2024年5月16日发(作者：圭语诗)
实验一 动物组织和细胞中核酸的提取和测定
第一部分 动物组织和细胞中DNA和RNA的提取
【
实验目的
】
学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法
【
实验原理
】
1
.从动物组织和细胞中提取DNA
DNA存在于细胞核中。提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采
用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制
Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）
溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。
这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR
反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。
2.从动物组织和细胞中提取RNA
RNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。为了快速从细胞中分离完整的RNA，
许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种
RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋
白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。
【
实验材料
】
1. 实验器材
材料：小牛胸腺或动物肝脏；研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽
口移液管，锤子，塑料袋，涡旋等。
2.实验试剂
(1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl (PH8.0)，0.1mol/L EDTA (PH8.0)，0.5%(m/V) SDS，20µg/mg无
Dnase的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。RNase在用前适量加入。
(2)溶液D(变性液)：4 mol/L 硫氰酸胍，25mmol/L 柠檬酸钠. 2H
2
0，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，
0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V )月桂
基肌酸钠溶于293 ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。室温贮存溶液D,每
次使用前加入14.4 mol/L的β-巯基乙醇,每50ml溶液D加0.36ml。溶液D可在室温下避光保存数月。
(3)平衡酚：用0.5mol/L Tris-Cl (PH8.0)平衡的苯酚
(4)TBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱、加入0.015g酚红并用HCl调节
溶液的PH值至7.4,加水定容至1L,分装后在15 lbf/in
2
(1.034×10
5
Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于
室温。
(5)PBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa
2
HPO
4
和0.24gKH
2
PO
4
, 用HCl调节
溶液的PH值至7.4, 加水定容至1L, 在15 lbf/in
2
(1.034×10
5
Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于室温。
(6)TE（PH8.0）：10mmol/L （PH8.0），1 mmol/LEDTA（PH8.0）
(7) 蛋白酶K（20mg/ml），10mol／L醋酸铵，2mol／L的醋酸钠 (pH4.0)，0.1%DEPC（焦碳酸二
乙酯）
(8)无水乙醇，70％乙醇，氯仿—异戊醇(49:1,V/V)，异丙醇，酚
(9) 液氮
1
【
实验操作
】
(一) 用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物组织和细胞中分离DNA
1. 组织样品和培养细胞的裂解
（1）组织样品
① 将lg新鲜切取的组织在液氮中速冻，并用液氮预冷的研钵研磨。
② 液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积裂解液的烧杯中，使其分散于裂
解液表面，后振摇烧杯使粉末浸没。
③ 将悬液转移至50ml三角瓶中，并于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
（2）培养细胞
①单层培养细胞
i. 从孵箱中取出长满单层细胞的培养皿，迅速吸去培养液，用冰冷的TBS洗2次，加
入1ml新鲜的冰冷的TBS。
ii. 用橡胶刮棒将细胞刮入1ml TBS中，用吸管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用
0.5 ml冰冷的TBS冲洗培养皿，后并入离心管的细胞悬液。
iii. 于4℃3000r/min离心10min以收集细胞。
iv. 将细胞重悬于5倍~10倍体积的冰冷TBS中并再度离心。
v. 用1 ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。
vi. 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
②悬浮培养的细胞
i. 将细胞转移至离心管，于4℃3000r/min离心10min以收集细胞，吸去上清。
ii. 用1倍体积冰冷的TBS重悬细胞并再度离心，吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰
冷的TBS中，离心收集细胞。
iii. 去上清，用1ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。
iv. 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
2.将裂解液转移至离心管中，裂解液不能超过1/3体积。
3.加入蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度100µg/ml。用一灭菌玻璃棒温和地将酶混入细胞裂解液
中。
4.将细胞裂解液置于50℃水浴中保温3 h，并不时振摇。
5.将溶液冷却至室温，加入等体积的平衡酚，将离心管置于涡旋器上,使离心管缓慢颠转10min
以温和地混合两相。
6.室温下，6500r/min离心15 min以分离两相。
7.用宽口移液管将黏滞的水相转移至另一离心管。
8.苯酚抽提两次，收集水相。
9.加入0.2倍体积10mol/L醋酸铵及2倍体积无水乙醇，旋转离心管直至溶液彻底混匀为止。
随即形成沉淀，在室温下6500r/min离心5 min，收集沉淀。
11.用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，按步骤1.10.离心收集DNA。
12.尽可能吸去残余乙醇,于室温下，将DNA沉淀置于敞开的管内，直至乙醇挥发殆尽。
13.按每0.1m1细胞(步骤1.1)加入1ml TE溶解DNA，将DNA溶液储存于4℃。
14.用紫外分光光度法或二苯胺显色法检测DNA含量。详见本实验第二部分。
(二)酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法纯化组织和细胞中的RNA
1．组织样品和培养细胞的处理
(1) 组织样品
2
① 分离组织在液氮中速冻。
② 将冰冻的组织放入塑料袋中，用锤子砸碎。
③ 将组织碎末移入含3ml溶液D的管中。
④ 用匀浆机室温下匀浆15s ~30s。
(2)培养细胞
①单层培养细胞
i. 吸出培养基用5ml~10ml冰冷的PBS洗细胞一次。
ii. 吸出PBS加入溶液D覆盖细胞，90mm培养皿加2ml (60mm培养皿加1 ml)。
iii. 将细胞溶解物转移至管中。
iv. 用匀浆机室温下匀浆15s ~30s。
②悬浮培养的细胞
i. 室温下1000r/min~3000r/min离心5min~10min收获细胞。
ii. 吸出培养基将细胞重悬于1ml~2ml冰预冷的PBS中。
iii. 离心收获细胞，彻底吸尽PBS，加2ml溶液D。
iv. 用匀浆机室温下匀浆15s ~30s。
2．将混合物移至一管中，在每毫升溶液D中立即加入0.1ml 2mol／L的醋酸钠 (pH4.0)，1m1
酚，0.2m1氯仿—异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。
3．将匀浆剧烈振荡10s。冰浴15min使核蛋白质复合体彻底裂解。
4.10000r／min用4℃离心20min，将上层含RNA的水相移入一新管中。
5.加入与提取的RNA等量的异丙醇,充分混合液体，并在-20℃沉淀RNA lh或更长时间。
6.10000r／min用4℃离心30min，收集沉淀的RNA。
7. 轻轻倒出异丙醇加入溶液D溶解RNA颗粒，每1ml第一步所使用的溶液加0.3m1溶液D。
8. 将溶液移至一微量离心管，涡旋混匀，并在-20℃用等量异丙醇沉淀RNA 1h或更长时间。
9. 在微量离心机上，于4℃ 12000r/min离心10min收集RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤沉淀2
次，重复离心。用—次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将离心管盖打开,在实验台放置几分钟，
以便乙醇蒸发。RNA不可完全干燥。
10. 加50µl ~100µl DEPC处理过的水使RNA沉淀溶解。将RNA溶液贮存于-70℃。
11. 用紫外分光光度法或地衣酚显色方法检测RNA含量。详见本实验第二部分。
【
实验结果讨论
】
1．提取的DNA若有一定程度的解聚，不会影响鉴定。
2．用上述方法所得到的是组织或细胞中的总RNA，若要得到mRNA须利用大多数真核生物
，
mRNA3带有多聚腺苷酸残基的特点，使其通过挂有寡聚d（T）的纤维素亲和而纯化。
【
思考题
】
在提取核酸过程中，要注意哪些问题？
3
第二部分 核酸含量测定
(一)紫外分光光度法
【
实验目的
】
学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法
【
实验原理
】
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收峰在
260nm波长处。一般在260nm波长下，每1ml含1µg RNA溶液的光吸收值为0.022~0.024，每1m1
含1µg DNA溶液的光吸收值约为0.020，故测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即
可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收
紫外光的物质，则测光误差较大，故应设法事先除去。
【
实验材料
】
1.实验器材
离心机, 离心管,外分光光度计；
2.实验试剂
(1)钼酸氨—高氯酸试剂(沉淀剂)：如配制200ml，可在193ml蒸馏水中加入7ml高氯酸和0.5g
钼酸氨。
(2)5%~6%氨水
【
实验操作
】
1．用分析天平准确称取待测的核酸样品500mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量水稀释。然
后用5%~6%氨水调至pH7加蒸馏水定容到50ml。于紫外分光光度计上测定260nm光吸收值，计算
核酸浓度：
A
260
× N
RNA浓度（µg/ml）=
0.024×L
A
260
× N
DNA浓度（µg/ml）=
0.020×L
式中，A
260
——260nm波长处光吸收读数；
L——比色皿的厚度，1cm；
N——稀释倍数
2．如果待测的核酸样品中含有大分子核酸，需加钼酸氨—高氯酸沉淀剂，沉淀除去，测定上清液
260nm波长处A值作为对照。
取两支离心管，向第一支管内加入2m1样品溶液和2m1蒸馏水，向第二支管内加入2m1样品溶
液和2m1沉淀剂(以除去大分子核酸)作为对照。混匀，在冰浴中放置，30min后离心(3000rpm)，从
第一、第二管中分别吸取0.5m1上清液，用蒸馏水定容到50m1。用光程为lcm的石英比色杯于260nm
波长处测其光吸收值(A
l
和A
2
)。计算核酸浓度：
l
－A
2
A
×N
RNA或DNA浓度µg/ml =
0.024(或0.020)×L
1ml待测液中测得的核酸微克数
核酸%=
1ml待测液中制品的微克数
4
×100
【
实验结果讨论
】
蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在
260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定
影响不大。RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值>1.8；当样品中蛋白质
含量较高时比值即下降。
【
思考题
】
1．若样品中含有蛋白质，应如何排除干扰?
2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正?
（二）二苯胺法测定DNA含量
【
实验目的
】
掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法
【
实验原理
】
DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊
酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，其反应为：
DNA(脱氧核糖残基)
H
+
HO
CH
2
C
O
CH
2
CH
2
CHO
二苯胺
兰色化合物
蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40µg ~400µg范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
【
实验材料
】
1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计。
2.实验试剂
（1）DNA标准溶液：准确称取小牛胸腺DNA10mg，以0.1mol/L NaOH溶液溶解，转移至50ml
容量瓶中，用0.1mol／L NaOH溶液稀释至刻度。浓度为200µg/m1；
（2） DNA样品液：用上述实验方法提取的DNA样品
（3）二苯胺试剂：使用前称取1g结晶二苯胺，溶于100m1分析纯冰醋酸中，加60%过氯酸10m1
混匀。临用前加入1m1 1.6%乙醛溶液。此溶剂应为无色。
【
实验操作
】
1．标准曲线的绘制
取干燥试管6支，编号，按表所示加入试剂。
试剂
DNA标准溶液，ml
蒸馏水，ml
二苯胺试剂，ml
A
595
管号
0
0.0
2.0
4.0
1
0.4
1.6
4.0
2
0.8
1.2
4.0
3
1.2
0.8
4.0
4
1.6
0.4
4.0
5
2.0
0
4.0
加完毕，混匀，于60℃恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处测定吸光度，以零号管作对照，
5
绘制标准曲线。
2．样品测定
取试管3支，两支为样品管，—支为对照管。对照管操作与标准曲线零号管相同。向每支样品
管中加入2m1样品液及4ml二苯胺试剂，60℃保温1h，冷却后于595nm测定吸光度，以对照管调
零点。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相应吸光度的DNA含量。
【
实验结果讨论
】
1．该反应灵敏度较低，但方法简便，目前仍广泛使用。
2．其他糖及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等，对此反应由干扰，测定前应尽量除去。
【
思考题
】
二苯胺法测定DNA含量应注意哪些事项？
（三）地衣酚显色法测定RNA含量
【
实验目的
】
掌握地衣酚显色法测定RNA含量的原理和方法
【
实验原理
】
RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的戊糖又可转变为糠醛，在FeCl
3
或CuCl
2
催化下，糠醛
与地衣酚（3,5—二羟基甲苯）反应形成绿色复合物，该产物在670nm处有最大吸收。当RNA浓度
为20μg／m1~250μg／m1时，吸光度与RNA浓度成正比。
【
实验材料
】
1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计。
2.实验试剂
（1）RNA标准液：称取10mgRNA(需先定磷确定其纯度)用少量水溶解(若不溶可用2mol／L NaOH
溶液调至pH7.0)，定容至100m1，浓度为100µg／ml。
（2） RNA样品液：用上述实验方法提取的RNA样品
（3） 地衣酚试剂：取0.1g地衣酚溶于100ml浓盐酸，再加入0.1gFeCl
3
·6H
2
0。该溶液使用前新
鲜配制。
【
实验操作
】
1．标准曲线的绘制
取干燥试管6支，编号，按表所示加入试剂。
试剂
RNA标准溶液，ml
蒸馏水，ml
地衣酚试剂，ml
A
670
管号
0
0.0
1.0
3.0
1
0.1
0.9
3.0
2
0.2
0.8
3.0
3
0.3
0.7
3.0
4
0.4
0.6
3.0
5
0.5
0.5
3.0
加样完毕后混匀，于沸水浴中加热20min，取出置自来水中冷却，以零号管为对照，670nm处
测吸光度。以吸光度为纵坐标，RNA浓度为横坐标作图，绘制标准曲线。
2．样品测定
取试管3支，两支为样品管，—支为空白管，在样品管中加入1.0m1样品液，再加3.0m1地衣
6
酚试剂，混匀，置沸水浴中加热20min，取出冷却。空白管操作与标准曲线制作中零号管相同。以
空白管调零点，于670nm处测吸光度，根据吸光度值从标准曲线上查出相应的RNA含量。
【
实验结果讨论
】
1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，
可先测定样品中DNA含量，再算出RNA含量。
2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则
将发生干扰。
【
思考题
】
配制地衣酚试剂时，为什么要加FeCl
3
，6H
2
0
?
（四）定磷法测定核酸的含量
【
实验目的
】
掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法
【
实验原理
】
核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5%~9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，测
定其含磷量即可求出核酸的量。
核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷
钼酸铵沉淀，其反应为：
＋
PO
4
3-
+3NH
4
+12MoO
4
+24H
+
(NH
4
)
3
PO
4
. +12Mo0
3
·6H
2
0+6H
2
0
在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含
量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高
准确性。
【
实验材料
】
1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计
2.实验试剂
（1）标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移
至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol／L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每1m1
含磷400µg，临用时准确稀释20倍(20µg／m1)。
（2）定磷试剂
① 17％硫酸：17m1浓硫酸(相对密度l.84)缓缓加入到83m1水中。
②2.5％钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml水。
③10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水，并贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可
使用，呈深黄甚至棕色即失效。
临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2): 溶液(3):水=1:1:1:2(V: V)
（3）5%氨水, 27%硫酸
【
实验操作
】
1．磷标准曲线的绘制
取干燥试管7支编号，按表所示加入试剂。
7
试剂
磷标准溶液，ml
蒸馏水，ml
定磷试剂，ml
A
660
管号
0
0.0
3.0
3.0
1
0.05
2.95
3.0
2
0.1
0.9
3.0
3
0.2
2.8
3.0
4
0.3
0.7
3.0
5
0.4
2.6
3.0
6
0.5
2.5
3.0
加毕摇匀，在45℃水浴中保温10min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度。以磷含
量为横坐标，吸光度为纵坐标作图。
2．总磷的测定
称粗核酸0.1g，用少量水溶解(若不溶，可滴加5%氨水至pH7.0)，待全部溶解后，移至50ml
容量瓶中，加水至刻度(此溶液含样品2mg/m1)，即配成核酸溶液。
吸取上述核酸溶液1.0ml，置大试管中，加入2.5m1 27%硫酸及一粒玻璃珠，于通风橱内直火加
热至溶液透明(切勿烧干)，表示消化完成。冷却后取下，将消化液移入100ml容量瓶中，以少量蒸
馏水洗涤试管两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加蒸溜水至刻度，混匀后吸取3m1溶液置试管中，
加3m1定磷试剂，45℃水浴保温10min后取出, 测A
660
。
3．无机磷的测定
吸取核酸溶液1ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取3.0ml置试管中，加定磷试
剂3.0m1，45℃水浴中保温10min后取出, 测A
660
。
4．结果处理
总磷A
660
－无机磷A
660
=有机磷A
660
从标准曲线上查出有机磷微克数(X)，按下式计算样品中核酸百分含量：
X
× 稀释倍数×11
测定时取样毫升数
× 100%
核酸(％) =
样品重量（微克）
【
实验结果讨论
】
定磷法即可以测定DNA的含量又可以测定RNA的含量，若DNA中混有RNA或RNA中混有
DNA，都会影响结果的准确性。
【
思考题
】
定磷法操作中有哪些关键环节
？
8
2024年5月16日发(作者：圭语诗)
实验一 动物组织和细胞中核酸的提取和测定
第一部分 动物组织和细胞中DNA和RNA的提取
【
实验目的
】
学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法
【
实验原理
】
1
.从动物组织和细胞中提取DNA
DNA存在于细胞核中。提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采
用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制
Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）
溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。
这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR
反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。
2.从动物组织和细胞中提取RNA
RNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。为了快速从细胞中分离完整的RNA，
许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种
RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋
白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。
【
实验材料
】
1. 实验器材
材料：小牛胸腺或动物肝脏；研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽
口移液管，锤子，塑料袋，涡旋等。
2.实验试剂
(1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl (PH8.0)，0.1mol/L EDTA (PH8.0)，0.5%(m/V) SDS，20µg/mg无
Dnase的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。RNase在用前适量加入。
(2)溶液D(变性液)：4 mol/L 硫氰酸胍，25mmol/L 柠檬酸钠. 2H
2
0，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，
0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V )月桂
基肌酸钠溶于293 ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。室温贮存溶液D,每
次使用前加入14.4 mol/L的β-巯基乙醇,每50ml溶液D加0.36ml。溶液D可在室温下避光保存数月。
(3)平衡酚：用0.5mol/L Tris-Cl (PH8.0)平衡的苯酚
(4)TBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱、加入0.015g酚红并用HCl调节
溶液的PH值至7.4,加水定容至1L,分装后在15 lbf/in
2
(1.034×10
5
Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于
室温。
(5)PBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa
2
HPO
4
和0.24gKH
2
PO
4
, 用HCl调节
溶液的PH值至7.4, 加水定容至1L, 在15 lbf/in
2
(1.034×10
5
Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于室温。
(6)TE（PH8.0）：10mmol/L （PH8.0），1 mmol/LEDTA（PH8.0）
(7) 蛋白酶K（20mg/ml），10mol／L醋酸铵，2mol／L的醋酸钠 (pH4.0)，0.1%DEPC（焦碳酸二
乙酯）
(8)无水乙醇，70％乙醇，氯仿—异戊醇(49:1,V/V)，异丙醇，酚
(9) 液氮
1
【
实验操作
】
(一) 用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物组织和细胞中分离DNA
1. 组织样品和培养细胞的裂解
（1）组织样品
① 将lg新鲜切取的组织在液氮中速冻，并用液氮预冷的研钵研磨。
② 液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积裂解液的烧杯中，使其分散于裂
解液表面，后振摇烧杯使粉末浸没。
③ 将悬液转移至50ml三角瓶中，并于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
（2）培养细胞
①单层培养细胞
i. 从孵箱中取出长满单层细胞的培养皿，迅速吸去培养液，用冰冷的TBS洗2次，加
入1ml新鲜的冰冷的TBS。
ii. 用橡胶刮棒将细胞刮入1ml TBS中，用吸管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用
0.5 ml冰冷的TBS冲洗培养皿，后并入离心管的细胞悬液。
iii. 于4℃3000r/min离心10min以收集细胞。
iv. 将细胞重悬于5倍~10倍体积的冰冷TBS中并再度离心。
v. 用1 ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。
vi. 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
②悬浮培养的细胞
i. 将细胞转移至离心管，于4℃3000r/min离心10min以收集细胞，吸去上清。
ii. 用1倍体积冰冷的TBS重悬细胞并再度离心，吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰
冷的TBS中，离心收集细胞。
iii. 去上清，用1ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。
iv. 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
2.将裂解液转移至离心管中，裂解液不能超过1/3体积。
3.加入蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度100µg/ml。用一灭菌玻璃棒温和地将酶混入细胞裂解液
中。
4.将细胞裂解液置于50℃水浴中保温3 h，并不时振摇。
5.将溶液冷却至室温，加入等体积的平衡酚，将离心管置于涡旋器上,使离心管缓慢颠转10min
以温和地混合两相。
6.室温下，6500r/min离心15 min以分离两相。
7.用宽口移液管将黏滞的水相转移至另一离心管。
8.苯酚抽提两次，收集水相。
9.加入0.2倍体积10mol/L醋酸铵及2倍体积无水乙醇，旋转离心管直至溶液彻底混匀为止。
随即形成沉淀，在室温下6500r/min离心5 min，收集沉淀。
11.用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，按步骤1.10.离心收集DNA。
12.尽可能吸去残余乙醇,于室温下，将DNA沉淀置于敞开的管内，直至乙醇挥发殆尽。
13.按每0.1m1细胞(步骤1.1)加入1ml TE溶解DNA，将DNA溶液储存于4℃。
14.用紫外分光光度法或二苯胺显色法检测DNA含量。详见本实验第二部分。
(二)酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法纯化组织和细胞中的RNA
1．组织样品和培养细胞的处理
(1) 组织样品
2
① 分离组织在液氮中速冻。
② 将冰冻的组织放入塑料袋中，用锤子砸碎。
③ 将组织碎末移入含3ml溶液D的管中。
④ 用匀浆机室温下匀浆15s ~30s。
(2)培养细胞
①单层培养细胞
i. 吸出培养基用5ml~10ml冰冷的PBS洗细胞一次。
ii. 吸出PBS加入溶液D覆盖细胞，90mm培养皿加2ml (60mm培养皿加1 ml)。
iii. 将细胞溶解物转移至管中。
iv. 用匀浆机室温下匀浆15s ~30s。
②悬浮培养的细胞
i. 室温下1000r/min~3000r/min离心5min~10min收获细胞。
ii. 吸出培养基将细胞重悬于1ml~2ml冰预冷的PBS中。
iii. 离心收获细胞，彻底吸尽PBS，加2ml溶液D。
iv. 用匀浆机室温下匀浆15s ~30s。
2．将混合物移至一管中，在每毫升溶液D中立即加入0.1ml 2mol／L的醋酸钠 (pH4.0)，1m1
酚，0.2m1氯仿—异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。
3．将匀浆剧烈振荡10s。冰浴15min使核蛋白质复合体彻底裂解。
4.10000r／min用4℃离心20min，将上层含RNA的水相移入一新管中。
5.加入与提取的RNA等量的异丙醇,充分混合液体，并在-20℃沉淀RNA lh或更长时间。
6.10000r／min用4℃离心30min，收集沉淀的RNA。
7. 轻轻倒出异丙醇加入溶液D溶解RNA颗粒，每1ml第一步所使用的溶液加0.3m1溶液D。
8. 将溶液移至一微量离心管，涡旋混匀，并在-20℃用等量异丙醇沉淀RNA 1h或更长时间。
9. 在微量离心机上，于4℃ 12000r/min离心10min收集RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤沉淀2
次，重复离心。用—次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将离心管盖打开,在实验台放置几分钟，
以便乙醇蒸发。RNA不可完全干燥。
10. 加50µl ~100µl DEPC处理过的水使RNA沉淀溶解。将RNA溶液贮存于-70℃。
11. 用紫外分光光度法或地衣酚显色方法检测RNA含量。详见本实验第二部分。
【
实验结果讨论
】
1．提取的DNA若有一定程度的解聚，不会影响鉴定。
2．用上述方法所得到的是组织或细胞中的总RNA，若要得到mRNA须利用大多数真核生物
，
mRNA3带有多聚腺苷酸残基的特点，使其通过挂有寡聚d（T）的纤维素亲和而纯化。
【
思考题
】
在提取核酸过程中，要注意哪些问题？
3
第二部分 核酸含量测定
(一)紫外分光光度法
【
实验目的
】
学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法
【
实验原理
】
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收峰在
260nm波长处。一般在260nm波长下，每1ml含1µg RNA溶液的光吸收值为0.022~0.024，每1m1
含1µg DNA溶液的光吸收值约为0.020，故测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即
可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收
紫外光的物质，则测光误差较大，故应设法事先除去。
【
实验材料
】
1.实验器材
离心机, 离心管,外分光光度计；
2.实验试剂
(1)钼酸氨—高氯酸试剂(沉淀剂)：如配制200ml，可在193ml蒸馏水中加入7ml高氯酸和0.5g
钼酸氨。
(2)5%~6%氨水
【
实验操作
】
1．用分析天平准确称取待测的核酸样品500mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量水稀释。然
后用5%~6%氨水调至pH7加蒸馏水定容到50ml。于紫外分光光度计上测定260nm光吸收值，计算
核酸浓度：
A
260
× N
RNA浓度（µg/ml）=
0.024×L
A
260
× N
DNA浓度（µg/ml）=
0.020×L
式中，A
260
——260nm波长处光吸收读数；
L——比色皿的厚度，1cm；
N——稀释倍数
2．如果待测的核酸样品中含有大分子核酸，需加钼酸氨—高氯酸沉淀剂，沉淀除去，测定上清液
260nm波长处A值作为对照。
取两支离心管，向第一支管内加入2m1样品溶液和2m1蒸馏水，向第二支管内加入2m1样品溶
液和2m1沉淀剂(以除去大分子核酸)作为对照。混匀，在冰浴中放置，30min后离心(3000rpm)，从
第一、第二管中分别吸取0.5m1上清液，用蒸馏水定容到50m1。用光程为lcm的石英比色杯于260nm
波长处测其光吸收值(A
l
和A
2
)。计算核酸浓度：
l
－A
2
A
×N
RNA或DNA浓度µg/ml =
0.024(或0.020)×L
1ml待测液中测得的核酸微克数
核酸%=
1ml待测液中制品的微克数
4
×100
【
实验结果讨论
】
蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在
260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定
影响不大。RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值>1.8；当样品中蛋白质
含量较高时比值即下降。
【
思考题
】
1．若样品中含有蛋白质，应如何排除干扰?
2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正?
（二）二苯胺法测定DNA含量
【
实验目的
】
掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法
【
实验原理
】
DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊
酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，其反应为：
DNA(脱氧核糖残基)
H
+
HO
CH
2
C
O
CH
2
CH
2
CHO
二苯胺
兰色化合物
蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40µg ~400µg范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
【
实验材料
】
1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计。
2.实验试剂
（1）DNA标准溶液：准确称取小牛胸腺DNA10mg，以0.1mol/L NaOH溶液溶解，转移至50ml
容量瓶中，用0.1mol／L NaOH溶液稀释至刻度。浓度为200µg/m1；
（2） DNA样品液：用上述实验方法提取的DNA样品
（3）二苯胺试剂：使用前称取1g结晶二苯胺，溶于100m1分析纯冰醋酸中，加60%过氯酸10m1
混匀。临用前加入1m1 1.6%乙醛溶液。此溶剂应为无色。
【
实验操作
】
1．标准曲线的绘制
取干燥试管6支，编号，按表所示加入试剂。
试剂
DNA标准溶液，ml
蒸馏水，ml
二苯胺试剂，ml
A
595
管号
0
0.0
2.0
4.0
1
0.4
1.6
4.0
2
0.8
1.2
4.0
3
1.2
0.8
4.0
4
1.6
0.4
4.0
5
2.0
0
4.0
加完毕，混匀，于60℃恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处测定吸光度，以零号管作对照，
5
绘制标准曲线。
2．样品测定
取试管3支，两支为样品管，—支为对照管。对照管操作与标准曲线零号管相同。向每支样品
管中加入2m1样品液及4ml二苯胺试剂，60℃保温1h，冷却后于595nm测定吸光度，以对照管调
零点。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相应吸光度的DNA含量。
【
实验结果讨论
】
1．该反应灵敏度较低，但方法简便，目前仍广泛使用。
2．其他糖及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等，对此反应由干扰，测定前应尽量除去。
【
思考题
】
二苯胺法测定DNA含量应注意哪些事项？
（三）地衣酚显色法测定RNA含量
【
实验目的
】
掌握地衣酚显色法测定RNA含量的原理和方法
【
实验原理
】
RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的戊糖又可转变为糠醛，在FeCl
3
或CuCl
2
催化下，糠醛
与地衣酚（3,5—二羟基甲苯）反应形成绿色复合物，该产物在670nm处有最大吸收。当RNA浓度
为20μg／m1~250μg／m1时，吸光度与RNA浓度成正比。
【
实验材料
】
1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计。
2.实验试剂
（1）RNA标准液：称取10mgRNA(需先定磷确定其纯度)用少量水溶解(若不溶可用2mol／L NaOH
溶液调至pH7.0)，定容至100m1，浓度为100µg／ml。
（2） RNA样品液：用上述实验方法提取的RNA样品
（3） 地衣酚试剂：取0.1g地衣酚溶于100ml浓盐酸，再加入0.1gFeCl
3
·6H
2
0。该溶液使用前新
鲜配制。
【
实验操作
】
1．标准曲线的绘制
取干燥试管6支，编号，按表所示加入试剂。
试剂
RNA标准溶液，ml
蒸馏水，ml
地衣酚试剂，ml
A
670
管号
0
0.0
1.0
3.0
1
0.1
0.9
3.0
2
0.2
0.8
3.0
3
0.3
0.7
3.0
4
0.4
0.6
3.0
5
0.5
0.5
3.0
加样完毕后混匀，于沸水浴中加热20min，取出置自来水中冷却，以零号管为对照，670nm处
测吸光度。以吸光度为纵坐标，RNA浓度为横坐标作图，绘制标准曲线。
2．样品测定
取试管3支，两支为样品管，—支为空白管，在样品管中加入1.0m1样品液，再加3.0m1地衣
6
酚试剂，混匀，置沸水浴中加热20min，取出冷却。空白管操作与标准曲线制作中零号管相同。以
空白管调零点，于670nm处测吸光度，根据吸光度值从标准曲线上查出相应的RNA含量。
【
实验结果讨论
】
1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，
可先测定样品中DNA含量，再算出RNA含量。
2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则
将发生干扰。
【
思考题
】
配制地衣酚试剂时，为什么要加FeCl
3
，6H
2
0
?
（四）定磷法测定核酸的含量
【
实验目的
】
掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法
【
实验原理
】
核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5%~9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，测
定其含磷量即可求出核酸的量。
核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷
钼酸铵沉淀，其反应为：
＋
PO
4
3-
+3NH
4
+12MoO
4
+24H
+
(NH
4
)
3
PO
4
. +12Mo0
3
·6H
2
0+6H
2
0
在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含
量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高
准确性。
【
实验材料
】
1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计
2.实验试剂
（1）标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移
至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol／L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每1m1
含磷400µg，临用时准确稀释20倍(20µg／m1)。
（2）定磷试剂
① 17％硫酸：17m1浓硫酸(相对密度l.84)缓缓加入到83m1水中。
②2.5％钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml水。
③10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水，并贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可
使用，呈深黄甚至棕色即失效。
临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2): 溶液(3):水=1:1:1:2(V: V)
（3）5%氨水, 27%硫酸
【
实验操作
】
1．磷标准曲线的绘制
取干燥试管7支编号，按表所示加入试剂。
7
试剂
磷标准溶液，ml
蒸馏水，ml
定磷试剂，ml
A
660
管号
0
0.0
3.0
3.0
1
0.05
2.95
3.0
2
0.1
0.9
3.0
3
0.2
2.8
3.0
4
0.3
0.7
3.0
5
0.4
2.6
3.0
6
0.5
2.5
3.0
加毕摇匀，在45℃水浴中保温10min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度。以磷含
量为横坐标，吸光度为纵坐标作图。
2．总磷的测定
称粗核酸0.1g，用少量水溶解(若不溶，可滴加5%氨水至pH7.0)，待全部溶解后，移至50ml
容量瓶中，加水至刻度(此溶液含样品2mg/m1)，即配成核酸溶液。
吸取上述核酸溶液1.0ml，置大试管中，加入2.5m1 27%硫酸及一粒玻璃珠，于通风橱内直火加
热至溶液透明(切勿烧干)，表示消化完成。冷却后取下，将消化液移入100ml容量瓶中，以少量蒸
馏水洗涤试管两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加蒸溜水至刻度，混匀后吸取3m1溶液置试管中，
加3m1定磷试剂，45℃水浴保温10min后取出, 测A
660
。
3．无机磷的测定
吸取核酸溶液1ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取3.0ml置试管中，加定磷试
剂3.0m1，45℃水浴中保温10min后取出, 测A
660
。
4．结果处理
总磷A
660
－无机磷A
660
=有机磷A
660
从标准曲线上查出有机磷微克数(X)，按下式计算样品中核酸百分含量：
X
× 稀释倍数×11
测定时取样毫升数
× 100%
核酸(％) =
样品重量（微克）
【
实验结果讨论
】
定磷法即可以测定DNA的含量又可以测定RNA的含量，若DNA中混有RNA或RNA中混有
DNA，都会影响结果的准确性。
【
思考题
】
定磷法操作中有哪些关键环节
？
8