2024年3月18日发(作者：第枫)
・综述与专论・
2008
年第
32
卷 第
9
期 第
406
页
hertzpulsespectroscopytostudythecrystallinestructure
ofadrug:acasestudyofthepolymorphsofranitidine
hydrochloride[J].
JPharmSci,
2003,92
(
4
)
:831
2
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[23]StrachanCJ,TadayPF,NewnhamDA,
etal
.Using
terahertzpulsedspectroscopytoquantifypharmaceutical
polymorphismandcrystallinity[J].
JPharmSci,
2005,
94
(
4
)
:837
2
846
1
[24]
吉特
,
赵红卫
,
张增艳
,
等
.D
2
,L
2和
DL
2青霉胺的太赫
406
2008
,Vol.
32
,No.
9
ProgressinPharmaceuticalSciences
Sci,
2004,362
(
1815
)
:351
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363
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)
:
1159
2
1162
1
[25]ationofterahertzspectroscopytophar
2
maceuticalscience[J].
PhilosTransactAMathPhysEng
聚乙二醇修饰对蛋白质类药物药代动力学的
影响及相关的药动学研究方法
曹 进
,
田 浤
,
高向东
3
(
中国药科大学生物科学与技术学院
,
江苏南京
210038
)
[
摘 要
]
聚乙二醇
(
PEG
)
修饰在改善蛋白质类药物的理化性质的同时也会导致其体内药代动力学行为发生变
化。而
PEG
修饰剂的分子大小、分子结构和修饰位点对蛋白质类药物的体内药代动力学行为和活性具有一定影
响。根据有关文献报道
,
讨论这些影响因素
,
并介绍在对
PEG
修饰药物进行药代动力学研究时采用的新方法
,
如
:
群体药代动力学预测法及体内测定修饰物含量的电化学发光法和
PEG
特异性抗体法等。
[
关键词
]
聚乙二醇修饰
;
药代动力学
;
群体药代动力学
;
电化学发光法
;PEG
抗体
[
中图分类号
]
O629.73;R969.1
[
文献标识码
]
A
[
文章编号
]1001-5094
(
2008
)
09-0406-06
TheEffectofPEG
2
modificationonthePharmacokineticsofProtein
andtheRelatedPharmacokineticResearchMethods
CAOJin,
TIANHong,
GAOXiang
2
dong
(
SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China
)
[Abstract]
PEG
2
modificationwasassumedtobeoneoftheoptimalapproachesimprovingthephysical
andchemicalcharacteristicsandchangingpharmacokineticpropertiesofproteininbiologicalmedication
luencesofPEGmolecularsize,molecularstructureandmodificationsiteonthePEG
2
protein
pharmacokineticpropertiesandbiologicalactivityinvivohavebeenreviewedaccordingtothereferences.
[
接受日期
]
2008
2
05
2
26
3
通讯作者
:
高向东
,
教授
;
研究方向
:
生物大分子结构与功能
;
Tel:025
2
83271298;
E
2
mail:xdgao@
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
2008
,Vol.
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,No.
9
407
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Somerelatedpharmacokineticresearchmethods,suchaspopulationpharmacokinetics,andelectro
2
chemi
2
calluminescence
(
ECL
)
andPEGspecificantibodymethodwhichareusedtodeterminePEG
2
proteinin
vivowerealsointroduced.
[Keywords]
PEG
2
modification;Pharmacokinetic;Populationpharmacokinetics;ECL;PEGantibody
随着基因工程技术的发展和成熟
,
蛋白质类药
物由于具有生物活性高、特异性好等优点
,
已成为一
类重要的现代医药产品。然而在临床应用中
,
蛋白
质类药物还存在着一些问题
,
如
:
半衰期较短
,
容易被
循环系统清除
;
免疫原性较强
,
易引发变态反应
;
稳定
性较差
,
容易被降解
;
水溶性较差
,
给药途径受限等。
研究人员针对上述问题提出了一些解决方法
,
其中最
为成熟的是利用聚乙二醇
(
PEG
)
进行结构修饰。
PEG
是一种无毒、高亲水性的大分子聚合物
,
由乙二醇单体聚合而成
,
根据聚合度的不同
,
其相对
分子质量从数百至数万不等。
PEG
与蛋白质的非
活性必需基团结合后
,
蛋白质药物的相对分子质量
增加
,
表面的一些抗原决定簇被遮蔽
,
带电性质也会
发生一定的变化
,
这些改变通常可以使蛋白质类药
物的稳定性增加、体内半衰期延长、免疫原性降低。
迄今为止
,
获得美国
FDA
批准上市的
PEG
修饰蛋
白质类药物已有
7
种
,
如表
1
所示。
表
1
在美国获准上市的
PEG
修饰蛋白质类药物
(
2
modifiedproteindrugsapprovedbyFDAU.S
)
商品名
Adagen
Oncospar
Pegintron
Neulasta
Pegasys
Peginyerferon
Mircera
有效成分
PEG
2腺苷脱氨酶
PEG
2天冬酰胺酶
PEG
2干扰素
α
2b
PEG
2重组人粒细胞集落刺激因子
PEG
2干扰素
α
2a
PEG
2干扰素
α
2a,
利巴韦林
PEG
2促红细胞生成素
β
生产公司
Enzon
Enzon
Schering
Amgen
Hoffman
2
LaRoche
Hoffman
2
LaRoche
Hoffman
2
LaRoche
上市时间
1990
1994
2001
2002
2002
2004
2007
PEG
修饰改变了蛋白质类药物的理化性质
,
进
而影响其在体内的药代动力学行为
,
因此
PEG
修饰
蛋白质类药物的药代动力学研究受到广泛的关注
,
成为筛选
PEG
修饰药物的重要评判指标。本文就
PEG
修饰对蛋白质类药物在体内的药代动力学行
为和活性的影响进行初步探讨
,
并介绍近年来有关
PEG
修饰蛋白质类药物的药代动力学研究方法。
修饰对蛋白质类药物体内药代动力学行为
的影响
PEG
修饰对蛋白质类药物体内药代动力学行
为的影响与
PEG
分子的大小、形状、修饰位点及连
接方式有关。
1.1
PEG
的相对分子质量
PEG
修饰使得蛋白质类药物的相对分子质量
稳定性加强
,
从而使其在体内的半衰期延长
,
体内滞
留时间增加。这对于本身半衰期很短的多肽类或抗
[2
2
3]
体片段类药物非常有利。
目前在有关研究中使用的
PEG
的相对分子质
量从几千到几万不等
,
作为修饰物的支链
PEG
分子
的相对分子质量可达
60000,
线性
PEG
分子也达到
[4]
30000
。但是究竟
PEG
的相对分子质量为多少才
合适
,
还必须根据被修饰物本身的性质和需要进行
选择。
[5]
Nakaoka
等
对
PEG
的分子质量与其血浆清除
速度的关系进行了研究
,
发现其分子质量与清除时
间呈非直线型相关
:
当
PEG
的相对分子质量在
8000
到
30000
之间时
,
其清除速率变化很大
;
但当相对
分子质量达到
30000
以上时
,
对其清除速率的影响
会大大减小
(
见图
1
)
。
增大、肾小球滤过率降低
[1]
、抗酶解能力和热力学
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ProgressinPharmaceuticalSciences
好的抗病毒效果。
由于
PEG
分子质量与所修饰蛋白质类药物的
药代动力学行为之间的关系不是直线型的
,
因此单
纯加大
PEG
的相对分子质量未必能达到改善蛋白
质类药物药动学特性的目的。只有在保持药物原有
生物活性的基础上
,
选择适当分子质量的
PEG
修
饰
,
同时兼顾体内生物活性和半衰期
,
才能最大限度
[9]
地发挥
PEG
修饰蛋白类药物的体内治疗效能。
1.2
PEG
的分子结构
图
1
PEG
的分子质量与其静脉注射后半衰期的关系
(
ationplotbetweenPEGmolecularweightand
itshalflifeinbloodafterintravenousadministration
)
目前采用的
PEG
修饰剂可分为线性
PEG
分子
和支链
PEG
分子
,PEG
的分子结构在很大程度上影
响其对所修饰蛋白质药物分子表面抗原决定簇、带
电基团以及其他特殊位点的遮蔽效果。总的来说
,
支链
PEG
分子由于具有“伞状效应”
,
对被修饰物药
代动力学行为的改善更为有效
,
能够保护蛋白质分
子不被蛋白水解酶、抗体或者免疫细胞所识别、水解
[10]
和清除
(
见图
2
)
。
由于
PEG
分子具有很强的亲水性
,
同时其柔性
结构可以无规则卷曲
,
并不像蛋白质分子本身那样
折叠成致密结构
,
所以
PEG
分子在体内的“实际”分
子质量会比理论值大得多。当
PEG
修饰在蛋白质
[6]
表面时依然存在这种现象
,
如
Yu
等使用相对分
子质量分别为
1000
、
2000
、
5000
的
PEG
(
PEG1000
、
PEG2000
和
PEG5000
)
修饰鲑鱼降钙素
(
sCT
)
,
结果
发现
,
用
PEG5000
修饰的
sCT,
其动力学分子质量
(
即根据动力学实验结果计算所得的分子质量
)
达
259000,
远大于其实际分子质量
84000
。由此看
来
,
直接将修饰后蛋白质分子的理论分子质量大小
作为其能否通过肾小球滤过的依据并不可靠
,
更不
能用理论分子质量作为评价其药代动力学改善程度
的唯一指标
,
而应根据动物实验的实际结果进行综
合全面的评价。同时
,Yu
等在实验中还发现
,PEG
修饰的
sCT
体的内活性也受
PEG
分子大小的影响
,
PEG5000
修饰的
sCT
生物活性下降最多
,
只有原型
的
30%,
而
PEG2000
的修饰物的生物活性保留
了
80%
。
[7]
Li
等
在对重组人粒细胞集落刺激因子
(
rhG
2
CSF
)
进行
PEG
修饰时也提出了大分子
PEG
修饰会
[8]
导致
rhG
2
CSF
生物活性丧失的问题。而
Paolo
对
α
2a
和
PEG
2
IFN
α
2b
的药代动力学行为进
PEG
2
IFN
行研究后发现
,
虽然随着
PEG
分子质量的增大
,
PEG
2
IFN
的体外抗病毒活性降低
,
但因其在体内血
液中滞留时间增长
,
就有更多机会浸润到血管外的
组织中
,
这样它与人体外周组织器官中存在的
HCV
病毒接触的时间更长
,
从而使修饰后的
IFN
具有更
图
2
支链
PEG
分子的“伞状效应”对蛋白质的保护作用
(
tectiveeffectof
“
umbrella
2
like
”
structureof
branchedPEGonprotein
)
研究认为
,
由线性
PEG
分子修饰的
蛋白类药物的体内分布容积比由支链
PEG
分子修
Yeong
等
[11]
饰的更大
,
而支链
PEG
分子修饰物在保持体外生物
活性和延长体内停留时间方面更具优势。用一种三
聚体结构的新型支链
PEG
分子作为修饰剂对
IFN
2
α
2a
进行修饰后
,
其半衰期比未修饰物延长了
40
倍
,
可作为一种长效制剂
;
而且
,
与用相对分子质量
为
40000
的支链
PEG
修饰的
IFN
相比
,
这种新型支
链
PEG
的修饰物的抗病毒活性更好。
笔者所在实验室合成了一种全新的支链
PEG
分子
mPEG2
2
N
2
NHS,
并将其用于对重组复合干扰素
(
IFNcon
)
的修饰。用恒河猴进行的体内药代动力
学研究证明
,
经这种支链
PEG
修饰后的
IFNcon
的
代谢半衰期明显延长。
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1.3
PEG
修饰的位点
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肿瘤坏死因子
I
型受体
(
r
2
Hu
2
sTNF
2
RI
)
在小鼠、大
鼠、短尾猴、狒狒和黑猩猩体内的药代动力学参数时
发现
,
该药的体内分布容积和血浆清除率与动物的
体重相关。因此该作者推断
,
在制定该药的临床试
验用药剂量时
,
可用在动物体内测得的药代动力学
数据作为参考。群体药代动力学预测的作用也在于
此
:
借助于已经取得的动物体内、外试验的数据对测
试药物的人体药动学参数进行预测
,
明确其主要药
动学特性
,
以消除研究中的盲目性
,
节约时间和
[15]
成本。
使用混合效应建模技术
(
mixed
2
effectsmodeling
techniques
)
可对来源于不同种属的分散数据进行整
合
,
建立的模型用于预测另一种群的药物分布或者
用于估算种属间的药代动力学参数差异。如
,Koen
[16]
等建立了一个群体药代动力学模型
,
采用种间异
速生长比例法
(
allometricscaling
)
对
PEG
2
EPO
在人
体内的药代动力学行为进行了预测。他们给大鼠、
兔、猴和狗单次静脉和皮下注射
PEG
2
EPO,
并采集
不同时间点的血样共计
927
份
,
用
NONMENV
软件
进行数据分析
,
得到了一步吸收和中央室线性清除
的二室模型
;
同时
,
他们还对动物体重、脑重、性别和
妊娠等与药代动力学参数之间关系进行了研究
;
然
后
,
他们使用非参数靴值分析法
(
non
2
parametric
bootstrapanalysis
)
建立起了药代动力学预测模型
,
利用这个模型可对
PEG
2
EPO
在男性体内的药代动
力学参数
,
包括系统清除率
(
CL
)
、中央室分布容积
率
(
Vc
)
、区间交换率
(
Q
)
、周边室分布容积
(
Vp
)
和
吸收速率常数
(
Ka
)
进行预测。这几位研究者认为
,
这种用在动物体内得到的药代动力学参数来推测人
体药动学的方法
,
对于
PEG
2
EPO
临床研究时给药剂
量的正确选择起到了十分重要的作用。
从临床前数据预测人体药动学参数是一个具有
挑战性的工作
,
近年来国外学者在此方面做了诸多
尝试
,
目前开展较为广泛的是人体分布容积和清除
率的预测
,
也有对半衰期和生物利用度进行预
[21
2
22]
测的报道。相信将群体药代动力学用于对
PEG
修饰蛋白质的研究将会对认识其体内基本过
程具有重要的指导作用
,
帮助人们更好地认识
PEG
修饰蛋白质类药物在体内的药代动力学行为。
2
1
2
修饰物的体内含量测定方法
[17
2
20]
早期的
PEG
修饰通常是随机的
,
但随着
PEG
修饰技术的不断发展
,
近来已可通过
PEG
醛水合
法、酶法定点连接或者基因工程技术引入特殊基团
等手段达到
PEG
定点修饰的目的。将
PEG
定点修
饰技术与蛋白质结构和功能关系的研究相结合
,
可
以更有把握地选择
PEG
修饰位点
,
使
PEG
修饰的
蛋白质类药物在体内能具有较好的生物活性和药代
动力学特征。
通过
PEG
定点修饰的方法可以有针对性地在
蛋白质药物抗原位点或者其他影响体内分布的位点
[12]
进行修饰。如
Yu
等先将蓖麻毒素蛋白
A
链
(
RTA
)
的糖类残基
(
carbohydrate
)
用高碘酸钠氧化
成醛基后再与相对分子质量为
5000
的
mPEG
2肼反
应
,
得到的定点修饰产物遮蔽了
RTA
上的糖类残基
位点
,
故可以防止糖基位点介导的网状内皮细胞受
体识别
,
从而降低了肝脏对该药的摄取速度和系统
清除率
,
避免了
RTA
在肝脏的大量聚集。
在选择修饰位点时
,
也不能只凭结构预测
,
而应
[13]
与实验相结合。如
Dana
等为了选择促红细胞生
成素
(
EPO
)
的修饰位点
,
采用定点突变技术在
EPO
的不同位点引入半胱氨酸
,
包括对赖氨酸进行的替
换
,
并由杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统分泌表达
出这些同系物
,
再用马来酰亚胺2
PEG
进行定点修饰
,
得到了
12
种单修饰同系物。对它们的药代动力学参
数和活性进行研究后发现
:
所有经修饰的
EPO
的体
内半衰期均显著延长
,
初始分布相延缓
;
但
45
和
154
位的赖氨酸被替换成半胱氨酸的修饰物生物活性明
显下降
,
说明不宜在这两个位点上进行
PEG
修饰。
目前
,
笔者所在实验室已在尝试通过先在某些
蛋白质类药物中引入非天然氨基酸的方法实现
PEG
的定点修饰。
修饰物的药代动力学研究方法
2.1
群体药代动力学预测法
群体药代动力学是将经典的药动学基本原理和
统计学模型相结合
,
分析药物代谢动力学特性中存
在的变异性
(
确定性变异和随机性变异
)
,
研究药物
体内过程的群体规律、药动学参数的统计分布及其
影响因素的一种药代动力学研究手段。
[14]
Edward
等
在测定
PEG
修饰的可溶性重组人原先在对
PEG
修饰的蛋白质多肽类药物进行
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药代动力学研究时
,
常用的含量测定方法有酶联免
疫吸附法
(
ELISA
)
、生物活性法等
,
这些分析方法针
对的一般都是
PEG
2蛋白复合物中的蛋白质部分。
但是由于
PEG
修饰后会改变蛋白质原有的一些性
质
,
如分子质量、等电点等
,
也会遮蔽蛋白质表面的
一些免疫表位或者细胞识别位点
,
并且
PEG
2蛋白复
合物在动物或人体内的代谢和降解过程比天然蛋白
质更为复杂
,
这就需要不断改进测定技术
,
使修饰物
的体内含量测定结果能更加灵敏、高效、准确。近些
年来
,
在
PEG
修饰物的药代动力学研究中
,
电化学
发光法
(
ECL
)
和
PEG
特异性抗体
(
PEGantibody
)
法
已被用于其体内含量的测定。
(
1
)
电化学发光测定法
ECL
法是一种比
ELISA
法更加灵敏、干扰更
410
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,Vol.
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ProgressinPharmaceuticalSciences
分子是结构简单的大分子物质
,
免疫原性有限
,
所以
[25]
很难获得特异性抗体。不过
,Cheng
等曾报道了
关于获得小鼠抗
PEG
单克隆抗体的方法
,
并利用两
株不同亚型的
PEG
单抗———
IgG1
型抗体
E11
和
IgM
型抗体
APG3
建立了夹心
ELISA
法。这两株抗
体针对的是
PEG
分子的骨架结构
()
,
利用
E11
作为捕获抗体
,AGP3OCH
2
CH
2
作为检测抗体
,
灵敏度可达纳克级。这种夹心
ELISA
法能检测出混合物中的
PEG
分子
,
不易受血
清成分的影响
,
可以用于血清中
PEG
修饰蛋白质的
定量检测。
虽然有关针对
PEG
部分进行定量测定的报道不
多
,
但美国
Epitomics
公司利用其成熟的兔源单抗制
备技术已经推出了商业化的兔源
PEG
单克隆抗体
anti
2
PEG
2
47,
这种抗体可以识别
PEG
上的甲氧基
,
从
而可用于检测体内的
PEG
修饰分子。数据显示
,anti
2
PEG
2
47
对支链和单链的各种
PEG
分子都有较好的
亲和力
,
并且对血清中其他物质没有交叉反应。
但到目前为止
,
在
PEG
修饰的蛋白质类药物的
药代动力学研究中
,
尚无采用
PEG
特异性抗体对
PEG
部分进行定量测定或研究其体内代谢行为的
报道。
结 语
PEG
修饰是目前生物制药领域广泛使用的技
少、变异系数更小的免疫测定方法。其类似于夹心
ELISA
法
,
也需要先将两种抗体———
TAG
2
NHS
(
ru
2
theniumtris
2
bipyridinechelate
2
N
2
hydroxysuccinamide
ester
)
标记的鼠抗干扰素单抗和生物素标记的羊抗
干扰素多抗与干扰素形成抗体
-
抗原
-
抗体夹心复
合物
,
当这种复合物被标记有抗生物素蛋白的磁珠
吸附、并借助磁性富集于电极表面时
,
复合物上的
TAG
2
NHS
标签可以和底物溶液中的三丙基胺
(
tripropylamine
)
产生电化学发光反应
,
信号的强弱
与血清中的干扰素含量成正比
,
因此通过
ORIGEN
系统就可以分析检测出血清中的待测蛋白的含量。
据报道
,
该法的灵敏度可达
50ng/L,
且不受血清中
其他蛋白和因子的干扰
,
尤为适用于测定血清中的
蛋白。此方法比
ELISA
法更加省时省力
,
操作更加
简便
,
并具有高通量的特点。从理论上说
,
该法适用
于各种
PEG
修饰蛋白质类药物的定量检测
,
但由于
需要两种针对不同表位的蛋白质抗体
,
故对于小分
[23][24]
子多肽不适用。
Marcelo
等和
Paul
等曾分别
用该方法对
PEG
修饰的干扰素
α
2
2a
和
2b
进行了
药代动力学研究
,
发现该法对血清样品的检测灵敏
度可达
4IU/mL,
批间和批内变异系数均小于
10%
。
(
2
)
PEG
特异性抗体法
在
PEG
修饰蛋白质类药物的药代动力学研究
中
,
由于
PEG
修饰物在体内的代谢过程非常复杂
,
很多研究者都希望能实现对
PEG
部分的定量分析。
对
PEG
部分的定量免疫检测法可达此目的
,
但其前
提条件是获得
PEG
分子的特异性抗体。然而
PEG
术
,
能赋予蛋白质类药物一些新的性质
,
可以改变其
在动物或人体内的药代动力学行为
,
从而可能解决
药物半衰期短、分布不理想等问题。但药物在体内
的吸收、分布、排泄和消除会受到多种因素的影响
,
因此
,
目前还不能明确阐述
PEG
修饰的蛋白质类药
物的体内代谢过程
,
这将是一个极具挑战性的研究
领域。
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田 浤
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高向东
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(
中国药科大学生物科学与技术学院
,
江苏南京
210038
)
[
摘 要
]
聚乙二醇
(
PEG
)
修饰在改善蛋白质类药物的理化性质的同时也会导致其体内药代动力学行为发生变
化。而
PEG
修饰剂的分子大小、分子结构和修饰位点对蛋白质类药物的体内药代动力学行为和活性具有一定影
响。根据有关文献报道
,
讨论这些影响因素
,
并介绍在对
PEG
修饰药物进行药代动力学研究时采用的新方法
,
如
:
群体药代动力学预测法及体内测定修饰物含量的电化学发光法和
PEG
特异性抗体法等。
[
关键词
]
聚乙二醇修饰
;
药代动力学
;
群体药代动力学
;
电化学发光法
;PEG
抗体
[
中图分类号
]
O629.73;R969.1
[
文献标识码
]
A
[
文章编号
]1001-5094
(
2008
)
09-0406-06
TheEffectofPEG
2
modificationonthePharmacokineticsofProtein
andtheRelatedPharmacokineticResearchMethods
CAOJin,
TIANHong,
GAOXiang
2
dong
(
SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China
)
[Abstract]
PEG
2
modificationwasassumedtobeoneoftheoptimalapproachesimprovingthephysical
andchemicalcharacteristicsandchangingpharmacokineticpropertiesofproteininbiologicalmedication
luencesofPEGmolecularsize,molecularstructureandmodificationsiteonthePEG
2
protein
pharmacokineticpropertiesandbiologicalactivityinvivohavebeenreviewedaccordingtothereferences.
[
接受日期
]
2008
2
05
2
26
3
通讯作者
:
高向东
,
教授
;
研究方向
:
生物大分子结构与功能
;
Tel:025
2
83271298;
E
2
mail:xdgao@
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
2008
,Vol.
32
,No.
9
407
ProgressinPharmaceuticalSciences
・综述与专论・
2008
年第
32
卷 第
9
期 第
407
页
Somerelatedpharmacokineticresearchmethods,suchaspopulationpharmacokinetics,andelectro
2
chemi
2
calluminescence
(
ECL
)
andPEGspecificantibodymethodwhichareusedtodeterminePEG
2
proteinin
vivowerealsointroduced.
[Keywords]
PEG
2
modification;Pharmacokinetic;Populationpharmacokinetics;ECL;PEGantibody
随着基因工程技术的发展和成熟
,
蛋白质类药
物由于具有生物活性高、特异性好等优点
,
已成为一
类重要的现代医药产品。然而在临床应用中
,
蛋白
质类药物还存在着一些问题
,
如
:
半衰期较短
,
容易被
循环系统清除
;
免疫原性较强
,
易引发变态反应
;
稳定
性较差
,
容易被降解
;
水溶性较差
,
给药途径受限等。
研究人员针对上述问题提出了一些解决方法
,
其中最
为成熟的是利用聚乙二醇
(
PEG
)
进行结构修饰。
PEG
是一种无毒、高亲水性的大分子聚合物
,
由乙二醇单体聚合而成
,
根据聚合度的不同
,
其相对
分子质量从数百至数万不等。
PEG
与蛋白质的非
活性必需基团结合后
,
蛋白质药物的相对分子质量
增加
,
表面的一些抗原决定簇被遮蔽
,
带电性质也会
发生一定的变化
,
这些改变通常可以使蛋白质类药
物的稳定性增加、体内半衰期延长、免疫原性降低。
迄今为止
,
获得美国
FDA
批准上市的
PEG
修饰蛋
白质类药物已有
7
种
,
如表
1
所示。
表
1
在美国获准上市的
PEG
修饰蛋白质类药物
(
2
modifiedproteindrugsapprovedbyFDAU.S
)
商品名
Adagen
Oncospar
Pegintron
Neulasta
Pegasys
Peginyerferon
Mircera
有效成分
PEG
2腺苷脱氨酶
PEG
2天冬酰胺酶
PEG
2干扰素
α
2b
PEG
2重组人粒细胞集落刺激因子
PEG
2干扰素
α
2a
PEG
2干扰素
α
2a,
利巴韦林
PEG
2促红细胞生成素
β
生产公司
Enzon
Enzon
Schering
Amgen
Hoffman
2
LaRoche
Hoffman
2
LaRoche
Hoffman
2
LaRoche
上市时间
1990
1994
2001
2002
2002
2004
2007
PEG
修饰改变了蛋白质类药物的理化性质
,
进
而影响其在体内的药代动力学行为
,
因此
PEG
修饰
蛋白质类药物的药代动力学研究受到广泛的关注
,
成为筛选
PEG
修饰药物的重要评判指标。本文就
PEG
修饰对蛋白质类药物在体内的药代动力学行
为和活性的影响进行初步探讨
,
并介绍近年来有关
PEG
修饰蛋白质类药物的药代动力学研究方法。
修饰对蛋白质类药物体内药代动力学行为
的影响
PEG
修饰对蛋白质类药物体内药代动力学行
为的影响与
PEG
分子的大小、形状、修饰位点及连
接方式有关。
1.1
PEG
的相对分子质量
PEG
修饰使得蛋白质类药物的相对分子质量
稳定性加强
,
从而使其在体内的半衰期延长
,
体内滞
留时间增加。这对于本身半衰期很短的多肽类或抗
[2
2
3]
体片段类药物非常有利。
目前在有关研究中使用的
PEG
的相对分子质
量从几千到几万不等
,
作为修饰物的支链
PEG
分子
的相对分子质量可达
60000,
线性
PEG
分子也达到
[4]
30000
。但是究竟
PEG
的相对分子质量为多少才
合适
,
还必须根据被修饰物本身的性质和需要进行
选择。
[5]
Nakaoka
等
对
PEG
的分子质量与其血浆清除
速度的关系进行了研究
,
发现其分子质量与清除时
间呈非直线型相关
:
当
PEG
的相对分子质量在
8000
到
30000
之间时
,
其清除速率变化很大
;
但当相对
分子质量达到
30000
以上时
,
对其清除速率的影响
会大大减小
(
见图
1
)
。
增大、肾小球滤过率降低
[1]
、抗酶解能力和热力学
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
・综述与专论・
2008
年第
32
卷 第
9
期 第
408
页
408
2008
,Vol.
32
,No.
9
ProgressinPharmaceuticalSciences
好的抗病毒效果。
由于
PEG
分子质量与所修饰蛋白质类药物的
药代动力学行为之间的关系不是直线型的
,
因此单
纯加大
PEG
的相对分子质量未必能达到改善蛋白
质类药物药动学特性的目的。只有在保持药物原有
生物活性的基础上
,
选择适当分子质量的
PEG
修
饰
,
同时兼顾体内生物活性和半衰期
,
才能最大限度
[9]
地发挥
PEG
修饰蛋白类药物的体内治疗效能。
1.2
PEG
的分子结构
图
1
PEG
的分子质量与其静脉注射后半衰期的关系
(
ationplotbetweenPEGmolecularweightand
itshalflifeinbloodafterintravenousadministration
)
目前采用的
PEG
修饰剂可分为线性
PEG
分子
和支链
PEG
分子
,PEG
的分子结构在很大程度上影
响其对所修饰蛋白质药物分子表面抗原决定簇、带
电基团以及其他特殊位点的遮蔽效果。总的来说
,
支链
PEG
分子由于具有“伞状效应”
,
对被修饰物药
代动力学行为的改善更为有效
,
能够保护蛋白质分
子不被蛋白水解酶、抗体或者免疫细胞所识别、水解
[10]
和清除
(
见图
2
)
。
由于
PEG
分子具有很强的亲水性
,
同时其柔性
结构可以无规则卷曲
,
并不像蛋白质分子本身那样
折叠成致密结构
,
所以
PEG
分子在体内的“实际”分
子质量会比理论值大得多。当
PEG
修饰在蛋白质
[6]
表面时依然存在这种现象
,
如
Yu
等使用相对分
子质量分别为
1000
、
2000
、
5000
的
PEG
(
PEG1000
、
PEG2000
和
PEG5000
)
修饰鲑鱼降钙素
(
sCT
)
,
结果
发现
,
用
PEG5000
修饰的
sCT,
其动力学分子质量
(
即根据动力学实验结果计算所得的分子质量
)
达
259000,
远大于其实际分子质量
84000
。由此看
来
,
直接将修饰后蛋白质分子的理论分子质量大小
作为其能否通过肾小球滤过的依据并不可靠
,
更不
能用理论分子质量作为评价其药代动力学改善程度
的唯一指标
,
而应根据动物实验的实际结果进行综
合全面的评价。同时
,Yu
等在实验中还发现
,PEG
修饰的
sCT
体的内活性也受
PEG
分子大小的影响
,
PEG5000
修饰的
sCT
生物活性下降最多
,
只有原型
的
30%,
而
PEG2000
的修饰物的生物活性保留
了
80%
。
[7]
Li
等
在对重组人粒细胞集落刺激因子
(
rhG
2
CSF
)
进行
PEG
修饰时也提出了大分子
PEG
修饰会
[8]
导致
rhG
2
CSF
生物活性丧失的问题。而
Paolo
对
α
2a
和
PEG
2
IFN
α
2b
的药代动力学行为进
PEG
2
IFN
行研究后发现
,
虽然随着
PEG
分子质量的增大
,
PEG
2
IFN
的体外抗病毒活性降低
,
但因其在体内血
液中滞留时间增长
,
就有更多机会浸润到血管外的
组织中
,
这样它与人体外周组织器官中存在的
HCV
病毒接触的时间更长
,
从而使修饰后的
IFN
具有更
图
2
支链
PEG
分子的“伞状效应”对蛋白质的保护作用
(
tectiveeffectof
“
umbrella
2
like
”
structureof
branchedPEGonprotein
)
研究认为
,
由线性
PEG
分子修饰的
蛋白类药物的体内分布容积比由支链
PEG
分子修
Yeong
等
[11]
饰的更大
,
而支链
PEG
分子修饰物在保持体外生物
活性和延长体内停留时间方面更具优势。用一种三
聚体结构的新型支链
PEG
分子作为修饰剂对
IFN
2
α
2a
进行修饰后
,
其半衰期比未修饰物延长了
40
倍
,
可作为一种长效制剂
;
而且
,
与用相对分子质量
为
40000
的支链
PEG
修饰的
IFN
相比
,
这种新型支
链
PEG
的修饰物的抗病毒活性更好。
笔者所在实验室合成了一种全新的支链
PEG
分子
mPEG2
2
N
2
NHS,
并将其用于对重组复合干扰素
(
IFNcon
)
的修饰。用恒河猴进行的体内药代动力
学研究证明
,
经这种支链
PEG
修饰后的
IFNcon
的
代谢半衰期明显延长。
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2008
,Vol.
32
,No.
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409
ProgressinPharmaceuticalSciences
1.3
PEG
修饰的位点
・综述与专论・
2008
年第
32
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9
期 第
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页
肿瘤坏死因子
I
型受体
(
r
2
Hu
2
sTNF
2
RI
)
在小鼠、大
鼠、短尾猴、狒狒和黑猩猩体内的药代动力学参数时
发现
,
该药的体内分布容积和血浆清除率与动物的
体重相关。因此该作者推断
,
在制定该药的临床试
验用药剂量时
,
可用在动物体内测得的药代动力学
数据作为参考。群体药代动力学预测的作用也在于
此
:
借助于已经取得的动物体内、外试验的数据对测
试药物的人体药动学参数进行预测
,
明确其主要药
动学特性
,
以消除研究中的盲目性
,
节约时间和
[15]
成本。
使用混合效应建模技术
(
mixed
2
effectsmodeling
techniques
)
可对来源于不同种属的分散数据进行整
合
,
建立的模型用于预测另一种群的药物分布或者
用于估算种属间的药代动力学参数差异。如
,Koen
[16]
等建立了一个群体药代动力学模型
,
采用种间异
速生长比例法
(
allometricscaling
)
对
PEG
2
EPO
在人
体内的药代动力学行为进行了预测。他们给大鼠、
兔、猴和狗单次静脉和皮下注射
PEG
2
EPO,
并采集
不同时间点的血样共计
927
份
,
用
NONMENV
软件
进行数据分析
,
得到了一步吸收和中央室线性清除
的二室模型
;
同时
,
他们还对动物体重、脑重、性别和
妊娠等与药代动力学参数之间关系进行了研究
;
然
后
,
他们使用非参数靴值分析法
(
non
2
parametric
bootstrapanalysis
)
建立起了药代动力学预测模型
,
利用这个模型可对
PEG
2
EPO
在男性体内的药代动
力学参数
,
包括系统清除率
(
CL
)
、中央室分布容积
率
(
Vc
)
、区间交换率
(
Q
)
、周边室分布容积
(
Vp
)
和
吸收速率常数
(
Ka
)
进行预测。这几位研究者认为
,
这种用在动物体内得到的药代动力学参数来推测人
体药动学的方法
,
对于
PEG
2
EPO
临床研究时给药剂
量的正确选择起到了十分重要的作用。
从临床前数据预测人体药动学参数是一个具有
挑战性的工作
,
近年来国外学者在此方面做了诸多
尝试
,
目前开展较为广泛的是人体分布容积和清除
率的预测
,
也有对半衰期和生物利用度进行预
[21
2
22]
测的报道。相信将群体药代动力学用于对
PEG
修饰蛋白质的研究将会对认识其体内基本过
程具有重要的指导作用
,
帮助人们更好地认识
PEG
修饰蛋白质类药物在体内的药代动力学行为。
2
1
2
修饰物的体内含量测定方法
[17
2
20]
早期的
PEG
修饰通常是随机的
,
但随着
PEG
修饰技术的不断发展
,
近来已可通过
PEG
醛水合
法、酶法定点连接或者基因工程技术引入特殊基团
等手段达到
PEG
定点修饰的目的。将
PEG
定点修
饰技术与蛋白质结构和功能关系的研究相结合
,
可
以更有把握地选择
PEG
修饰位点
,
使
PEG
修饰的
蛋白质类药物在体内能具有较好的生物活性和药代
动力学特征。
通过
PEG
定点修饰的方法可以有针对性地在
蛋白质药物抗原位点或者其他影响体内分布的位点
[12]
进行修饰。如
Yu
等先将蓖麻毒素蛋白
A
链
(
RTA
)
的糖类残基
(
carbohydrate
)
用高碘酸钠氧化
成醛基后再与相对分子质量为
5000
的
mPEG
2肼反
应
,
得到的定点修饰产物遮蔽了
RTA
上的糖类残基
位点
,
故可以防止糖基位点介导的网状内皮细胞受
体识别
,
从而降低了肝脏对该药的摄取速度和系统
清除率
,
避免了
RTA
在肝脏的大量聚集。
在选择修饰位点时
,
也不能只凭结构预测
,
而应
[13]
与实验相结合。如
Dana
等为了选择促红细胞生
成素
(
EPO
)
的修饰位点
,
采用定点突变技术在
EPO
的不同位点引入半胱氨酸
,
包括对赖氨酸进行的替
换
,
并由杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统分泌表达
出这些同系物
,
再用马来酰亚胺2
PEG
进行定点修饰
,
得到了
12
种单修饰同系物。对它们的药代动力学参
数和活性进行研究后发现
:
所有经修饰的
EPO
的体
内半衰期均显著延长
,
初始分布相延缓
;
但
45
和
154
位的赖氨酸被替换成半胱氨酸的修饰物生物活性明
显下降
,
说明不宜在这两个位点上进行
PEG
修饰。
目前
,
笔者所在实验室已在尝试通过先在某些
蛋白质类药物中引入非天然氨基酸的方法实现
PEG
的定点修饰。
修饰物的药代动力学研究方法
2.1
群体药代动力学预测法
群体药代动力学是将经典的药动学基本原理和
统计学模型相结合
,
分析药物代谢动力学特性中存
在的变异性
(
确定性变异和随机性变异
)
,
研究药物
体内过程的群体规律、药动学参数的统计分布及其
影响因素的一种药代动力学研究手段。
[14]
Edward
等
在测定
PEG
修饰的可溶性重组人原先在对
PEG
修饰的蛋白质多肽类药物进行
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・综述与专论・
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药代动力学研究时
,
常用的含量测定方法有酶联免
疫吸附法
(
ELISA
)
、生物活性法等
,
这些分析方法针
对的一般都是
PEG
2蛋白复合物中的蛋白质部分。
但是由于
PEG
修饰后会改变蛋白质原有的一些性
质
,
如分子质量、等电点等
,
也会遮蔽蛋白质表面的
一些免疫表位或者细胞识别位点
,
并且
PEG
2蛋白复
合物在动物或人体内的代谢和降解过程比天然蛋白
质更为复杂
,
这就需要不断改进测定技术
,
使修饰物
的体内含量测定结果能更加灵敏、高效、准确。近些
年来
,
在
PEG
修饰物的药代动力学研究中
,
电化学
发光法
(
ECL
)
和
PEG
特异性抗体
(
PEGantibody
)
法
已被用于其体内含量的测定。
(
1
)
电化学发光测定法
ECL
法是一种比
ELISA
法更加灵敏、干扰更
410
2008
,Vol.
32
,No.
9
ProgressinPharmaceuticalSciences
分子是结构简单的大分子物质
,
免疫原性有限
,
所以
[25]
很难获得特异性抗体。不过
,Cheng
等曾报道了
关于获得小鼠抗
PEG
单克隆抗体的方法
,
并利用两
株不同亚型的
PEG
单抗———
IgG1
型抗体
E11
和
IgM
型抗体
APG3
建立了夹心
ELISA
法。这两株抗
体针对的是
PEG
分子的骨架结构
()
,
利用
E11
作为捕获抗体
,AGP3OCH
2
CH
2
作为检测抗体
,
灵敏度可达纳克级。这种夹心
ELISA
法能检测出混合物中的
PEG
分子
,
不易受血
清成分的影响
,
可以用于血清中
PEG
修饰蛋白质的
定量检测。
虽然有关针对
PEG
部分进行定量测定的报道不
多
,
但美国
Epitomics
公司利用其成熟的兔源单抗制
备技术已经推出了商业化的兔源
PEG
单克隆抗体
anti
2
PEG
2
47,
这种抗体可以识别
PEG
上的甲氧基
,
从
而可用于检测体内的
PEG
修饰分子。数据显示
,anti
2
PEG
2
47
对支链和单链的各种
PEG
分子都有较好的
亲和力
,
并且对血清中其他物质没有交叉反应。
但到目前为止
,
在
PEG
修饰的蛋白质类药物的
药代动力学研究中
,
尚无采用
PEG
特异性抗体对
PEG
部分进行定量测定或研究其体内代谢行为的
报道。
结 语
PEG
修饰是目前生物制药领域广泛使用的技
少、变异系数更小的免疫测定方法。其类似于夹心
ELISA
法
,
也需要先将两种抗体———
TAG
2
NHS
(
ru
2
theniumtris
2
bipyridinechelate
2
N
2
hydroxysuccinamide
ester
)
标记的鼠抗干扰素单抗和生物素标记的羊抗
干扰素多抗与干扰素形成抗体
-
抗原
-
抗体夹心复
合物
,
当这种复合物被标记有抗生物素蛋白的磁珠
吸附、并借助磁性富集于电极表面时
,
复合物上的
TAG
2
NHS
标签可以和底物溶液中的三丙基胺
(
tripropylamine
)
产生电化学发光反应
,
信号的强弱
与血清中的干扰素含量成正比
,
因此通过
ORIGEN
系统就可以分析检测出血清中的待测蛋白的含量。
据报道
,
该法的灵敏度可达
50ng/L,
且不受血清中
其他蛋白和因子的干扰
,
尤为适用于测定血清中的
蛋白。此方法比
ELISA
法更加省时省力
,
操作更加
简便
,
并具有高通量的特点。从理论上说
,
该法适用
于各种
PEG
修饰蛋白质类药物的定量检测
,
但由于
需要两种针对不同表位的蛋白质抗体
,
故对于小分
[23][24]
子多肽不适用。
Marcelo
等和
Paul
等曾分别
用该方法对
PEG
修饰的干扰素
α
2
2a
和
2b
进行了
药代动力学研究
,
发现该法对血清样品的检测灵敏
度可达
4IU/mL,
批间和批内变异系数均小于
10%
。
(
2
)
PEG
特异性抗体法
在
PEG
修饰蛋白质类药物的药代动力学研究
中
,
由于
PEG
修饰物在体内的代谢过程非常复杂
,
很多研究者都希望能实现对
PEG
部分的定量分析。
对
PEG
部分的定量免疫检测法可达此目的
,
但其前
提条件是获得
PEG
分子的特异性抗体。然而
PEG
术
,
能赋予蛋白质类药物一些新的性质
,
可以改变其
在动物或人体内的药代动力学行为
,
从而可能解决
药物半衰期短、分布不理想等问题。但药物在体内
的吸收、分布、排泄和消除会受到多种因素的影响
,
因此
,
目前还不能明确阐述
PEG
修饰的蛋白质类药
物的体内代谢过程
,
这将是一个极具挑战性的研究
领域。
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