2024年4月1日发(作者：实昭懿)
叶绿素合成前体物质及相关酶的测定
1 ALA （5–氨基酮戊酸）含量的测定（所有操作均在4℃下进行）
参照Dei（1985）的方法：用质量体积比为4%的三氯乙酸提取 0.5 g 叶片中的ALA，
5 mL提取液与2.35 mL NaAc（1 mol·L
-1
）、0.15 mL乙酰丙酮和2.5 mL 醋酸盐缓冲液
（1mol·L
-1
，pH 4.6）混合后，于沸水浴中加热10 min，冷却至室温后，用Ehrlich-Hg
试剂显色，检测波长553 nm处的OD值。
2 PBG（胆色素原）含量的测定
参照 Bogorad（1962）的方法：取0.5 g叶片用液氮研磨后，加入5 mL 提取缓冲
液（0.6 mol·L
-1
Tris，0.1 mol·L
-1
EDTA，用盐酸调至pH 8.2）提取叶片PBG，10
4
×g离
心10 min，取2 mL上清液加2 mL Ehrlich-Hg试剂，黑暗中显色15 min，测波长553 nm
处的OD值。
3 Urogen Ⅲ（尿卟啉原Ⅲ）含量的测定
参照Bogorad（1962）的方法：取0.5 g叶片经 0.067 mol· L
-1
磷酸缓冲液（pH6.8）
提取，取5 mL提取液加入0.25 mL，溶液（1%），强光照射20 min后，用1 mol·L
-1
冰
醋酸调pH至3.5。乙醚萃取3次，合并水相并测405.5 nm处的OD值。
叶绿素降解相关酶的测定
叶绿素—
叶绿素酶
—脱植基叶绿素—
脱镁螯合酶
—脱植基叶绿素酸—
脱镁叶绿酸双氧酶
—色素丧失
1 叶绿素酶活性的测定
1.1 剪碎后混合均匀，称取2 g，加入10 mL丙酮，在液氮中研磨后，置于-20℃提取
40 min，提取液12000×g 离心5 min，去除上清液，对底部沉淀再用同样条件重复提取2
次。在沉淀中加入5 mM pH=7 的磷酸缓冲液3 mL（含50 mM KCL，0.24%TritonX-100），
30℃下磁力搅拌30min，12000×g 离心5 min，上清液即是酶粗提液。
1.2 酶活性测定酶活性的测定参照Fang[10]、Fernandez-Lopez[11]等人的方法：反
应体系包括0.1M抗坏血酸30μL，酶粗提液500μL，120μmol/L的叶绿素300ul，丙酮
1.7mL，最后加蒸馏水定容至3.3 mL。反应体系于35℃、黑暗条件下反应40min。然后加
入预冷的丙酮3mL，正己烷6mL，剧烈震荡来终止反应。4℃，12000×g 条件下离心5min，
取丙酮层，测定667nm下的OD值。以沸水浴加热失活的酶液为比色空白对照。试验所用
的叶绿素纯品购自Sigma公司。
2 MDCase的提取和测定
取叶片按照2ml/g的比例加入4摄氏度预冷的提取液【0.1mol/l的磷酸缓冲液ph=6含
0.2%tritonX-100,30g/l聚乙烯吡咯烷酮，1mmol/l苯甲基磺酰氟和5mmol/la半胱氨酸】，
冰浴中匀浆后放在低温摇床上震荡2h后，4层纱布过滤，滤液在4摄氏度下以9000g离心
20min，上清液为粗酶液。
花色苷含量的测定及相关酶活性的测定
花色苷：是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实、
茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到兰等不同颜色。花色苷是类黄酮——
以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红色的一族化合物。
溶解性：溶于水；颜色随着PH的改变而发生变化，酸性条件下为红色，中性为紫色，
在碱性条件下呈蓝色
1. 花色苷含量的测定
参照Pirie 和Mullins（1976）的方法，取0.5 g 样品，加入10 mL 预冷的1%盐酸—
甲醇溶液，避光室温浸提2 h。用分光光度计测定提取液在530 nm 和657 nm 处的吸光
值，二者之差即为花青苷的相对含量。差值每增加0.01 定义为一个单位U。设取样重复3 ~
5次。
2 叶片中PAL(苯丙氨酸解氨酶）活性的测定
取0.5g剪碎的叶片加入5ml提取液[0.05molL
-1
Na2HPO4/KH2PO4(pH7.0)，
0.05mol.L
-1
抗坏血酸，0.018mol.L
-1
巯基乙醇]，冰浴匀浆，4℃下15000g离心20min，
上清液为酶粗提液，用于测定酶活性。PAL和CHI活性测定参照Lister等的方法。
PAL活性 取4支10ml试管(3支测定管,1支对照管),分别加入0.02mol/l L-苯丙氨
酸1.0ml(对照管不加,代之为蒸馏水),硼酸缓冲液(Ph=8.8)2.0ml,酶液1.0ml(根据酶活性适
当的稀释或增加体积),总体积4.0ml.摇匀后置30℃恒温水浴中保温60min,加0.2ml
6mol/lHcl终止反应hyu,若有沉淀需过滤或离心.用对照tiu管调零,在290nm处检测测定
管反应液得吸光度A290。
以测定管反应液每小时A290增加0.01为一个酶活性单位(u)
PAL活性(u/gFw.h)= A290×Vt×v/0.01×VS×Fw×t
式中：Vt:酶液总体积(ml); Fw:样品鲜重(g); VS:测定时取酶液的量(ml); v:反应液总体
积(ml); t:反应时间(h)。
2024年4月1日发(作者：实昭懿)
叶绿素合成前体物质及相关酶的测定
1 ALA （5–氨基酮戊酸）含量的测定（所有操作均在4℃下进行）
参照Dei（1985）的方法：用质量体积比为4%的三氯乙酸提取 0.5 g 叶片中的ALA，
5 mL提取液与2.35 mL NaAc（1 mol·L
-1
）、0.15 mL乙酰丙酮和2.5 mL 醋酸盐缓冲液
（1mol·L
-1
，pH 4.6）混合后，于沸水浴中加热10 min，冷却至室温后，用Ehrlich-Hg
试剂显色，检测波长553 nm处的OD值。
2 PBG（胆色素原）含量的测定
参照 Bogorad（1962）的方法：取0.5 g叶片用液氮研磨后，加入5 mL 提取缓冲
液（0.6 mol·L
-1
Tris，0.1 mol·L
-1
EDTA，用盐酸调至pH 8.2）提取叶片PBG，10
4
×g离
心10 min，取2 mL上清液加2 mL Ehrlich-Hg试剂，黑暗中显色15 min，测波长553 nm
处的OD值。
3 Urogen Ⅲ（尿卟啉原Ⅲ）含量的测定
参照Bogorad（1962）的方法：取0.5 g叶片经 0.067 mol· L
-1
磷酸缓冲液（pH6.8）
提取，取5 mL提取液加入0.25 mL，溶液（1%），强光照射20 min后，用1 mol·L
-1
冰
醋酸调pH至3.5。乙醚萃取3次，合并水相并测405.5 nm处的OD值。
叶绿素降解相关酶的测定
叶绿素—
叶绿素酶
—脱植基叶绿素—
脱镁螯合酶
—脱植基叶绿素酸—
脱镁叶绿酸双氧酶
—色素丧失
1 叶绿素酶活性的测定
1.1 剪碎后混合均匀，称取2 g，加入10 mL丙酮，在液氮中研磨后，置于-20℃提取
40 min，提取液12000×g 离心5 min，去除上清液，对底部沉淀再用同样条件重复提取2
次。在沉淀中加入5 mM pH=7 的磷酸缓冲液3 mL（含50 mM KCL，0.24%TritonX-100），
30℃下磁力搅拌30min，12000×g 离心5 min，上清液即是酶粗提液。
1.2 酶活性测定酶活性的测定参照Fang[10]、Fernandez-Lopez[11]等人的方法：反
应体系包括0.1M抗坏血酸30μL，酶粗提液500μL，120μmol/L的叶绿素300ul，丙酮
1.7mL，最后加蒸馏水定容至3.3 mL。反应体系于35℃、黑暗条件下反应40min。然后加
入预冷的丙酮3mL，正己烷6mL，剧烈震荡来终止反应。4℃，12000×g 条件下离心5min，
取丙酮层，测定667nm下的OD值。以沸水浴加热失活的酶液为比色空白对照。试验所用
的叶绿素纯品购自Sigma公司。
2 MDCase的提取和测定
取叶片按照2ml/g的比例加入4摄氏度预冷的提取液【0.1mol/l的磷酸缓冲液ph=6含
0.2%tritonX-100,30g/l聚乙烯吡咯烷酮，1mmol/l苯甲基磺酰氟和5mmol/la半胱氨酸】，
冰浴中匀浆后放在低温摇床上震荡2h后，4层纱布过滤，滤液在4摄氏度下以9000g离心
20min，上清液为粗酶液。
花色苷含量的测定及相关酶活性的测定
花色苷：是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实、
茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到兰等不同颜色。花色苷是类黄酮——
以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红色的一族化合物。
溶解性：溶于水；颜色随着PH的改变而发生变化，酸性条件下为红色，中性为紫色，
在碱性条件下呈蓝色
1. 花色苷含量的测定
参照Pirie 和Mullins（1976）的方法，取0.5 g 样品，加入10 mL 预冷的1%盐酸—
甲醇溶液，避光室温浸提2 h。用分光光度计测定提取液在530 nm 和657 nm 处的吸光
值，二者之差即为花青苷的相对含量。差值每增加0.01 定义为一个单位U。设取样重复3 ~
5次。
2 叶片中PAL(苯丙氨酸解氨酶）活性的测定
取0.5g剪碎的叶片加入5ml提取液[0.05molL
-1
Na2HPO4/KH2PO4(pH7.0)，
0.05mol.L
-1
抗坏血酸，0.018mol.L
-1
巯基乙醇]，冰浴匀浆，4℃下15000g离心20min，
上清液为酶粗提液，用于测定酶活性。PAL和CHI活性测定参照Lister等的方法。
PAL活性 取4支10ml试管(3支测定管,1支对照管),分别加入0.02mol/l L-苯丙氨
酸1.0ml(对照管不加,代之为蒸馏水),硼酸缓冲液(Ph=8.8)2.0ml,酶液1.0ml(根据酶活性适
当的稀释或增加体积),总体积4.0ml.摇匀后置30℃恒温水浴中保温60min,加0.2ml
6mol/lHcl终止反应hyu,若有沉淀需过滤或离心.用对照tiu管调零,在290nm处检测测定
管反应液得吸光度A290。
以测定管反应液每小时A290增加0.01为一个酶活性单位(u)
PAL活性(u/gFw.h)= A290×Vt×v/0.01×VS×Fw×t
式中：Vt:酶液总体积(ml); Fw:样品鲜重(g); VS:测定时取酶液的量(ml); v:反应液总体
积(ml); t:反应时间(h)。