2024年2月21日发(作者：祢若薇)
·７７４·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）：７７４－８０网络出版时间：２０２１－５－２８１０：１２ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２１０５２７．１４５８．０１６．ｈｔｍｌ长链非编码ＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１对小鼠糖尿病心肌病的作用杨 帆１，王丽宏２（１．南京大学医学院附属鼓楼医院内分泌科，江苏南京 ２１０００８；２．哈尔滨医科大学附属第二医院内分泌科，黑龙江哈尔滨 １５０００１）ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０６．００８文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０６－０７７４－０７中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２２１１；Ｒ３４２２；Ｒ５４２２；Ｒ５４２２０２５；Ｒ５８７２摘要：目的 研究长链非编码ＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１在糖尿病心肌病中的作用及机制。方法 Ｃ５７ＢＬ／６小鼠分为对照组和糖尿病（ＤＭ）组，注射链脲佐菌素建立ＤＭ模型后喂养８周建立糖尿病心肌病模型。ＤＭ组小鼠注射慢病毒干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１表达。ｑＲＴＰＣＲ检测小鼠左心室Ｋｃｎｑ１ｏｔ１表达。超声心动图、ＨＥ和Ｍａｓｓｏｎ染色评价小鼠左心室结构和功能，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ、ＧＦ１／Ｓｍａｄｓ通路表达Ⅲ和Ｔβ水平。免疫组化、ｑＲＴＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测左心室ＮＬ、ｃａｓｐａｓｅ１、ＩＬ１ＳＤＭＤＮ表达。结果 与对照组ＲＰ３β和Ｇ相比，Ｋｃｎｑ１ｏｔ１在ＤＭ小鼠左心室中明显升高，注射Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ慢病毒后被抑制。ＤＭ组小鼠心脏收缩和舒张功能明显下降，出现心肌细胞肥大及纤维化；干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后ＤＭ小鼠心脏功能和结构明显改善。此外，干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后胶原表达下调，ＴＧＦ１／Ｓｍａｄｓ通路被抑制，焦亡β相关分子表达下调。结论 ＬｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１在糖尿病心肌病小鼠中表达升高，干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１能够通过抑制心肌焦亡，抑制ＴＧＦ１／Ｓｍａｄｓ通路，减轻糖尿病心肌间质纤维化，β改善心脏结构和功能。关键词：长链非编码ＲＮＡ；Ｋｃｎｑ１ｏｔ１；糖尿病心肌病；焦亡；纤维化；ＮＬＲＰ３收稿日期：２０２１－０３－０３，修回日期：２０２１－０４－０２基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１７７０８０９）１９８９－），女，博士，研究方向：糖尿病心血管并发作者简介：杨 帆（症，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｆａｎ＿０２１０＠１２６．ｃｏｍ；王丽宏（１９７３－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：糖尿病心血管并发症，通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｎｄ６６８８＠１６３．ｃｏｍ开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）： 糖尿病已经成为危害公共健康的全球性问题，成为威胁人类健康的“第三大杀手”。流行病学调查显示，糖尿病患者发生心力衰竭的风险明显高于０％－８０％糖尿病患者最终死于糖尿正常人，超过５１］病的心血管并发症［。糖尿病心肌病（ｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒ，ＤＣＭ）是糖尿病的一个重要心血管并ｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ发症，是导致糖尿病患者出现心衰、恶性心律失常、ＣＭ的有猝死的重要原因之一。目前尚缺乏治疗Ｄ效办法，因此，积极探索ＤＣＭ的发病机制、寻找新的治疗靶点，对ＤＣＭ的防治无疑具有重要的科学意义。焦亡是与炎症相关的细胞程序性死亡，可触发细胞膜孔形成，促进胞质促炎因子的释放和细胞裂２］解［。焦亡过程中，核苷酸结合寡聚化结构域样受（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ体蛋白３ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ３，ＮＬＲＰ３）可募集并与含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶１（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅｓｐｅ，ｃａｓｐａｓｅ１）的前体（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ１）ｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１相互作用，形成ＮＬＲＰ３炎性体并促进ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ１的自催化裂解，产生活化的ｃａｓｐａｓｅ１，后者可将ｐｒｏＩＬ１ｒｏＩＬ１８加工为成熟体ＩＬ１Ｌ１８。β和ｐβ和Ｉ同时，活化的ｃａｓｐａｓｅ１可以将消皮素Ｄ（ｇａｓｄｅｒｍｉｎＤ，ＧＳＤＭＤ）切割成两个片段，产生的氨基末端片段３］通过其成孔作用破坏细胞膜，促进细胞焦亡［。以ＣＭ中激活，抑制焦亡后糖往的研究表明，焦亡在ＤｂｉｌｉｔｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙｗｅｒｅａｇｇｒａｖａｔｅｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇｓｉＲＺＮＲＦ２．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＺＮＲＦ２ｐｒｏｔｅｃｔｓＰＣ１２ｃｅｌｌｓｆｒｏｍｔｈｅｉｎｊｕｒｙｃａｕｓｅｄｂｙＯＧＤ／Ｒａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｏｘｙｇｅｎｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；ＰＣ１２ｃｅｌｌｓ；ＺＮＲＦ２；ａｕｔｏｐｈａｇｙ；ｍＴＯＲ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＺＮＲＦ２ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＬＣ３ＩＩａｎｄＢｅｃｌｉｎ１ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ６２ｐｒｏｔｅｉｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎＯＧＤ／Ｒｇｒｏｕｐ．，ｔｈｅｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｗａｓｅｎＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＯＧＤ／Ｒｇｒｏｕｐｈａｎｃｅｄ，ｔｈｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎＬＶＺＮＲＦ２ｇｒｏｕｐ．Ｉｎｃｏｎｔｒａｓｔ，ｔｈｅｃｅｌｌｖｉａ
中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）４６］尿病动物模型心脏形态和功能明显改善［。值得·７７５·ｅｉｃａ）；高分辨率小动物超声成像系统（加机（德国Ｌ拿大ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）；电子血糖仪及试纸（德国罗氏）；台式低速冷冻离心机（中国奥盛仪器）；转移电泳槽和电泳仪（美国ＢｉｏＲａｄ）。１．４ 动物模型的制备和分组 ６－８周龄雄性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，体质量（１８－２０）ｇ，适应性喂养１周。１周后将小鼠随机分组，分别为正常组（ｃｏｎｔｒｏｌ组）、糖尿病组（ＤＭ组）、糖尿病小鼠注射Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ慢病毒组（ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ组）和糖尿ｃｒｓｈＲＮＡ慢病毒组（ＤＭ＋Ｓｃｒ病小鼠注射对照Ｓ注意的是，焦亡与心肌纤维化密切相关：ＩＬ１β和ＩＬ１８激活可以促进氧化应激，导致成纤维细胞增殖和胶原的产生。然而，目前关于ＤＣＭ心肌纤维化与焦亡的调控机制尚未完全阐明。ＮＡ（ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｌｎ长链非编码ＲｃＲＮＡ）是一种转录本长度＞２００个核苷酸的非编码ＲＮＡ，不能编码蛋白质，但可以在表观遗传学、转录及转录后水平调控基因的表达，参与多种病理生ｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１与多种心脏疾病密切相理过程。Ｌ关，包括急性心肌损伤和心律失常等［７－８］。然而，Ｋｃｎｑ１ｏｔ１在ＤＣＭ中的作用及机制尚不清楚。本研究的主要目的是阐明ｌｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１对ＤＣＭ心肌焦亡、炎症和纤维化的调控作用，为ＤＣＭ提供了新的思路和潜在的治疗靶点。１ 材料与方法１．１ 实验动物 Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（１８－２０）ｇ，♂，购于哈尔滨医科大学实验动物中心，许可证号ＳＣＸＫ（黑）２０１９００１，在哈尔滨医科大学北方医学转化中心动物饲养房喂养。专人饲养，自由进食、自由进水。动物饲养房在标准状态下，温度维持在（２３±１）℃，湿度维持在（５５±５）％，通风状态良好，每天光照１２ｈ、黑暗１２ｈ交替进行。实验过程严格遵守中国《实验动物福利伦理审查指南》和美国《实验动物饲养管理和使用指南》（第８版），并通过哈尔滨医科大学伦理委员会批准。１．２ 试剂 链脲佐菌素（北京索来宝），货号：Ｓ８０５０；慢病毒（中国上海吉玛），货号：Ｐ４２４０１００ＵＧ；ＴＲＩｚｏｌ（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），货号：１５５９６０２６；ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴｋｉｔ（日本Ｔｏｙｏｂｏ），货号：ＦＳＱ１０１；ＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ（日本Ｔｏｙｏｂｏ），货号：ＱＰＫ２０１；ＲＩＰＡ裂解液（美国Ｔｈｅｒｍｏ），货号：ＦＮＮ００１１；蛋白酶和磷酸酶抑制剂（瑞士Ｒｏｃｈｅ），货号：５８９２７９１００１；蛋白Ｍａｒｋｅｒ（美国Ｔｈｅｒｍｏ），货号：Ｊ４４９０８ＭＬ；ＥＣＬ显色液（中国Ｔａｎｏｎ），货号：１８０５００１；ＢＣＡ试剂盒（中国碧云天），货号：Ｐ０００９；ＰＶＤＦ膜（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），货号：ＩＳＥＱ０００１０；山羊抗兔、抗鼠ＩｇＧ二抗（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），货号：ＡＡＴ１６７２０；ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１、ＩＬ１β、ＧＳＤＭＤＮ、ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ、ｃｏｌｌａｇｅｎⅢ、ＴＧＦβ１、ｐＳｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ２／３抗体（美国ＣＳＴ），货号：１５１０１、２２５５、１２７０３、３６４２、７２０２６、３０５６５Ｓ、３１０８、５３３６、９５２０、５３３９、９５２３；ＧＡＰＤＨ抗体（中国ＺＳＧＢＢＩＯ），货号：ＴＡ０８。１．３ 仪器 ７５００Ｆａｓｔ实时定量ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ）；Ｏｄｙｓｓｅｙ成像系统（美国ＬＩＣＯＲ）；冰冻切片ｓｈＲＮＡ组）。采用小剂量多次连续腹腔注射链脲佐菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ，ＳＴＺ）方法建立糖尿病模型，ＳＴＺ溶于柠檬酸盐缓冲液（ｐＨ４２）中，５０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１连续腹腔内注射５ｄ，正常对照组给予等体积的柠檬酸盐缓冲液注射，最后一次注射７２ｈ后，尾静脉采血检测空腹血糖＞１６７ｍｍｏｌ·Ｌ－１则糖尿病造模成功。随后，小鼠尾静脉注射Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ慢病毒，建立动物体内干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１模型；ＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ组注射对照ＳｃｒｓｈＲＮＡ慢病毒，ｃｏｎｔｒｏｌ组和ＤＭ组注射等剂量的生理盐水。合成Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ慢病毒。１×１０１２ＴＵ·Ｌ－１慢病毒溶于５０μＬ生理盐水，小鼠尾静脉注射［９］。Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ的序列为５′ＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＴＣＴＴ３′。经尾静脉给予小鼠上述药物后继续喂养８周，建立ＤＣＭ模型。１．５ 超声心动图检测 小鼠腹腔注射１０％的水合氯醛进行麻醉，应用高清小动物超声成像系统Ｖｅｖｏ１１００留取左室长轴二维超声图像，计算左室射血分数（ｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ，ＥＦ％）和短轴缩短率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ，ＦＳ％）。１．６ ＨＥ染色 制备石蜡切片。将石蜡切片脱蜡，蒸馏水洗涤，给予ＨＥ染色，流水冲洗３０ｓ，梯度乙醇及二甲苯浸泡，处理后封片、晾干，留取ＨＥ染色图像，观察心肌形态。１．７ Ｍａｓｓｏｎ染色 石蜡切片脱蜡至水，洗涤后给予Ｍａｓｓｏｎ染色剂染色，０２％冰醋酸洗涤并用０１％磷钨酸分化，亮绿染液染色，待纤维化病灶染至淡绿色用０２％冰醋酸洗涤，梯度酒精脱水，处理后封片、晾干，留取Ｍａｓｓｏｎ染色图像，观察心肌纤维化程度。１．８ ＲＮＡ提取和实时定量ＰＣＲ 取小鼠的左心室组织，ＴＲＩｚｏｌ提取总ＲＮＡ，测定ＲＮＡ浓度和纯度，应用Ｔｏｙｏｂｏ逆转录试剂盒逆转录为ｃＤＮＡ，反应程序为３７℃１５ｍｉｎ，９８℃５ｍｉｎ，４℃Ｈｏｌｄｉｎｇ。应用ＴｏｙｏｂｏＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ试剂盒进行ｑＲＴＰＣＲ。以ＧＡＰＤＨ为内参，采用２－ΔΔＣｔ法计算目的基因相对含
··７７６中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）量。主要引物序列如Ｔａｂ１所示。Ｔａｂ１ ＳｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｏｒｑＲＴＰＣＲＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅＫｃｎｑ１ｏｔ１Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＣＡＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣ３′ＮＬＲＰ３Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＣＴＡＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＣ３′ｃａｓｐａｓｅ１Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＡＣＡＣＧＴＣＴＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＡＴＡＡＣＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡ３′ＩＬ１βＦｏｒｗａｒｄ５′ＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＴＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴ３′ＧＡＰＤＨＦｏｒｗａｒｄ５′ＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧ３１．９ 蛋白质印迹分析 用ＲＩＰＡ裂解液提取心脏组织蛋白，ＢＣＡ法检测蛋白浓度，并上样、电泳、转膜，分别加入ＮＬＲＰ３（１∶８００）、ｃａｓｐａｓｅ１（１∶５００）、ＩＬ１β（１∶８００）、ＧＳＤＭＤＮ（１∶５００）、ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ（１∶１０００）、ｃｏｌｌａｇｅｎⅢ（１∶１０００）、ＴＧＦβ１（１∶８００）、ｐｓｍａｄ２／３（１∶８００）、ｓｍａｄ２／３（１∶８００）、ＧＡＰＤＨ（１∶２０００）一抗，４℃过夜，ＴＢＳＴ洗膜加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔ＩｇＧ（１∶２５００）二抗，３７℃孵育１ｈ，ＥＣＬ显色，拍照。１．１０ 免疫组织化学染色 将小鼠左心室组织放入４％多聚甲醛中固定、包埋、冰冻，切成５μｍ的薄片置于载玻片，４％多聚甲醛固定２０ｍｉｎ，穿透液穿透１ｈ。山羊血清封闭２ｈ，加入ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１、ＩＬ１β和ＧＳＤＭＤＮ一抗（１∶２００），４℃过夜，二抗湿盒中常温孵育１ｈ，加入ＤＡＰＩ，室温下静置３０ｍｉｎ，显微镜观察。１．１１ 统计学分析 采用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ６０软件对实验数据进行统计。数值资料以珋ｘ±ｓ表示，两组间比较应用ｔｔｅｓｔ，多组间比较应用单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）。２ 结果２．１ 糖尿病小鼠干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１的表达 本实验构建ＤＣＭ的动物模型，通过对Ｃ５７ＢＬ／６小鼠尾静脉病毒注射实现体内干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ，每组５只。ｑＲＴＰＣＲ检测发现，与对照组相比，Ｋｃｎｑ１ｏｔ１在糖尿病小鼠的心脏组织明显升高，给予Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ后被明显抑制（Ｆｉｇ１）。２．２ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏功能的影响 为了研究Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏功能的影响，将各组小鼠麻醉后进行超声心动图检测。结果表明，与对照组相比，ＤＭ组小鼠左心室功能明显减退，表现为心脏收缩和舒张功能下降，ＥＦ和ＦＳ明显降低；体内干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后，糖尿病小鼠心脏功Ｆｉｇ１ ＳｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｖｉｖｏ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｌｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴＰＣＲ．１：Ｃｏｎｔｒｏｌ；２：ＤＭ；３：ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ；４：ＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ．Ｐ＜００５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ，＃Ｐ＜００５ｖｓＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ．能明显改善（Ｆｉｇ２Ａ－Ｃ）。２．３ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏结构的影响 采用ＨＥ染色和Ｍａｓｓｏｎ染色的方法评价各组小鼠的心脏形态学改变和纤维化程度。ＨＥ染色结果表明，与对照组相比，糖尿病小鼠左心室心肌细胞肥大，排列紊乱；干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后，心肌细胞肥大减轻（Ｆｉｇ３Ａ）。Ｍａｓｓｏｎ染色结果表明，糖尿病小鼠左心室胶原沉积增多，心肌纤维化加重；干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后，胶原沉积减少，纤维化改善（Ｆｉｇ３Ｂ）。２．４ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏胶原的影响 为进一步探讨ｌｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心肌纤维化的调控作用，应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测心脏胶原的表达情况。实验结果表明，ＤＭ组小鼠心脏组织ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ和ｃｏｌｌａｇｅｎⅢ蛋白表达水平明显升高，ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ组胶原表达减少（Ｆｉｇ４）。上述结果说明，干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１可减少糖尿病小鼠心肌胶原沉积。２．５ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏ＴＧＦβ１／Ｓｍａｄｓ通路的影响 我们进一步检测纤维化相关的ＴＧＦβｌ／Ｓｍａｄｓ信号转导通路的表达情况。结果表明，与对照组相比，ＤＭ组小鼠心脏组织ＴＧＦβ１、ｐＳｍａｄ２和ｐＳｍａｄ３蛋白表达水平明显升高，ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ组上述蛋白表达显著减少（Ｆｉｇ５）。这说明干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１可抑制糖尿病小鼠ＴＧＦβｌ／Ｓｍａｄｓ信号转导通路的激活，减少心肌胶原沉积。２．６ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏焦亡的影响 为研究Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心肌焦亡的影响，采用免疫组化、ｑＲＴＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测各组小鼠心脏组织中ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１、ＩＬ１β和ＧＳＤＭＤＮ的表达水平。免疫组化分析表明，与对照组相比，ＤＭ组小鼠心脏组织ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１和
中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）··７７７珋Ｆｉｇ２ ＣａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎａｔｔｅｎｕａｔｅｄｂｙｓｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ（ｘ±ｓ，ｎ＝５）Ａ：Ｍｍｏｄｅｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍｓｏｆｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｌｅ；Ｂ：ＥＦｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ；Ｃ：ＦＳｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．１：Ｃｏｎｔｒｏｌ；２：ＤＭ；３：ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ；４：ＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ．Ｐ＜００５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ，＃Ｐ＜００５ｖｓＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ．Ｆｉｇ３ ＣａｒｄｉａｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄｂｙｓｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ（ｎ＝５）Ａ：ＨＥ；Ｂ：Ｍａｓｓｏｎ’ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅｓｔａｉｎｉｎｇｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｓｃａｌｅｂａｒ，５０μｍ．ＩＬ１ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ组ＮＬＲＰ３、β表达提高，ｃａｓｐａｓｅ１和ＩＬ１Ｆｉｇ６Ａ）。同时，各组β表达减少（ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１和ＩＬ１ＲＮＡ和蛋白表达水β的ｍ平也表现为相似的趋势（Ｆｉｇ６Ｂ－Ｅ）。此外，糖尿病小鼠心脏组织ＧＳＤＭＤＮ的蛋白表达明显增多，然ｃｎｑ１ｏｔ１后，其表达下调（Ｆｉｇ６Ａ、Ｅ）。这些而抑制Ｋ结果表明，干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１可抑制糖尿病小鼠心脏焦亡的激活。３ 讨论 ＤＣＭ是ＤＭ的一种慢性进展性的心血管并发症，主要是由于ＤＭ引起心肌纤维化、心脏结构改１０］变、舒张功能异常，进而引发收缩功能障碍［。ＬｎｃＲＮＡ能够在表观遗传学、转录及转录后水平调控多种疾病。Ｋｃｎｑ１ｏｔ１是一种ｌｎｃＲＮＡ，能够调控包括ｃｎｑ１ｏｔ１在ＤＣＭ心脏疾病在内的多种疾病，然而Ｋ的表达及调控机制尚不清楚。本研究发现，Ｋｃｎｑ１ｏｔ１在ＳＴＺ诱导的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠左心室组织中表达明显增多。ＤＭ小鼠体内干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后能够
·７８０·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＭｏｌＭｅｄ，ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ２０１９，２３（９）：５８５９－６７．［１２］ＬｉＸ，ＷａｎｇＨ，ＹａｏＢ，ｅｔａｌ．ｌｎｃＲＮＡＨ１９／ｍｉＲ６７５ａｘｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｓｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＶＤＡＣ１ｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１６，６：３６３４０．ｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ［１３］ＺｈｏｕＸ，ＺｈａｎｇＷ，ＪｉｎＭ，ｅｔａｌ．ｌｎｃＲＮＡＭＩＡＴｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｃｏｍｐｅｔｉｎｇｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＲＮＡｔｏｕｐｒｅｇｕｌａｔｅＤＡＰＫ２ｂｙｓｐｏｎｇｉｎｇｍｉＲ２２３ｐｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ，２０１７，８（７）：ｅ２９２９．［１４］ＧａｏＸ，ＧｅＪ，ＬｉＷ，ｅｔａｌ．ＬｎｃＲＮＡＫＣＮＱ１ＯＴ１ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｐａｒｔｉｃｌｅｉｎｄｕｃｅｄｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｉｎｄｕｃｉｎｇｍａｃｒｏｐｈａｇｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２０１８，３９９（４）：３７５－ｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｍｉＲ２１ａ５ｐ８６．［１５］ＪｉｎＸ，ＪｉｎＨ，ＳｈｉＹ，ｅｔａｌ．ＬｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫＣＮＱ１ＯＴ１ｐｒｏｍｏｔｅｓｃａｔａｒａｃｔｏｇｅｎｅｓｉｓｖｉａｍｉＲ２１４ａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣａｓｐａｓｅ１ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，２０１７，４２（１）：２９５－３０５．［１６］ＲｅｎＫ，ＸｕＲ，ＨｕａｎｇＪ，ｅｔａｌ．ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫＣＮＱ１ＯＴ１ｄｅｐｒｅｓｓｅｄｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｐａｃｌｉｔａｘｅｌｉｎｌｕｎｇ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１７，８０ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（２）：２４３－５０．［１７］ＪｉａＣ，ＣｈｅｎＨ，ＺｈａｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓｉｎｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１９，６７：３１１－８．［１８］ＡｒｔｌｅｔｔＣＭ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｔｈｅＮＬＲＰ３ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｉｎｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．ＯｐｅｎＲｈｅｕｍａｔｏｌＪ，２０１２，６：８０－６．［５］ ＹａｎｇＦ，ＱｉｎＹ，ＷａｎｇＹ，ｅｔａｌ．ＭｅｔｆｏｒｍｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅＮＬＲＰ３ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｖｉａＡＭＰＫ／ｍＴＯＲｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒ［Ｊ］．ＩｎｔＪＢｉｏｌＳｃｉ，２０１９，１５（５）：１０１０－９．ｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ［６］ ＳｈｉＨ，ＺｈｅｎＺ，ＷａｎｇＸ，ｅｔａｌ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｄｕｃｅｓｅｌｅａｓｅｆｒｏｍＡＲＰＥ１９ｃｅｌｌｓｖｉａＲＯＳｍｅｄｉａｔｅｄＮＬＲＰ３ｉｎＩＬ１βｒｆｌａｍｍａｓｏｍｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｕｎｄｅｒｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，２０１５，４６３（４）：１０７１－６．［７］ ＣｈｅｎＹ，ＺｈａｎｇＺ，ＺｈｕＤ，ｅｔａｌ．ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＫＣＮＱ１ＯＴ１ａｔｔｅｎｕａｔｅｓｃａｒｄｉａｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｔｈｒｏｕｇｈｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉＲ２０５４／ＡＫＴ３ａｘｉｓ［Ｊ］．ＪＴｈｏｒａｃＤｉｓ，２０２０，１２（９）：４７７１－８０．［８］ ＣｏｔｏＥ，ＣａｌｖｏＤ，ＲｅｇｕｅｒｏＪＲ，ｅｔａｌ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡＫＣＮＱ１ＯＴ１ｐｒｏｍｏｔｅｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｗａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ［Ｊ］．Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１７，９（８）：ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃｃａｒｄｉａｃｌｏｎｇＱＴ１０４９－５７．［９］ ＪｉａｎｇＹＮ，ＤｕＷＪ，ＣｈｕＱ，ｅｔａｌ．ＤｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１：ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｒｓｅｎｉｃｔｒｉｏｘ［Ｊ］．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，２０１８，ｉｄｅｉｎｄｕｃｅｄｌｏｎｇＱＴｓｙｎｄｒｏｍｅ４５（１）：１９２－２０２．［１０］邱晓霞，李逸朗，梁关凤，等．经典Ｗｎｔ／ａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ７Ｌ２信βｃＪ］．中国药理学通报，号通路在１型糖尿病心肌病中的作用［２０１９，３５（８）：１１０４－９．［１０］ＱｉｕＸＸ，ＬｉＹＬ，ＬｉａｎｇＧＦ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｎｏｎｉｃａｌＷｎｔ／ｃａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ７Ｌ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒβｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．ＣｈｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＢｕｌｌ，２０１９，３５（８）：１１０４－９．［１１］ＺｈａｎｇＷ，ＸｕＷ，ＦｅｎｇＹ，ｅｔａｌ．ＮｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎＲｏｌｅｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｍｉｃｅｗｉｔｈｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ１２ＹＡＮＧＦａｎ，ＷＡＮＧＬｉｈｏｎｇ（１．ＤｅｐｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ＤｒｕｍＴｏｗｅｒＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００８，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨａｒｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５０００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｍｉｃｅｗｉｔｈｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ（ＤＣＭ）ａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃ５７ＢＬ／６ｍｉｃｅｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｄｉａｂｅｔｉｃｇｒｏｕｐ（ＤＭ）．ＤＭｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ．ＴｈｅＤＣＭｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｆｅｅｄｉｎｇｆｏｒｅｉｇｈｔｗｅｅｋｓ．Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｗａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｔｏｉｎｈｉｂｉｔＫｃｎｑ１ｏｔ１．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｔｈｅｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｌｅｏｆｍｉｃｅｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴＰＣＲ．Ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｕｓｉｎｇｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ，ＨＥａｎｄＭａｓｓｏｎｓｔａｉｎｉｎｇ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｃｏｌｌａｇｅｎⅠ，ｃｏｌｌａｇｅｎⅢａｎｄＴＧＦ１／Ｓｍａｄｓｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙβ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＮＬＲＰ３ｃａｓｐａｓｅ１，ＩＬ１ｎｄＧＳＤＭＤＮｉｎｔｈｅｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒβａ，ｔｉｓｓｕｅｏｆｍｉｃｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｑＲＴＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｑＲＴＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｔｈｅｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＫｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ．Ｔｈｅｓｙｓｔｏｌｉｃａｎｄｄｉａｓｔｏｌｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｈｅａｒｔｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅ，ａｎｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙａｎｄｍｙｏｃａｒｄｉｃｒｅａｓｅｄａｌｆｉｂｒｏｓｉｓａｐｐｅａｒｅｄａｓｗｅｌｌ．Ｔｈｅｃａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍ，ｃｏｌｌａｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｖｅｄ１／ＳｍａｄｓｐａｔｈｗａｙｓｗｅｒｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄａｆｔｅｒａｎｄｔｈｅＴＧＦβｓｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｌｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅＳＴＺｉｎｄｕｃｅｄｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ．ＳｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１ｃａｎａｌｌｅｖｉ１／ＳｍａｄｓｐａｔｈａｔｅｔｈｅｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅＴＧＦβｗａｙ，ｔｈｕｓａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ；Ｋｃｎｑ１ｏｔ１；ｄｉａｂｅｔｅｓｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ；ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ；ｆｉｂｒｏｓｉｓ；ＮＬＲＰ３
2024年2月21日发(作者：祢若薇)
·７７４·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）：７７４－８０网络出版时间：２０２１－５－２８１０：１２ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２１０５２７．１４５８．０１６．ｈｔｍｌ长链非编码ＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１对小鼠糖尿病心肌病的作用杨 帆１，王丽宏２（１．南京大学医学院附属鼓楼医院内分泌科，江苏南京 ２１０００８；２．哈尔滨医科大学附属第二医院内分泌科，黑龙江哈尔滨 １５０００１）ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０６．００８文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０６－０７７４－０７中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２２１１；Ｒ３４２２；Ｒ５４２２；Ｒ５４２２０２５；Ｒ５８７２摘要：目的 研究长链非编码ＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１在糖尿病心肌病中的作用及机制。方法 Ｃ５７ＢＬ／６小鼠分为对照组和糖尿病（ＤＭ）组，注射链脲佐菌素建立ＤＭ模型后喂养８周建立糖尿病心肌病模型。ＤＭ组小鼠注射慢病毒干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１表达。ｑＲＴＰＣＲ检测小鼠左心室Ｋｃｎｑ１ｏｔ１表达。超声心动图、ＨＥ和Ｍａｓｓｏｎ染色评价小鼠左心室结构和功能，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ、ＧＦ１／Ｓｍａｄｓ通路表达Ⅲ和Ｔβ水平。免疫组化、ｑＲＴＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测左心室ＮＬ、ｃａｓｐａｓｅ１、ＩＬ１ＳＤＭＤＮ表达。结果 与对照组ＲＰ３β和Ｇ相比，Ｋｃｎｑ１ｏｔ１在ＤＭ小鼠左心室中明显升高，注射Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ慢病毒后被抑制。ＤＭ组小鼠心脏收缩和舒张功能明显下降，出现心肌细胞肥大及纤维化；干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后ＤＭ小鼠心脏功能和结构明显改善。此外，干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后胶原表达下调，ＴＧＦ１／Ｓｍａｄｓ通路被抑制，焦亡β相关分子表达下调。结论 ＬｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１在糖尿病心肌病小鼠中表达升高，干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１能够通过抑制心肌焦亡，抑制ＴＧＦ１／Ｓｍａｄｓ通路，减轻糖尿病心肌间质纤维化，β改善心脏结构和功能。关键词：长链非编码ＲＮＡ；Ｋｃｎｑ１ｏｔ１；糖尿病心肌病；焦亡；纤维化；ＮＬＲＰ３收稿日期：２０２１－０３－０３，修回日期：２０２１－０４－０２基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１７７０８０９）１９８９－），女，博士，研究方向：糖尿病心血管并发作者简介：杨 帆（症，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｆａｎ＿０２１０＠１２６．ｃｏｍ；王丽宏（１９７３－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：糖尿病心血管并发症，通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｎｄ６６８８＠１６３．ｃｏｍ开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）： 糖尿病已经成为危害公共健康的全球性问题，成为威胁人类健康的“第三大杀手”。流行病学调查显示，糖尿病患者发生心力衰竭的风险明显高于０％－８０％糖尿病患者最终死于糖尿正常人，超过５１］病的心血管并发症［。糖尿病心肌病（ｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒ，ＤＣＭ）是糖尿病的一个重要心血管并ｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ发症，是导致糖尿病患者出现心衰、恶性心律失常、ＣＭ的有猝死的重要原因之一。目前尚缺乏治疗Ｄ效办法，因此，积极探索ＤＣＭ的发病机制、寻找新的治疗靶点，对ＤＣＭ的防治无疑具有重要的科学意义。焦亡是与炎症相关的细胞程序性死亡，可触发细胞膜孔形成，促进胞质促炎因子的释放和细胞裂２］解［。焦亡过程中，核苷酸结合寡聚化结构域样受（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ体蛋白３ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ３，ＮＬＲＰ３）可募集并与含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶１（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅｓｐｅ，ｃａｓｐａｓｅ１）的前体（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ１）ｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１相互作用，形成ＮＬＲＰ３炎性体并促进ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ１的自催化裂解，产生活化的ｃａｓｐａｓｅ１，后者可将ｐｒｏＩＬ１ｒｏＩＬ１８加工为成熟体ＩＬ１Ｌ１８。β和ｐβ和Ｉ同时，活化的ｃａｓｐａｓｅ１可以将消皮素Ｄ（ｇａｓｄｅｒｍｉｎＤ，ＧＳＤＭＤ）切割成两个片段，产生的氨基末端片段３］通过其成孔作用破坏细胞膜，促进细胞焦亡［。以ＣＭ中激活，抑制焦亡后糖往的研究表明，焦亡在ＤｂｉｌｉｔｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙｗｅｒｅａｇｇｒａｖａｔｅｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇｓｉＲＺＮＲＦ２．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＺＮＲＦ２ｐｒｏｔｅｃｔｓＰＣ１２ｃｅｌｌｓｆｒｏｍｔｈｅｉｎｊｕｒｙｃａｕｓｅｄｂｙＯＧＤ／Ｒａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｏｘｙｇｅｎｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；ＰＣ１２ｃｅｌｌｓ；ＺＮＲＦ２；ａｕｔｏｐｈａｇｙ；ｍＴＯＲ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＺＮＲＦ２ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＬＣ３ＩＩａｎｄＢｅｃｌｉｎ１ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ６２ｐｒｏｔｅｉｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎＯＧＤ／Ｒｇｒｏｕｐ．，ｔｈｅｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｗａｓｅｎＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＯＧＤ／Ｒｇｒｏｕｐｈａｎｃｅｄ，ｔｈｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎＬＶＺＮＲＦ２ｇｒｏｕｐ．Ｉｎｃｏｎｔｒａｓｔ，ｔｈｅｃｅｌｌｖｉａ
中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）４６］尿病动物模型心脏形态和功能明显改善［。值得·７７５·ｅｉｃａ）；高分辨率小动物超声成像系统（加机（德国Ｌ拿大ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）；电子血糖仪及试纸（德国罗氏）；台式低速冷冻离心机（中国奥盛仪器）；转移电泳槽和电泳仪（美国ＢｉｏＲａｄ）。１．４ 动物模型的制备和分组 ６－８周龄雄性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，体质量（１８－２０）ｇ，适应性喂养１周。１周后将小鼠随机分组，分别为正常组（ｃｏｎｔｒｏｌ组）、糖尿病组（ＤＭ组）、糖尿病小鼠注射Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ慢病毒组（ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ组）和糖尿ｃｒｓｈＲＮＡ慢病毒组（ＤＭ＋Ｓｃｒ病小鼠注射对照Ｓ注意的是，焦亡与心肌纤维化密切相关：ＩＬ１β和ＩＬ１８激活可以促进氧化应激，导致成纤维细胞增殖和胶原的产生。然而，目前关于ＤＣＭ心肌纤维化与焦亡的调控机制尚未完全阐明。ＮＡ（ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｌｎ长链非编码ＲｃＲＮＡ）是一种转录本长度＞２００个核苷酸的非编码ＲＮＡ，不能编码蛋白质，但可以在表观遗传学、转录及转录后水平调控基因的表达，参与多种病理生ｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１与多种心脏疾病密切相理过程。Ｌ关，包括急性心肌损伤和心律失常等［７－８］。然而，Ｋｃｎｑ１ｏｔ１在ＤＣＭ中的作用及机制尚不清楚。本研究的主要目的是阐明ｌｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１对ＤＣＭ心肌焦亡、炎症和纤维化的调控作用，为ＤＣＭ提供了新的思路和潜在的治疗靶点。１ 材料与方法１．１ 实验动物 Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（１８－２０）ｇ，♂，购于哈尔滨医科大学实验动物中心，许可证号ＳＣＸＫ（黑）２０１９００１，在哈尔滨医科大学北方医学转化中心动物饲养房喂养。专人饲养，自由进食、自由进水。动物饲养房在标准状态下，温度维持在（２３±１）℃，湿度维持在（５５±５）％，通风状态良好，每天光照１２ｈ、黑暗１２ｈ交替进行。实验过程严格遵守中国《实验动物福利伦理审查指南》和美国《实验动物饲养管理和使用指南》（第８版），并通过哈尔滨医科大学伦理委员会批准。１．２ 试剂 链脲佐菌素（北京索来宝），货号：Ｓ８０５０；慢病毒（中国上海吉玛），货号：Ｐ４２４０１００ＵＧ；ＴＲＩｚｏｌ（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），货号：１５５９６０２６；ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴｋｉｔ（日本Ｔｏｙｏｂｏ），货号：ＦＳＱ１０１；ＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ（日本Ｔｏｙｏｂｏ），货号：ＱＰＫ２０１；ＲＩＰＡ裂解液（美国Ｔｈｅｒｍｏ），货号：ＦＮＮ００１１；蛋白酶和磷酸酶抑制剂（瑞士Ｒｏｃｈｅ），货号：５８９２７９１００１；蛋白Ｍａｒｋｅｒ（美国Ｔｈｅｒｍｏ），货号：Ｊ４４９０８ＭＬ；ＥＣＬ显色液（中国Ｔａｎｏｎ），货号：１８０５００１；ＢＣＡ试剂盒（中国碧云天），货号：Ｐ０００９；ＰＶＤＦ膜（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），货号：ＩＳＥＱ０００１０；山羊抗兔、抗鼠ＩｇＧ二抗（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），货号：ＡＡＴ１６７２０；ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１、ＩＬ１β、ＧＳＤＭＤＮ、ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ、ｃｏｌｌａｇｅｎⅢ、ＴＧＦβ１、ｐＳｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ２／３抗体（美国ＣＳＴ），货号：１５１０１、２２５５、１２７０３、３６４２、７２０２６、３０５６５Ｓ、３１０８、５３３６、９５２０、５３３９、９５２３；ＧＡＰＤＨ抗体（中国ＺＳＧＢＢＩＯ），货号：ＴＡ０８。１．３ 仪器 ７５００Ｆａｓｔ实时定量ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ）；Ｏｄｙｓｓｅｙ成像系统（美国ＬＩＣＯＲ）；冰冻切片ｓｈＲＮＡ组）。采用小剂量多次连续腹腔注射链脲佐菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ，ＳＴＺ）方法建立糖尿病模型，ＳＴＺ溶于柠檬酸盐缓冲液（ｐＨ４２）中，５０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１连续腹腔内注射５ｄ，正常对照组给予等体积的柠檬酸盐缓冲液注射，最后一次注射７２ｈ后，尾静脉采血检测空腹血糖＞１６７ｍｍｏｌ·Ｌ－１则糖尿病造模成功。随后，小鼠尾静脉注射Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ慢病毒，建立动物体内干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１模型；ＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ组注射对照ＳｃｒｓｈＲＮＡ慢病毒，ｃｏｎｔｒｏｌ组和ＤＭ组注射等剂量的生理盐水。合成Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ慢病毒。１×１０１２ＴＵ·Ｌ－１慢病毒溶于５０μＬ生理盐水，小鼠尾静脉注射［９］。Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ的序列为５′ＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＴＣＴＴ３′。经尾静脉给予小鼠上述药物后继续喂养８周，建立ＤＣＭ模型。１．５ 超声心动图检测 小鼠腹腔注射１０％的水合氯醛进行麻醉，应用高清小动物超声成像系统Ｖｅｖｏ１１００留取左室长轴二维超声图像，计算左室射血分数（ｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ，ＥＦ％）和短轴缩短率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ，ＦＳ％）。１．６ ＨＥ染色 制备石蜡切片。将石蜡切片脱蜡，蒸馏水洗涤，给予ＨＥ染色，流水冲洗３０ｓ，梯度乙醇及二甲苯浸泡，处理后封片、晾干，留取ＨＥ染色图像，观察心肌形态。１．７ Ｍａｓｓｏｎ染色 石蜡切片脱蜡至水，洗涤后给予Ｍａｓｓｏｎ染色剂染色，０２％冰醋酸洗涤并用０１％磷钨酸分化，亮绿染液染色，待纤维化病灶染至淡绿色用０２％冰醋酸洗涤，梯度酒精脱水，处理后封片、晾干，留取Ｍａｓｓｏｎ染色图像，观察心肌纤维化程度。１．８ ＲＮＡ提取和实时定量ＰＣＲ 取小鼠的左心室组织，ＴＲＩｚｏｌ提取总ＲＮＡ，测定ＲＮＡ浓度和纯度，应用Ｔｏｙｏｂｏ逆转录试剂盒逆转录为ｃＤＮＡ，反应程序为３７℃１５ｍｉｎ，９８℃５ｍｉｎ，４℃Ｈｏｌｄｉｎｇ。应用ＴｏｙｏｂｏＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ试剂盒进行ｑＲＴＰＣＲ。以ＧＡＰＤＨ为内参，采用２－ΔΔＣｔ法计算目的基因相对含
··７７６中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）量。主要引物序列如Ｔａｂ１所示。Ｔａｂ１ ＳｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｏｒｑＲＴＰＣＲＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅＫｃｎｑ１ｏｔ１Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＣＡＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣ３′ＮＬＲＰ３Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＣＴＡＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＣ３′ｃａｓｐａｓｅ１Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＡＣＡＣＧＴＣＴＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＡＴＡＡＣＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡ３′ＩＬ１βＦｏｒｗａｒｄ５′ＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＴＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴ３′ＧＡＰＤＨＦｏｒｗａｒｄ５′ＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣ３′Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧ３１．９ 蛋白质印迹分析 用ＲＩＰＡ裂解液提取心脏组织蛋白，ＢＣＡ法检测蛋白浓度，并上样、电泳、转膜，分别加入ＮＬＲＰ３（１∶８００）、ｃａｓｐａｓｅ１（１∶５００）、ＩＬ１β（１∶８００）、ＧＳＤＭＤＮ（１∶５００）、ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ（１∶１０００）、ｃｏｌｌａｇｅｎⅢ（１∶１０００）、ＴＧＦβ１（１∶８００）、ｐｓｍａｄ２／３（１∶８００）、ｓｍａｄ２／３（１∶８００）、ＧＡＰＤＨ（１∶２０００）一抗，４℃过夜，ＴＢＳＴ洗膜加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔ＩｇＧ（１∶２５００）二抗，３７℃孵育１ｈ，ＥＣＬ显色，拍照。１．１０ 免疫组织化学染色 将小鼠左心室组织放入４％多聚甲醛中固定、包埋、冰冻，切成５μｍ的薄片置于载玻片，４％多聚甲醛固定２０ｍｉｎ，穿透液穿透１ｈ。山羊血清封闭２ｈ，加入ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１、ＩＬ１β和ＧＳＤＭＤＮ一抗（１∶２００），４℃过夜，二抗湿盒中常温孵育１ｈ，加入ＤＡＰＩ，室温下静置３０ｍｉｎ，显微镜观察。１．１１ 统计学分析 采用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ６０软件对实验数据进行统计。数值资料以珋ｘ±ｓ表示，两组间比较应用ｔｔｅｓｔ，多组间比较应用单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）。２ 结果２．１ 糖尿病小鼠干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１的表达 本实验构建ＤＣＭ的动物模型，通过对Ｃ５７ＢＬ／６小鼠尾静脉病毒注射实现体内干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ，每组５只。ｑＲＴＰＣＲ检测发现，与对照组相比，Ｋｃｎｑ１ｏｔ１在糖尿病小鼠的心脏组织明显升高，给予Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ后被明显抑制（Ｆｉｇ１）。２．２ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏功能的影响 为了研究Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏功能的影响，将各组小鼠麻醉后进行超声心动图检测。结果表明，与对照组相比，ＤＭ组小鼠左心室功能明显减退，表现为心脏收缩和舒张功能下降，ＥＦ和ＦＳ明显降低；体内干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后，糖尿病小鼠心脏功Ｆｉｇ１ ＳｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｖｉｖｏ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｌｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴＰＣＲ．１：Ｃｏｎｔｒｏｌ；２：ＤＭ；３：ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ；４：ＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ．Ｐ＜００５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ，＃Ｐ＜００５ｖｓＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ．能明显改善（Ｆｉｇ２Ａ－Ｃ）。２．３ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏结构的影响 采用ＨＥ染色和Ｍａｓｓｏｎ染色的方法评价各组小鼠的心脏形态学改变和纤维化程度。ＨＥ染色结果表明，与对照组相比，糖尿病小鼠左心室心肌细胞肥大，排列紊乱；干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后，心肌细胞肥大减轻（Ｆｉｇ３Ａ）。Ｍａｓｓｏｎ染色结果表明，糖尿病小鼠左心室胶原沉积增多，心肌纤维化加重；干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后，胶原沉积减少，纤维化改善（Ｆｉｇ３Ｂ）。２．４ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏胶原的影响 为进一步探讨ｌｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心肌纤维化的调控作用，应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测心脏胶原的表达情况。实验结果表明，ＤＭ组小鼠心脏组织ｃｏｌｌａｇｅｎⅠ和ｃｏｌｌａｇｅｎⅢ蛋白表达水平明显升高，ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ组胶原表达减少（Ｆｉｇ４）。上述结果说明，干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１可减少糖尿病小鼠心肌胶原沉积。２．５ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏ＴＧＦβ１／Ｓｍａｄｓ通路的影响 我们进一步检测纤维化相关的ＴＧＦβｌ／Ｓｍａｄｓ信号转导通路的表达情况。结果表明，与对照组相比，ＤＭ组小鼠心脏组织ＴＧＦβ１、ｐＳｍａｄ２和ｐＳｍａｄ３蛋白表达水平明显升高，ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ组上述蛋白表达显著减少（Ｆｉｇ５）。这说明干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１可抑制糖尿病小鼠ＴＧＦβｌ／Ｓｍａｄｓ信号转导通路的激活，减少心肌胶原沉积。２．６ 干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心脏焦亡的影响 为研究Ｋｃｎｑ１ｏｔ１对糖尿病小鼠心肌焦亡的影响，采用免疫组化、ｑＲＴＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测各组小鼠心脏组织中ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１、ＩＬ１β和ＧＳＤＭＤＮ的表达水平。免疫组化分析表明，与对照组相比，ＤＭ组小鼠心脏组织ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１和
中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）··７７７珋Ｆｉｇ２ ＣａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎａｔｔｅｎｕａｔｅｄｂｙｓｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ（ｘ±ｓ，ｎ＝５）Ａ：Ｍｍｏｄｅｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍｓｏｆｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｌｅ；Ｂ：ＥＦｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ；Ｃ：ＦＳｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．１：Ｃｏｎｔｒｏｌ；２：ＤＭ；３：ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ；４：ＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ．Ｐ＜００５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ，＃Ｐ＜００５ｖｓＤＭ＋ＳｃｒｓｈＲＮＡ．Ｆｉｇ３ ＣａｒｄｉａｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄｂｙｓｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ（ｎ＝５）Ａ：ＨＥ；Ｂ：Ｍａｓｓｏｎ’ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅｓｔａｉｎｉｎｇｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｓｃａｌｅｂａｒ，５０μｍ．ＩＬ１ＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ组ＮＬＲＰ３、β表达提高，ｃａｓｐａｓｅ１和ＩＬ１Ｆｉｇ６Ａ）。同时，各组β表达减少（ＮＬＲＰ３、ｃａｓｐａｓｅ１和ＩＬ１ＲＮＡ和蛋白表达水β的ｍ平也表现为相似的趋势（Ｆｉｇ６Ｂ－Ｅ）。此外，糖尿病小鼠心脏组织ＧＳＤＭＤＮ的蛋白表达明显增多，然ｃｎｑ１ｏｔ１后，其表达下调（Ｆｉｇ６Ａ、Ｅ）。这些而抑制Ｋ结果表明，干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１可抑制糖尿病小鼠心脏焦亡的激活。３ 讨论 ＤＣＭ是ＤＭ的一种慢性进展性的心血管并发症，主要是由于ＤＭ引起心肌纤维化、心脏结构改１０］变、舒张功能异常，进而引发收缩功能障碍［。ＬｎｃＲＮＡ能够在表观遗传学、转录及转录后水平调控多种疾病。Ｋｃｎｑ１ｏｔ１是一种ｌｎｃＲＮＡ，能够调控包括ｃｎｑ１ｏｔ１在ＤＣＭ心脏疾病在内的多种疾病，然而Ｋ的表达及调控机制尚不清楚。本研究发现，Ｋｃｎｑ１ｏｔ１在ＳＴＺ诱导的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠左心室组织中表达明显增多。ＤＭ小鼠体内干扰Ｋｃｎｑ１ｏｔ１后能够
·７８０·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＭｏｌＭｅｄ，ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ２０１９，２３（９）：５８５９－６７．［１２］ＬｉＸ，ＷａｎｇＨ，ＹａｏＢ，ｅｔａｌ．ｌｎｃＲＮＡＨ１９／ｍｉＲ６７５ａｘｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｓｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＶＤＡＣ１ｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１６，６：３６３４０．ｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ［１３］ＺｈｏｕＸ，ＺｈａｎｇＷ，ＪｉｎＭ，ｅｔａｌ．ｌｎｃＲＮＡＭＩＡＴｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｃｏｍｐｅｔｉｎｇｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＲＮＡｔｏｕｐｒｅｇｕｌａｔｅＤＡＰＫ２ｂｙｓｐｏｎｇｉｎｇｍｉＲ２２３ｐｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ，２０１７，８（７）：ｅ２９２９．［１４］ＧａｏＸ，ＧｅＪ，ＬｉＷ，ｅｔａｌ．ＬｎｃＲＮＡＫＣＮＱ１ＯＴ１ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｐａｒｔｉｃｌｅｉｎｄｕｃｅｄｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｉｎｄｕｃｉｎｇｍａｃｒｏｐｈａｇｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２０１８，３９９（４）：３７５－ｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｍｉＲ２１ａ５ｐ８６．［１５］ＪｉｎＸ，ＪｉｎＨ，ＳｈｉＹ，ｅｔａｌ．ＬｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫＣＮＱ１ＯＴ１ｐｒｏｍｏｔｅｓｃａｔａｒａｃｔｏｇｅｎｅｓｉｓｖｉａｍｉＲ２１４ａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣａｓｐａｓｅ１ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，２０１７，４２（１）：２９５－３０５．［１６］ＲｅｎＫ，ＸｕＲ，ＨｕａｎｇＪ，ｅｔａｌ．ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫＣＮＱ１ＯＴ１ｄｅｐｒｅｓｓｅｄｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｐａｃｌｉｔａｘｅｌｉｎｌｕｎｇ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１７，８０ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（２）：２４３－５０．［１７］ＪｉａＣ，ＣｈｅｎＨ，ＺｈａｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓｉｎｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１９，６７：３１１－８．［１８］ＡｒｔｌｅｔｔＣＭ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｔｈｅＮＬＲＰ３ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｉｎｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．ＯｐｅｎＲｈｅｕｍａｔｏｌＪ，２０１２，６：８０－６．［５］ ＹａｎｇＦ，ＱｉｎＹ，ＷａｎｇＹ，ｅｔａｌ．ＭｅｔｆｏｒｍｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅＮＬＲＰ３ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｖｉａＡＭＰＫ／ｍＴＯＲｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒ［Ｊ］．ＩｎｔＪＢｉｏｌＳｃｉ，２０１９，１５（５）：１０１０－９．ｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ［６］ ＳｈｉＨ，ＺｈｅｎＺ，ＷａｎｇＸ，ｅｔａｌ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｄｕｃｅｓｅｌｅａｓｅｆｒｏｍＡＲＰＥ１９ｃｅｌｌｓｖｉａＲＯＳｍｅｄｉａｔｅｄＮＬＲＰ３ｉｎＩＬ１βｒｆｌａｍｍａｓｏｍｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｕｎｄｅｒｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，２０１５，４６３（４）：１０７１－６．［７］ ＣｈｅｎＹ，ＺｈａｎｇＺ，ＺｈｕＤ，ｅｔａｌ．ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＫＣＮＱ１ＯＴ１ａｔｔｅｎｕａｔｅｓｃａｒｄｉａｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｔｈｒｏｕｇｈｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉＲ２０５４／ＡＫＴ３ａｘｉｓ［Ｊ］．ＪＴｈｏｒａｃＤｉｓ，２０２０，１２（９）：４７７１－８０．［８］ ＣｏｔｏＥ，ＣａｌｖｏＤ，ＲｅｇｕｅｒｏＪＲ，ｅｔａｌ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡＫＣＮＱ１ＯＴ１ｐｒｏｍｏｔｅｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｗａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ［Ｊ］．Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１７，９（８）：ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃｃａｒｄｉａｃｌｏｎｇＱＴ１０４９－５７．［９］ ＪｉａｎｇＹＮ，ＤｕＷＪ，ＣｈｕＱ，ｅｔａｌ．ＤｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１：ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｒｓｅｎｉｃｔｒｉｏｘ［Ｊ］．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，２０１８，ｉｄｅｉｎｄｕｃｅｄｌｏｎｇＱＴｓｙｎｄｒｏｍｅ４５（１）：１９２－２０２．［１０］邱晓霞，李逸朗，梁关凤，等．经典Ｗｎｔ／ａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ７Ｌ２信βｃＪ］．中国药理学通报，号通路在１型糖尿病心肌病中的作用［２０１９，３５（８）：１１０４－９．［１０］ＱｉｕＸＸ，ＬｉＹＬ，ＬｉａｎｇＧＦ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｎｏｎｉｃａｌＷｎｔ／ｃａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ７Ｌ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒβｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．ＣｈｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＢｕｌｌ，２０１９，３５（８）：１１０４－９．［１１］ＺｈａｎｇＷ，ＸｕＷ，ＦｅｎｇＹ，ｅｔａｌ．ＮｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎＲｏｌｅｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｍｉｃｅｗｉｔｈｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ１２ＹＡＮＧＦａｎ，ＷＡＮＧＬｉｈｏｎｇ（１．ＤｅｐｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ＤｒｕｍＴｏｗｅｒＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００８，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨａｒｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５０００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｍｉｃｅｗｉｔｈｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ（ＤＣＭ）ａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃ５７ＢＬ／６ｍｉｃｅｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｄｉａｂｅｔｉｃｇｒｏｕｐ（ＤＭ）．ＤＭｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ．ＴｈｅＤＣＭｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｆｅｅｄｉｎｇｆｏｒｅｉｇｈｔｗｅｅｋｓ．Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｗａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｔｏｉｎｈｉｂｉｔＫｃｎｑ１ｏｔ１．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｔｈｅｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｌｅｏｆｍｉｃｅｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴＰＣＲ．Ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｕｓｉｎｇｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ，ＨＥａｎｄＭａｓｓｏｎｓｔａｉｎｉｎｇ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｃｏｌｌａｇｅｎⅠ，ｃｏｌｌａｇｅｎⅢａｎｄＴＧＦ１／Ｓｍａｄｓｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙβ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＮＬＲＰ３ｃａｓｐａｓｅ１，ＩＬ１ｎｄＧＳＤＭＤＮｉｎｔｈｅｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒβａ，ｔｉｓｓｕｅｏｆｍｉｃｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｑＲＴＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｑＲＴＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｔｈｅｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＫｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡ．Ｔｈｅｓｙｓｔｏｌｉｃａｎｄｄｉａｓｔｏｌｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｈｅａｒｔｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅ，ａｎｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙａｎｄｍｙｏｃａｒｄｉｃｒｅａｓｅｄａｌｆｉｂｒｏｓｉｓａｐｐｅａｒｅｄａｓｗｅｌｌ．Ｔｈｅｃａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍ，ｃｏｌｌａｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｖｅｄ１／ＳｍａｄｓｐａｔｈｗａｙｓｗｅｒｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄａｆｔｅｒａｎｄｔｈｅＴＧＦβｓｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅＤＭ＋Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ｓｈＲＮＡｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｌｎｃＲＮＡＫｃｎｑ１ｏｔ１ｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅＳＴＺｉｎｄｕｃｅｄｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ．ＳｉｌｅｎｃｉｎｇＫｃｎｑ１ｏｔ１ｃａｎａｌｌｅｖｉ１／ＳｍａｄｓｐａｔｈａｔｅｔｈｅｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅＴＧＦβｗａｙ，ｔｈｕｓａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ；Ｋｃｎｑ１ｏｔ１；ｄｉａｂｅｔｅｓｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ；ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ；ｆｉｂｒｏｓｉｓ；ＮＬＲＰ３