Ｎｏ．５
２
１５４３ ｂｐ
９９４ ｂｐ
６９７ ｂｐ
５１５ ｂｐ
３７７ ｂｐ
泳道１：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ：泳道２：胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１
图２ 胃癌细胞株ＳＧＣ－７９０１中ＳＭＡＲＣＢ１的表达
ｌ ２
１５４３ ｂｐ
９９４ ｂｐ
６９７ ｂｐ
５１５ ｂｐ
３７７ ｂｐ
泳道ｌ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ：泳道２：胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１
图３ 胃癌细胞株ＳＧＣ－７ｇＯ１中ｈＴＥＲＴ的表达
讨 论
ｈＴＥＲＴ对端粒酶活性的发挥具有重要调控作
用，其参与了肿瘤的发生和发展过程．在肿瘤组织
中呈高表达。本研究显示胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１中
ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ呈高表达，与国外研究结果 一致．
因此认为与ｈＴＥＲＴ发生相互作用的蛋白分子很可
能参与了对端粒酶活性的调控。由此。以酵母双杂
交技术为平台．以ｈＴＥＲＴ为诱饵．可从ｃＤＮＡ文库
中获取新的与ｈＴＥＲＴ相互作用的蛋白分子编码基
因，或新的端粒相关蛋白分子编码基因，从而为了
解端粒酶的全酶结构及其生物学特性和作用机制
奠定重要的理论基础。
以ｈＴＥＲＴ为靶位构建ＤＮＡ结合域（ＤＮＡ—
ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．ＤＮＡ—ＢＤ）诱饵融合蛋白表达载体
ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ可在酵母菌株ＡＨ１０９中稳定表
达．符合筛选ｃＤＮＡ文库的需要。通过对ｃＤＮＡ文
库的筛选．利用二级报告基因ＬａｃＺ表达弃除部分
假阳性．互换酵母菌株行酵母交配实验确定ＬａｃＺ
阳性克隆．经测序确定了２个与ｐＧＢＫＴ７一ｈＴＥＲＴ发
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胃肠病学２００８年第１３卷第５期
生作用的阳性克隆，通过在ＧｅｎＢａｎｋ中进行同源性
比较获得２个ｃＤＮＡ序列：ＨＫＲ３和ＳＭＡＲＣＢ１
ＨＫＲ３是一较为保守的转录因子家族中的
Ｋｒｕｐｐｅｌ型锌指蛋白，定位于染色体ｌｐ３６．３．全长
９．５ ｋｂ，含有ｌ１个外显子，在５’端有一ＣｐＧ岛。
ＨＫＲ３在人体组织中至少存在两种转录体形式，一
种为全长转录体，另一种为不含有保守的锌指相关
盒和酸性激活域的截断体［７１。ＨＫＲ３在人体组织中
广泛表达，尤其是在人胚胎和成人神经组织中呈高
表达。在神经母细胞瘤细胞株ＳＫ—Ｎ—ＡＳ以及来源于
神经母细胞瘤患者的成淋巴细胞系中，ＨＫＲ３存在
杂合缺失。有研究［８１显示，ｌｐ３６．３缺失的１５例原发
性神经母细胞瘤样本的Ｄ１Ｓ２１４位点存在等位缺
失。ＨＫＲ３可能与人神经母细胞瘤或其他肿瘤发生
染色体重排或缺失相关。
人ＳＭＡＲＣＢ１为一肿瘤抑制基因，定位于染
色体２２ｑｌ１．２，人、鼠ＳＭＡＲＣＢ１蛋白高度保守
（１００％）［９１。恶性杆状瘤频发ＳＭＡＲＣＢ１等位缺失。
慢性髓细胞性白血病常发生ＳＭＡＲＣＢ１基因缺
失，可能与ＳＭＡＲＣＢ１基因表达降低有关¨０１。Ｂｒｕｄｅｒ
等［９１检测了４１例脑膜瘤、２３例神经鞘瘤ＳＭＡＲＣＢ１
基因的７个外显子，未发现缺失或突变。Ｗｅｂｅｒ等…１
分析了２００例脑肿瘤患者的ＳＭＡＲＣＢ１基因单链
构象多态性（ＳＳＣＰ）及其第３、８外显子纯合缺失，结
果显示在星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、少突神经胶
质瘤、神经鞘瘤、成神经管细胞瘤等肿瘤中未发现
该基因突变或纯合缺失，仅在１例脉络丛肿瘤中发
现单位点突变，提示ＳＭＡＲＣＢ１基因突变或缺失不
是大多数脑肿瘤的频发事件。Ｓｃｈｍｉｔｚ等［１２呗Ⅱ在１２６
例脑膜瘤中发现有４例在第９外显子的同一位点
发生突变，即第３７７位的精氨酸由组氨酸取代，这
一
位置可能是脑膜瘤发生的突变热点，认为
ＳＭＡＲＣＢ１在脑膜瘤的发生中起有一定作用。
综上所述，ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１参与了肿瘤的发
生，但其作用机制尚不清楚，至今人们尚未认识到
其与端粒酶有何内在联系。本研究显示ＨＫＲ３、
ＳＭＡＲＣＢ１与ｈＴＥＲＴ有十分密切的联系，在胃癌
细胞株ＳＧＣ一７９０１中，ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１ ｍＲＮＡ与
ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ的表达一致，均呈高表达，提示这些
分子可能在胃癌的发生过程中存在相互调节或协
同作用。因此，深入研究ＨＫＲ３、ＳＭＡＲＣＢ１及其与
ｈＴＥＲＴ的关系将有助于进一步了解调控端粒酶活
性作用的分子机制。
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