2024年4月6日发(作者：香楠楠)
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３４６・ 医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第６
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－０２６４．２０１０．０６．００９
益气活血软坚解毒方对荷Ｈ２２ ６１５小鼠肝癌细胞凋亡相关基因Ｆａｓ、
ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ、Ｐ５ 、ＮＦ。ｓ：Ｂ表达的影响
李东涛 孙桂芝 吴志奎 李杰 吕新霞 陈玉英 裴迎霞 祁 鑫
１．济南军区青岛第一疗养院（山东青岛，２６６０７１） ２．中国中医科学院广安门医院
摘要目的：研究益气活血软坚解毒（ＹＨＲＪ）方对荷Ｈ ６１５小鼠肝癌细胞凋亡调控基因Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｂｃ１．２、
Ｂａｘ、Ｐ”、ＮＦ—ＫＢ表达的影响。方法：将动物分组为Ｎｓ组（正常对照组）、ＤＤＰ组（顺铂组）、ＹＨＲＪ等效剂量组、
ＹＨＲＪ高剂量组、ＹＨＲＪ等效剂量＋ＤＤＰ组、ＹＨＲＪ高剂量＋ＤＤＰ组，应用免疫组化、原位杂交、ＲＴ—ＰＣＲ等方法对用
药后的荷Ｈ２２６１５小鼠肝癌细胞凋亡主要相关基因Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ、 、ＮＦ—ＫＢ蛋白与ｍＲＮＡ表达进行检测。
结果：免疫组化检测结果显示：与Ｎｓ组比较，各加药组均能增高Ｆａｓ、Ｂａｘ基因蛋白表达（均Ｐ＜０．０１），均能降低
ＮＦ－ＫＢ蛋白表达（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）及降低突变型Ｐ 基因蛋白表达（Ｐ＜０．０Ｉ）。与Ｎｓ组比较，ＹＨＲＪ等效剂量
＋ＤＤＰ组能明显降低ＦａｓＬ基因蛋白表达（Ｐ＜０．叭）。与ＤＤＰ组比较，中药组及中药含ＤＤＰ组能明显降低ＦａｓＬ及突
变型Ｐ”基因蛋白表达（均Ｐ＜０．０１）。与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ等效剂量纽、ＹＨＲＪ高剂量组、ＹＨＲＪ高剂量＋ＤＤＰ组能
降低ＮＦ—ＫＢ蛋白表达（均Ｐ＜０．０１）。与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ高剂量组及中药含ＤＤＰ组明显增高Ｂａｘ基因蛋白表达
（均Ｐ＜０．０１）。与ＮＳ纽与ＤＤＰ组比较，中药纽及中药含ＤＤＰ组能明显降低Ｂｅ１－２基因蛋白表达（Ｐ＜０．０５或尸＜
０．０１）。原位杂交检测ＮＦ—ＫＢ ｍＲＮＡ表达结果：与ＮＳ组及ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ等效剂量组及中药含ＤＤＰ组明显降低
ＮＦ．ＫＢ ｍＲＮＡ表达（均Ｐ＜０．０１）。ＲＴ—ＰＣＲ检测Ｂａｘ、Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ表达结果：与Ｎｓ组及ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ等效剂
量组能明显增高Ｂａｘ基因ｍＲＮＡ表达（均Ｐ＜０．００１）。与Ｎｓ组比较，各加药组能明显降低Ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ表达（Ｐ＜
０．０５或Ｐ＜０．００１）；与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ高剂量组能明显降低Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ表达（Ｐ＝０．０１）。结论：ＹＨＲＪ方能够
提高荷Ｈ，，６１５小鼠肝癌细胞凋亡促进基因Ｆａｓ、Ｂａｘ表达，减低细胞凋亡抑制基因ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２表达，降低细胞凋亡保
护基因突变型Ｐ５ 蛋白与ＮＦ—ＫＢ基因表达，这些作用是诱导肝癌细胞凋亡的分子基础。
关键词肝癌；益气活血软坚解毒方／药效学；细胞凋亡；基因调控；实验研究
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｙｉｑｉｈｕｏｘｕｅ，Ｒｕａｎｊｉａｎｊｉｅｄｕ ｒｅｃｉｐｅ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒｅｇｕ－
ｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｈ，，６１５ ｔｕｍｏｒ
Ｌ／ＤＯＮＧ—ＴＡＯ 。ＳＵＮ ＧＵＩ－ＺＨ１ ，ＷＵ ＺＨＩ—ＫＵ１２
，
ｅｔ ａ１．１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｑｉｎｇｄａｏ Ｆｉｒｓｔ Ｓａｎａｔｏ—
ｒｉｕｍ ｆ ｏＪｉｎａｎ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ（Ｑｉｎｇｄａｏ Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２６６０７ １）Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｙｉｑｉ，Ｈｕｏｘｕｅ，Ｒｕａｎｊｉａｎ＆Ｊｉｅｄｕ（ＹＨＲＪ）Ｒｅｃｉｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａ—
ｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌ１．ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｓｕｃｈ ａｓ Ｆａｓ，ＦａｓＬ，Ｂｃｌ－２，Ｂａｘ，Ｉ）） ，ＮＦ—ＫＢ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｈ２２ ６１５
Ｔｕｍｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ６ ｇｒｏｕｐｓ：ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ，
ＹＨ１ＬＩ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ．Ｉｍｍｕｎ０ｈｉｓｔ０ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｉｔｕ—
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ＲＴ—ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ＨＣＣ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｆａｓ，ＦａｓＬ，Ｂｃ１－２，Ｂａｘ， ，ＮＦ—
ＫＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｈ，，６１５ ｔｕｍｏｒ ａｆｔｅｒ １３ ｄａｙｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ：
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０１）ａｎｄ ＹＨＲＪ ｅ—
ｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦａｓＬ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦａｓＬ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ ３０２７１６５６）；Ａ通讯作者
中西医结合肝病杂志２０１０年第２Ｏ卷第６期
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３４７・
０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＦ—ＫＢ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜
０．０５ ｏｒ Ｐ＜０．Ｏ１）；Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ ｒｏｕｐ，ＹＨＲＪｇ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ
＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＦ．ＫＢ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ
ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅＢｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ Ｐ５ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０１）；Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，Ｃｈｉ—
ｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｒｏｕｐｓｇ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＋ＤＤＰ ｒｇｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｐ５ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜
０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜
０．０１）；Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｒｏｕｐ，ＹＨＲＪｇ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＋ＤＤＰ ｒｇｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．ｏ１）．Ｔｈｅ ｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｕｌｔｓ ＮＦ—ＫＢ ｍＲＮＡ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ：
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ。ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ
ｏｂｖｉｏｕｓｌｖ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＦ—ＫＢ ｍＲＮＡ（Ｐ＜０．Ｏ１） ．Ｔｈｅ ＲＴ．ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ，Ｂｅｌ－２ ｍＲＮＡ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ：ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ
ｍＲＮＡ（尸＜０．００ １）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ一２
ｍＲＮＡ（Ｐ＜０．０５ ｏｒ Ｐ＜０．００１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ（Ｐ＝０．Ｏ１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＹＨＲＪ ｒｅｃｉｐｅ ｃｏｕｌｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＨＣＣ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｈ２２６１５ ｔｕｍｏｒ，
ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆａｓ ａｎｄ Ｂａｘ，ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦａｓＬ ａｎｄ Ｂｃｌ・２（ｔｈｅ ｒｅｓｔｒａｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｇｅｎｅｓ），
ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ （ａ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ）ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＮＦ—ＫＢ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｓｅ ｒｏｌｅｓ ａｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｈｎ—
ｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ＨＣＣ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ ｈｅｐａｔｏｃａｒｅｉｎｏｍａ；Ｙｉｑｉｈｕｏｘｕｅ Ｒａａｎｊｉａｎｊｉｅｄｕ ｒｅｃｉｐｅ／ｐｈａｒｍａｅｏｄｙｎａｍｉｃｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ；ｅｘｐｅｒ—
ｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ
益气活血软坚解毒（ＹＨＲＪ）方是导师孙桂芝教授在归纳
古代文献的基础上，结合几十年的临床实践总结出来的应用
于肝癌患者的主要方剂。以往的研究证实，以ＹＨＲＪ方治疗
肝癌在临床上取得了抑制肿瘤生长，提高生活质量，延长生
存期的作用 。前期实验研究证实该方能抑制荷Ｈ： ６１５小鼠
肝癌细胞生长并延长荷Ｈ 昆明鼠生存期作用 ；荧光显微镜
生物工程（大连）有限公司产品。引物：由赛百盛公司合成。
Ｂａｘ上游５’一ＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡ一３’（１ ５９ｂｐ），下游
５’ 一ＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣ ＩＴＧＧＡＴＣＣ一３’ （４７０ｂｐ）． Ｆｒａｇｅｍｅｎｔ：
３１２ｂｐ，ＲｅｆｅｎｏＧｅｎｅｂａｎｋ ＸＭ ００９０９３；Ｂｃｌ一２上游５’一ＣＡＧＣＴＧ．
ＣＡＣＣＴＧＡＣＧＣＣＣＴＦ一３’
ＴＡＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣ一３’
Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＸＭ １４７４５。
（３８３ｓｉｔｅ），下游５’一ＧＣＣＴＣＣＧＴ．
（６１３ｓｉｔｅ），Ｆｒａｇｅｍｅｎｔ：２３１ｂｐ Ｒｅｆｅｎｏ—
及流式细胞仪检测显示ＹＨＲＪ方对荷Ｈ ６１５小鼠肝癌细胞有
诱导细胞凋亡作用，其提取物对人肝癌细胞系ＢＥＬ－７４０２细胞
有促进凋亡作用 。为进一步研究其诱导细胞凋亡的分子机
１．３主要仪器ＢＨ２一ＲＦＣ落射式荧光显微镜，Ｏｌｙｍｐｕｓ公司
产品。ＰＴＣ一１００ＴＭＰＣＲ扩增仪，美国ＭＪ—Ｒｅｓｅａｒｃｈｌｎｃ。ＵＶＩ凝
制，我们对其诱导荷Ｈ ６１５小鼠肝癌细胞凋亡过程中Ｆａｓ、
ＦａｓＬ、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｐｓ 、ＮＦ—ＫＢ基因表达变化进行了检测。
１材料与方法
胶成像系统，英国ＵＶＩｔｅｃ公司。
１．４动物模型制备取生长状态良好接种第７天的Ｈ：：肝癌
６１５瘤源小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下取出瘤组织，除
１．１ 动物与瘤株６１５小鼠６０只，雄性，体重（１８ ４－２）ｇ，
去血块及坏死组织，用机械剪碎法做成单细胞悬液，在每只
购自中国药物及生物制品检定所；小鼠Ｈ 肝癌瘤株，由广安
门医院肿瘤实验室提供。
１．２材料ＹＨＲＪ方水煎剂，组方为黄芪、炒白术、田三七、
水红花子、藤梨根、凌霄花、炮山甲、白花舌蛇草、半枝莲，
６１５小鼠右腋部皮下接种２×１０。个瘤细胞。造模后随机分成６
组，每组１０只。①Ｎｓ组（正常对照组）：每日灌服生理盐水
０．２ｍｌ。②ＤＤＰ组（顺铂组）：按照ｌｍｇ／ 剂量给小鼠腹腔注
射０．２ｍｌ ＤＤＰ，１次／ｄ，共７次。③ＹＨＲＪ等效剂量组：每日
用药量为２９．６７ ｋｇ，约为人用量的ｌ０倍剂量。④ＹＨＲＪ高剂
量组：每日用药量为５９．３４ ｋｇ，约为人用量的２Ｏ倍剂量。
⑤ＹＨＲＪ等效剂量＋ＤＤＰ组：用药同②③。⑥ＹＨＲＪ高剂量＋
常规水提取，生药浓度３．４ｇ／ｍｌ，４℃保存备用。顺铂
（ＤＤＰ）：山东齐鲁制药厂产品，批号：２００２０１８。Ｂｃ１．２、Ｂａｘ、
（突变型）免疫组化染色试剂盒为武汉博士德生物工程有
限公司产品。Ｆａｓ多克隆抗体、ＦａｓＬ多克隆抗体均为美国Ｓａｎ—
ｔａ Ｃｒｕｚ公司产品，购自北京中山生物技术有限公司。ＮＦ ＫＢ
多克隆抗体为美国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司产品，购于武汉博士德生物
工程有限公司。ＮＦ—ＫＢ原位杂交检测盒为武汉博士德生物工
程有限公司产品。动物总ＲＮＡ提取试剂盒为北京鼎国生物技
ＤＤＰ组：用药同②④。造模第２天开始用药，ＤＤＰ组小鼠给
药７天和各含ＹＨＲＪ组小鼠给药１ １天，ＮＳ组小鼠灌肠生理盐
水ｌ１天，于第１３天颈椎脱臼处死全部动物，取出肿瘤。
１．５免疫组化法检测ＹＨＲＪ方对荷Ｈ，，６１５小鼠肿瘤细胞凋亡
调控基因Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ、Ｐ”、ＮＦ—ＫＢ蛋白表达肿
术发展中心产品。ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ：购自宝 瘤组织制作蜡片，按免疫组化染色试剂盒说明进行操作，
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３４８・
ＤＡＢ显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观
察。结果判定：Ｆａｓ、ＦａｓＬ蛋白阳性染色均为胞浆、胞膜出现
棕黄及棕褐色均匀颗粒，其余主要为胞浆表达。每片观察５００
个肿瘤细胞，共观察５ ０００个细胞，计数表达阳性肿瘤细胞数，
并算出其百分比。
１．６原位杂交法检测ＹＨＲＪ方对荷Ｈ，，６１５小鼠肿瘤组织ＮＦ—
ＫＢ ｍＲＮＡ表达 无菌摘除肿瘤后，立即予以４％多聚甲醛／
０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．０～７．４，含有０．１％ＤＥＰＣ）固定。标本较
大时用刀片切成厚度不超过４ｍｍ的小块，固定２小时。按
ＮＦ－Ｋ８原位杂交检测试剂盒说明书进行原位杂交操作。ＤＡＢ
显色，苏木素轻度复染，充分水洗。酒精脱水，二甲苯透明
熬疑
１．７ ＲＴ—ＰＣＲ检测ＹＨＲＪ方对凋亡调控基因Ｂａ￣、Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ
表达影响 自液氮中取出肿瘤组织．按动物总｝｛ＮＡ提取试剂
盒提取细胞总ＲＮＡ，测ＯＤ值计算ＲＮＡ含量，ｔＩＮＡ电泳，观
察可见１８Ｓ，２８Ｓ ＲＮＡ带 按ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ试利盒操作说
明进行操作，以试剂盒提供的引物作内对照 反转 『乏应条
件：３０℃，１０分钟；４２℃，３０分钟；９９℃，５分钟；５℃，５
分钟。ＰＣＲ反应条件：９４％，２分钟，１次；９４℃，５０秒；
６２℃，５Ｏ秒；循环３５次；７２％，１分钟。ＤＮＡ电泳：取ＰＣＲ
产物ｌＯＩｘｌ与２ ｌ的上样缓冲液混合，用１×ＴＡＥ缓冲液配制
２％琼脂糖进行水平平板电泳，电压５Ｖ／ｃｍ，电泳４０分钟，
然后在２５４ｎｍ波长的紫外灯下观察，麻用ＵＶＩ凝胶成像系统
摄取凝胶图像并进行统计学处理。
１．８统计学方法采用Ｘ 检验及Ｆ检验。
２结果
２．１ 原位杂交法检测ＹＨＲＩ方对荷Ｈ，，６１５小鼠肿瘤组织ＮＦ—
ＫＢ ｍＲＮＡ表达见表１。表１显示，与ＮＳ组及ＤＤＰ组比较，
ＹＨＲＪ等效剂量组及中药含ＤＤＰ组明显降低ＮＦ—ＫＢ ｍＲＮＡ表
达（Ｐ＜０．０１）。
表１ 各组荷Ｈ２２６１５小鼠肿瘤Ｎ ＫＢ ｍＲＮＡ
表达比较（接种第ｌ３天，ｎ：１０
与ＮＳ组比较，｛ Ｐ＜０ ０１；与ＤＤＰ组比较，＃＃Ｐ＜Ｏ ０
２．２免疫组化法检测ＹＨＲＪ方对荷Ｈ２２６１５小鼠肿瘤细胞凋亡
调控基因Ｆａｓ、ＦａｓＩ 、Ｂｅｌ一２、Ｂａｘ、Ｐ 、ＮＦ—ＫＢ蛋白表达的影
响 见表２。表２显示：与Ｎｓ组比较，各加药组均能增高
Ｆａｓ蛋白表达（Ｐ＜０．０１）。与Ｎｓ组比较，ＹＨＲＪ等效剂量＋
ＤＤＰ组能明显降低ＦａｓＬ基因蛋白表达（Ｐ＜０．０１）；与ＤＤＰ
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第６期
表２各组荷瘤小鼠肿瘤Ｆａｓ、ＦａｓＬ、ＮＦ．ＫＢ、Ｐ”、Ｂａｘ、
Ｂｅｌ－２基因蛋白表达比较（ｎ＝１０）
与ＮＳ组比较，￥Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１；与ＤＤＰ组比较， ＜Ｏ ０５，＃ ＜０．０１
组比较，中药组及中药含ＤＤＰ组能明显降低ＦａｓＬ基因蛋白表
达（Ｐ＜０．Ｏ１）。与Ｎｓ组比较，各加药组均能降低ＮＦ—ＫＢ蛋
白表达（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ等效
剂量组、ＹＨＲＩ高剂量组、ＹＨＲＪ高剂量＋ＤＤＰ组能降低ＮＦ—
ＫＢ蛋白表达（Ｐ＜０．０１）。与Ｎｓ组比较，各加药组能明显降
低突变型 基因蛋白表达（Ｐ＜０．０１）；与ＤＤＰ组比较，中
药组及中药含ＤＤＰ组能明显降低突变型 基因蛋白表达（Ｐ
医结合肝病杂志 ｝０ｌＱ生箜 鲞箜鱼
＜０．０１）。与Ｎｓ组比较，各加药组明显增高Ｂａｘ基因蛋白表
达（Ｐ＜０．０１）；与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ高剂量组及中药含
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３４９・
现，许多诱导细胞凋亡的因子，如化疗药物、电离辐射在诱
导肿瘤细胞凋亡的同时，由于活化了ＮＦ一－ｃＢ，会使其诱导凋
亡的作用下降，因此ＮＦ． Ｂ活化的抑制已成为肿瘤治疗研究
的热点之一 。
ＤＤＰ组明显增高Ｂ 基因蛋白表达（Ｐ＜０．０１）。与Ｎｓ组或
ＤＤＰ组比较，中药组及中药含ＤＤＰ组能明显降低Ｂｃｌ一２基因
蛋白表达（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。
综合以上实验结果，ＹＨＲｊ方在诱导Ｈ ：细胞凋亡过程中，
现代中药药理研究发现，许多中药具有诱导肝癌细胞凋
亡的作用 ＇“］。如周振华等 研究发现健脾理气方有促进小
鼠ＨＡＣ肝癌细胞凋亡作用，能上调肿瘤细胞Ｂａｘ基因蛋白表
达。郭伟剑等 研究发现，健脾理气药对肝癌细胞株ＳＭＭＣ一
能增强凋亡信号转导基因Ｆａｓ蛋白表达，降低ＦａｓＬ表达，增
强促细胞凋亡调控基因Ｂａｘ蛋白表达，降低细胞凋亡保护基
因ＮＦ—ＫＢ、Ｂｃ１ ２及突变型Ｐ 基因表达，从而起到诱导细胞凋
亡作用。
２．３ ＲＴ—ＰＣＲ检测ＹＨＲＪ方对凋亡调控基因Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ
表达影响见表３（由于经费原因，ｎ＝６）。表３结果显示：
与Ｎｓ组及ＤＤＰ组比较，ＹＨＲｊ等效剂量组能明显增高Ｂａｘ基
因ｍＲＮＡ表达（Ｐ＜０．００１）。与Ｎｓ组比较，各加药组能明显
降低Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ表达（Ｐ＜０．０５或 ＜０．００ １），与ＤＤＰ组比
较，ＹＨＲＪ高剂量组能明显降低Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ表达（Ｐ＝
０．Ｏ０１）
表３ ＹＨＲＪ方对荷Ｈ２２６１５小鼠肿瘤细胞凋亡调控基因
Ｂａｘ、ＢｃＩ－２ ｍＲＮＡ表达影响（ｎ＝６）
各组荧光强度与阳性对照组荧光强度比值
组别
Ｂａｘ Ｂｃｌ一２
与ＮＳ组比较，｝Ｐ＜０．０５，｝ Ｐ＜０．００１；与ＤＤＰ组比较，☆Ｐ＝
０．００１．＃＃＃Ｐ＜０．００１
３讨论
细胞凋亡（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ＡＰＯ）是细胞由于内外环境的变
化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起细胞主动死亡的
过程，是细胞死亡的两种方式之一。现代医学研究表明，诱
导细胞凋亡是药物发挥抗肿瘤作用的重要机制之一。在细胞
的凋亡过程中，许多癌基因、原癌基因和抑癌基因参与了细
胞凋亡过程的调控 ’ ，主要有Ｆａｓ／ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２基因家族、
抑癌基因、ＮＦ—ｘＢ基因。其中Ｆａｓ属于肿瘤坏死因子／神经
生长因子（ＴＮＦ／ＮＧＦ）转移膜受体超家族，当它受到抗体及
配体ＦａｓＬ的刺激时诱导细胞凋亡 。Ｂｃｌ一２和Ｂａｘ同为Ｂｃｌ一２
家族成员，Ｂａｘ能促进细胞凋亡，Ｂｃｌ一２能抑制细胞凋亡，在
促凋亡因素刺激下，Ｂａｘ／Ｂｃ１．２比值将决定细胞的死活 ］。
Ｐ”基因与肿瘤关系最为密切，６０％以上的人类肿瘤细胞中存
在Ｐ５３基因的突变失活，野生型Ｐ”能抑制肿瘤发生，是抗癌
基因，而突变型则反而促进肿瘤发生，成为癌基因 川。ＮＦ．
．ｃＢ是由Ｒｅｌ蛋白家族中的成员以同源或异源二聚体形式组成
的一类蛋白质，以非活性形式存在于胞质。一旦接受刺激信
号，ＮＦ—ＫＢ活化并易位核内，调节下游基因的表达。最近发
７７２１具一定的诱导凋亡及抑制肝癌细胞效应，能上调 、
Ｐ ＷＡＦ１／ＣＩＰ１基因的表达，且对肿瘤细胞端粒酶活性有抑制
作用。杨雁等¨ 研究发现黄芪总苷具有诱导肝癌细胞株
ＨｅｐＧ２细胞和Ｂｅｌ￣４０２细胞凋亡的作用，能七调肝癌细胞的
ｗｔＰ 表达。李伯利等 研究发现，冬凌草甲索能够明显抑制
ＨｅｐＧ２细胞增殖，并诱导肝癌细胞凋亡，其作用途径可能与
调ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ表达有关。郑国灿等” 通过丹参酮Ｉ
（Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ Ｉ）对人肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）的体外实验研究发
现，丹参酮Ｉ有抑制ＨｅｐＧ２细胞生长，阻滞ＨｅｐＧ２细胞周期
于Ｇｏ～Ｇ 期的作用，并可通过下调Ｂｃｌ・２基因表达（Ｐ＜
０．０１）、上调Ｂａｘ基因表达（Ｐ＜０．０１）诱导ＨｅｐＧ２细胞凋
亡。王春涛等 研究证实，白花蛇舌草体外诱导人肝癌
ＨｅｐＧ２细胞凋亡的作用。以上说明，在抑制肝癌生长方面，
中药可能主要是通过诱导细胞凋亡实现的。
我们前期的研究结果显示，ＹＨＲＪ方对Ｈ： 移植瘤小鼠肝
癌细胞具有诱导细胞凋亡作用，荧光显微镜下可观察到典型
的凋亡形态学变化，流式细胞术检测结果显示细胞周期出现
Ｇ。／Ｇ．期阻滞，并出现典型的凋亡峰。从本研究实验结果看，
ＹＨＲＪ方能增高促凋亡信号转导基因Ｆａｓ蛋白表达，减低ＦａｓＬ
基因蛋白表达，促进凋亡调控基因Ｂａｘ基因蛋白表达，降低
凋亡抑制基因Ｂｃ１．２基因与蛋白表达以及降低突变型 蛋白
表达与ＮＦ．ＫＢ基因与蛋白表达。分析以上结果，我们认为
ＹＨＲＪ方可能从多个方面发挥其促肝癌细胞凋亡作用：①调节
凋亡信号转导基因Ｆａｓ／ＦａｓＬ表达水平。体内实验结果显示，
ＹＨＲＪ方增高荷Ｈ： 瘤小鼠癌细胞凋亡信号转导基因Ｆａｓ蛋白
表达，从而可以提高肿瘤细胞对凋亡的敏感性，减低ＦａｓＬ表
达则同样也增加了肿瘤细胞对凋亡的敏感性，能增强机体Ｔ
淋巴细胞对其的免疫监视作用 ；②调节凋亡相关调控基因
Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２、突变型 、ＮＦ－ＫＢ的表达。Ｂａｘ／Ｂｃｌ￣是调节细
胞凋亡的重要相关基因，Ｂｃｌ一２高表达，可提高细胞凋亡的阈
值，抑制细胞凋亡，而Ｂａｘ的高表达则可促进细胞凋亡。
ＹＨＲＪ方可以使Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２比值升高，从而促进细胞凋亡。
ＹＨＲＪ方能降低促进肿瘤发生的突变型 表达水平。ＮＦ—ＫＢ
是ＴＮＦ死亡途径中重要的抑制凋亡的基因，其高表达的作用
可以产生高浓度的ＩＡＰ（凋亡蛋白抑制因子），进而下调
Ｃａｓｐａｓｅ而阻断细胞凋亡 ，ＹＨＰｄ方能使其阻断细胞凋亡
的环节得到抑制。
中药复方的特点是多成分、多系统、多器官、多效应，
因此作用机制可能是多方面。 （下转第３６２页）
・
３６２・
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第６期
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（上接第３４９页）以上研究表明ＹＨＲＪ方对肝癌细胞凋亡的多
个环节均有一定影响，是中药复方多种有效成份相互作用的
结果。
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（修回日期：２０１０—０９—１６编辑：胡肃平）
2024年4月6日发(作者：香楠楠)
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３４６・ 医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第６
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－０２６４．２０１０．０６．００９
益气活血软坚解毒方对荷Ｈ２２ ６１５小鼠肝癌细胞凋亡相关基因Ｆａｓ、
ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ、Ｐ５ 、ＮＦ。ｓ：Ｂ表达的影响
李东涛 孙桂芝 吴志奎 李杰 吕新霞 陈玉英 裴迎霞 祁 鑫
１．济南军区青岛第一疗养院（山东青岛，２６６０７１） ２．中国中医科学院广安门医院
摘要目的：研究益气活血软坚解毒（ＹＨＲＪ）方对荷Ｈ ６１５小鼠肝癌细胞凋亡调控基因Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｂｃ１．２、
Ｂａｘ、Ｐ”、ＮＦ—ＫＢ表达的影响。方法：将动物分组为Ｎｓ组（正常对照组）、ＤＤＰ组（顺铂组）、ＹＨＲＪ等效剂量组、
ＹＨＲＪ高剂量组、ＹＨＲＪ等效剂量＋ＤＤＰ组、ＹＨＲＪ高剂量＋ＤＤＰ组，应用免疫组化、原位杂交、ＲＴ—ＰＣＲ等方法对用
药后的荷Ｈ２２６１５小鼠肝癌细胞凋亡主要相关基因Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ、 、ＮＦ—ＫＢ蛋白与ｍＲＮＡ表达进行检测。
结果：免疫组化检测结果显示：与Ｎｓ组比较，各加药组均能增高Ｆａｓ、Ｂａｘ基因蛋白表达（均Ｐ＜０．０１），均能降低
ＮＦ－ＫＢ蛋白表达（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）及降低突变型Ｐ 基因蛋白表达（Ｐ＜０．０Ｉ）。与Ｎｓ组比较，ＹＨＲＪ等效剂量
＋ＤＤＰ组能明显降低ＦａｓＬ基因蛋白表达（Ｐ＜０．叭）。与ＤＤＰ组比较，中药组及中药含ＤＤＰ组能明显降低ＦａｓＬ及突
变型Ｐ”基因蛋白表达（均Ｐ＜０．０１）。与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ等效剂量纽、ＹＨＲＪ高剂量组、ＹＨＲＪ高剂量＋ＤＤＰ组能
降低ＮＦ—ＫＢ蛋白表达（均Ｐ＜０．０１）。与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ高剂量组及中药含ＤＤＰ组明显增高Ｂａｘ基因蛋白表达
（均Ｐ＜０．０１）。与ＮＳ纽与ＤＤＰ组比较，中药纽及中药含ＤＤＰ组能明显降低Ｂｅ１－２基因蛋白表达（Ｐ＜０．０５或尸＜
０．０１）。原位杂交检测ＮＦ—ＫＢ ｍＲＮＡ表达结果：与ＮＳ组及ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ等效剂量组及中药含ＤＤＰ组明显降低
ＮＦ．ＫＢ ｍＲＮＡ表达（均Ｐ＜０．０１）。ＲＴ—ＰＣＲ检测Ｂａｘ、Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ表达结果：与Ｎｓ组及ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ等效剂
量组能明显增高Ｂａｘ基因ｍＲＮＡ表达（均Ｐ＜０．００１）。与Ｎｓ组比较，各加药组能明显降低Ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ表达（Ｐ＜
０．０５或Ｐ＜０．００１）；与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ高剂量组能明显降低Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ表达（Ｐ＝０．０１）。结论：ＹＨＲＪ方能够
提高荷Ｈ，，６１５小鼠肝癌细胞凋亡促进基因Ｆａｓ、Ｂａｘ表达，减低细胞凋亡抑制基因ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２表达，降低细胞凋亡保
护基因突变型Ｐ５ 蛋白与ＮＦ—ＫＢ基因表达，这些作用是诱导肝癌细胞凋亡的分子基础。
关键词肝癌；益气活血软坚解毒方／药效学；细胞凋亡；基因调控；实验研究
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｙｉｑｉｈｕｏｘｕｅ，Ｒｕａｎｊｉａｎｊｉｅｄｕ ｒｅｃｉｐｅ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒｅｇｕ－
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，
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ｒｉｕｍ ｆ ｏＪｉｎａｎ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ（Ｑｉｎｇｄａｏ Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２６６０７ １）Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｙｉｑｉ，Ｈｕｏｘｕｅ，Ｒｕａｎｊｉａｎ＆Ｊｉｅｄｕ（ＹＨＲＪ）Ｒｅｃｉｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａ—
ｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌ１．ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｓｕｃｈ ａｓ Ｆａｓ，ＦａｓＬ，Ｂｃｌ－２，Ｂａｘ，Ｉ）） ，ＮＦ—ＫＢ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｈ２２ ６１５
Ｔｕｍｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ６ ｇｒｏｕｐｓ：ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ，
ＹＨ１ＬＩ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ．Ｉｍｍｕｎ０ｈｉｓｔ０ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｉｔｕ—
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ＲＴ—ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ＨＣＣ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｆａｓ，ＦａｓＬ，Ｂｃ１－２，Ｂａｘ， ，ＮＦ—
ＫＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｈ，，６１５ ｔｕｍｏｒ ａｆｔｅｒ １３ ｄａｙｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ：
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０１）ａｎｄ ＹＨＲＪ ｅ—
ｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦａｓＬ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦａｓＬ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ ３０２７１６５６）；Ａ通讯作者
中西医结合肝病杂志２０１０年第２Ｏ卷第６期
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３４７・
０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＦ—ＫＢ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜
０．０５ ｏｒ Ｐ＜０．Ｏ１）；Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ ｒｏｕｐ，ＹＨＲＪｇ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ
＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＦ．ＫＢ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ
ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅＢｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ Ｐ５ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０１）；Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，Ｃｈｉ—
ｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｒｏｕｐｓｇ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＋ＤＤＰ ｒｇｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｐ５ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜
０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜
０．０１）；Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｒｏｕｐ，ＹＨＲＪｇ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＋ＤＤＰ ｒｇｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．ｏ１）．Ｔｈｅ ｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｕｌｔｓ ＮＦ—ＫＢ ｍＲＮＡ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ：
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ。ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＋ＤＤＰ ｇｒｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ
ｏｂｖｉｏｕｓｌｖ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＦ—ＫＢ ｍＲＮＡ（Ｐ＜０．Ｏ１） ．Ｔｈｅ ＲＴ．ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ，Ｂｅｌ－２ ｍＲＮＡ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ：ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ
ｍＲＮＡ（尸＜０．００ １）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ ａｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ一２
ｍＲＮＡ（Ｐ＜０．０５ ｏｒ Ｐ＜０．００１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ＹＨＲＪ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ（Ｐ＝０．Ｏ１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＹＨＲＪ ｒｅｃｉｐｅ ｃｏｕｌｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＨＣＣ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｈ２２６１５ ｔｕｍｏｒ，
ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆａｓ ａｎｄ Ｂａｘ，ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦａｓＬ ａｎｄ Ｂｃｌ・２（ｔｈｅ ｒｅｓｔｒａｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｇｅｎｅｓ），
ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ （ａ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ）ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＮＦ—ＫＢ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｓｅ ｒｏｌｅｓ ａｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｈｎ—
ｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ＨＣＣ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ ｈｅｐａｔｏｃａｒｅｉｎｏｍａ；Ｙｉｑｉｈｕｏｘｕｅ Ｒａａｎｊｉａｎｊｉｅｄｕ ｒｅｃｉｐｅ／ｐｈａｒｍａｅｏｄｙｎａｍｉｃｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ；ｅｘｐｅｒ—
ｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ
益气活血软坚解毒（ＹＨＲＪ）方是导师孙桂芝教授在归纳
古代文献的基础上，结合几十年的临床实践总结出来的应用
于肝癌患者的主要方剂。以往的研究证实，以ＹＨＲＪ方治疗
肝癌在临床上取得了抑制肿瘤生长，提高生活质量，延长生
存期的作用 。前期实验研究证实该方能抑制荷Ｈ： ６１５小鼠
肝癌细胞生长并延长荷Ｈ 昆明鼠生存期作用 ；荧光显微镜
生物工程（大连）有限公司产品。引物：由赛百盛公司合成。
Ｂａｘ上游５’一ＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡ一３’（１ ５９ｂｐ），下游
５’ 一ＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣ ＩＴＧＧＡＴＣＣ一３’ （４７０ｂｐ）． Ｆｒａｇｅｍｅｎｔ：
３１２ｂｐ，ＲｅｆｅｎｏＧｅｎｅｂａｎｋ ＸＭ ００９０９３；Ｂｃｌ一２上游５’一ＣＡＧＣＴＧ．
ＣＡＣＣＴＧＡＣＧＣＣＣＴＦ一３’
ＴＡＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣ一３’
Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＸＭ １４７４５。
（３８３ｓｉｔｅ），下游５’一ＧＣＣＴＣＣＧＴ．
（６１３ｓｉｔｅ），Ｆｒａｇｅｍｅｎｔ：２３１ｂｐ Ｒｅｆｅｎｏ—
及流式细胞仪检测显示ＹＨＲＪ方对荷Ｈ ６１５小鼠肝癌细胞有
诱导细胞凋亡作用，其提取物对人肝癌细胞系ＢＥＬ－７４０２细胞
有促进凋亡作用 。为进一步研究其诱导细胞凋亡的分子机
１．３主要仪器ＢＨ２一ＲＦＣ落射式荧光显微镜，Ｏｌｙｍｐｕｓ公司
产品。ＰＴＣ一１００ＴＭＰＣＲ扩增仪，美国ＭＪ—Ｒｅｓｅａｒｃｈｌｎｃ。ＵＶＩ凝
制，我们对其诱导荷Ｈ ６１５小鼠肝癌细胞凋亡过程中Ｆａｓ、
ＦａｓＬ、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｐｓ 、ＮＦ—ＫＢ基因表达变化进行了检测。
１材料与方法
胶成像系统，英国ＵＶＩｔｅｃ公司。
１．４动物模型制备取生长状态良好接种第７天的Ｈ：：肝癌
６１５瘤源小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下取出瘤组织，除
１．１ 动物与瘤株６１５小鼠６０只，雄性，体重（１８ ４－２）ｇ，
去血块及坏死组织，用机械剪碎法做成单细胞悬液，在每只
购自中国药物及生物制品检定所；小鼠Ｈ 肝癌瘤株，由广安
门医院肿瘤实验室提供。
１．２材料ＹＨＲＪ方水煎剂，组方为黄芪、炒白术、田三七、
水红花子、藤梨根、凌霄花、炮山甲、白花舌蛇草、半枝莲，
６１５小鼠右腋部皮下接种２×１０。个瘤细胞。造模后随机分成６
组，每组１０只。①Ｎｓ组（正常对照组）：每日灌服生理盐水
０．２ｍｌ。②ＤＤＰ组（顺铂组）：按照ｌｍｇ／ 剂量给小鼠腹腔注
射０．２ｍｌ ＤＤＰ，１次／ｄ，共７次。③ＹＨＲＪ等效剂量组：每日
用药量为２９．６７ ｋｇ，约为人用量的ｌ０倍剂量。④ＹＨＲＪ高剂
量组：每日用药量为５９．３４ ｋｇ，约为人用量的２Ｏ倍剂量。
⑤ＹＨＲＪ等效剂量＋ＤＤＰ组：用药同②③。⑥ＹＨＲＪ高剂量＋
常规水提取，生药浓度３．４ｇ／ｍｌ，４℃保存备用。顺铂
（ＤＤＰ）：山东齐鲁制药厂产品，批号：２００２０１８。Ｂｃ１．２、Ｂａｘ、
（突变型）免疫组化染色试剂盒为武汉博士德生物工程有
限公司产品。Ｆａｓ多克隆抗体、ＦａｓＬ多克隆抗体均为美国Ｓａｎ—
ｔａ Ｃｒｕｚ公司产品，购自北京中山生物技术有限公司。ＮＦ ＫＢ
多克隆抗体为美国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司产品，购于武汉博士德生物
工程有限公司。ＮＦ—ＫＢ原位杂交检测盒为武汉博士德生物工
程有限公司产品。动物总ＲＮＡ提取试剂盒为北京鼎国生物技
ＤＤＰ组：用药同②④。造模第２天开始用药，ＤＤＰ组小鼠给
药７天和各含ＹＨＲＪ组小鼠给药１ １天，ＮＳ组小鼠灌肠生理盐
水ｌ１天，于第１３天颈椎脱臼处死全部动物，取出肿瘤。
１．５免疫组化法检测ＹＨＲＪ方对荷Ｈ，，６１５小鼠肿瘤细胞凋亡
调控基因Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ、Ｐ”、ＮＦ—ＫＢ蛋白表达肿
术发展中心产品。ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ：购自宝 瘤组织制作蜡片，按免疫组化染色试剂盒说明进行操作，
・
３４８・
ＤＡＢ显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观
察。结果判定：Ｆａｓ、ＦａｓＬ蛋白阳性染色均为胞浆、胞膜出现
棕黄及棕褐色均匀颗粒，其余主要为胞浆表达。每片观察５００
个肿瘤细胞，共观察５ ０００个细胞，计数表达阳性肿瘤细胞数，
并算出其百分比。
１．６原位杂交法检测ＹＨＲＪ方对荷Ｈ，，６１５小鼠肿瘤组织ＮＦ—
ＫＢ ｍＲＮＡ表达 无菌摘除肿瘤后，立即予以４％多聚甲醛／
０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．０～７．４，含有０．１％ＤＥＰＣ）固定。标本较
大时用刀片切成厚度不超过４ｍｍ的小块，固定２小时。按
ＮＦ－Ｋ８原位杂交检测试剂盒说明书进行原位杂交操作。ＤＡＢ
显色，苏木素轻度复染，充分水洗。酒精脱水，二甲苯透明
熬疑
１．７ ＲＴ—ＰＣＲ检测ＹＨＲＪ方对凋亡调控基因Ｂａ￣、Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ
表达影响 自液氮中取出肿瘤组织．按动物总｝｛ＮＡ提取试剂
盒提取细胞总ＲＮＡ，测ＯＤ值计算ＲＮＡ含量，ｔＩＮＡ电泳，观
察可见１８Ｓ，２８Ｓ ＲＮＡ带 按ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ试利盒操作说
明进行操作，以试剂盒提供的引物作内对照 反转 『乏应条
件：３０℃，１０分钟；４２℃，３０分钟；９９℃，５分钟；５℃，５
分钟。ＰＣＲ反应条件：９４％，２分钟，１次；９４℃，５０秒；
６２℃，５Ｏ秒；循环３５次；７２％，１分钟。ＤＮＡ电泳：取ＰＣＲ
产物ｌＯＩｘｌ与２ ｌ的上样缓冲液混合，用１×ＴＡＥ缓冲液配制
２％琼脂糖进行水平平板电泳，电压５Ｖ／ｃｍ，电泳４０分钟，
然后在２５４ｎｍ波长的紫外灯下观察，麻用ＵＶＩ凝胶成像系统
摄取凝胶图像并进行统计学处理。
１．８统计学方法采用Ｘ 检验及Ｆ检验。
２结果
２．１ 原位杂交法检测ＹＨＲＩ方对荷Ｈ，，６１５小鼠肿瘤组织ＮＦ—
ＫＢ ｍＲＮＡ表达见表１。表１显示，与ＮＳ组及ＤＤＰ组比较，
ＹＨＲＪ等效剂量组及中药含ＤＤＰ组明显降低ＮＦ—ＫＢ ｍＲＮＡ表
达（Ｐ＜０．０１）。
表１ 各组荷Ｈ２２６１５小鼠肿瘤Ｎ ＫＢ ｍＲＮＡ
表达比较（接种第ｌ３天，ｎ：１０
与ＮＳ组比较，｛ Ｐ＜０ ０１；与ＤＤＰ组比较，＃＃Ｐ＜Ｏ ０
２．２免疫组化法检测ＹＨＲＪ方对荷Ｈ２２６１５小鼠肿瘤细胞凋亡
调控基因Ｆａｓ、ＦａｓＩ 、Ｂｅｌ一２、Ｂａｘ、Ｐ 、ＮＦ—ＫＢ蛋白表达的影
响 见表２。表２显示：与Ｎｓ组比较，各加药组均能增高
Ｆａｓ蛋白表达（Ｐ＜０．０１）。与Ｎｓ组比较，ＹＨＲＪ等效剂量＋
ＤＤＰ组能明显降低ＦａｓＬ基因蛋白表达（Ｐ＜０．０１）；与ＤＤＰ
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第６期
表２各组荷瘤小鼠肿瘤Ｆａｓ、ＦａｓＬ、ＮＦ．ＫＢ、Ｐ”、Ｂａｘ、
Ｂｅｌ－２基因蛋白表达比较（ｎ＝１０）
与ＮＳ组比较，￥Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１；与ＤＤＰ组比较， ＜Ｏ ０５，＃ ＜０．０１
组比较，中药组及中药含ＤＤＰ组能明显降低ＦａｓＬ基因蛋白表
达（Ｐ＜０．Ｏ１）。与Ｎｓ组比较，各加药组均能降低ＮＦ—ＫＢ蛋
白表达（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ等效
剂量组、ＹＨＲＩ高剂量组、ＹＨＲＪ高剂量＋ＤＤＰ组能降低ＮＦ—
ＫＢ蛋白表达（Ｐ＜０．０１）。与Ｎｓ组比较，各加药组能明显降
低突变型 基因蛋白表达（Ｐ＜０．０１）；与ＤＤＰ组比较，中
药组及中药含ＤＤＰ组能明显降低突变型 基因蛋白表达（Ｐ
医结合肝病杂志 ｝０ｌＱ生箜 鲞箜鱼
＜０．０１）。与Ｎｓ组比较，各加药组明显增高Ｂａｘ基因蛋白表
达（Ｐ＜０．０１）；与ＤＤＰ组比较，ＹＨＲＪ高剂量组及中药含
・
３４９・
现，许多诱导细胞凋亡的因子，如化疗药物、电离辐射在诱
导肿瘤细胞凋亡的同时，由于活化了ＮＦ一－ｃＢ，会使其诱导凋
亡的作用下降，因此ＮＦ． Ｂ活化的抑制已成为肿瘤治疗研究
的热点之一 。
ＤＤＰ组明显增高Ｂ 基因蛋白表达（Ｐ＜０．０１）。与Ｎｓ组或
ＤＤＰ组比较，中药组及中药含ＤＤＰ组能明显降低Ｂｃｌ一２基因
蛋白表达（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。
综合以上实验结果，ＹＨＲｊ方在诱导Ｈ ：细胞凋亡过程中，
现代中药药理研究发现，许多中药具有诱导肝癌细胞凋
亡的作用 ＇“］。如周振华等 研究发现健脾理气方有促进小
鼠ＨＡＣ肝癌细胞凋亡作用，能上调肿瘤细胞Ｂａｘ基因蛋白表
达。郭伟剑等 研究发现，健脾理气药对肝癌细胞株ＳＭＭＣ一
能增强凋亡信号转导基因Ｆａｓ蛋白表达，降低ＦａｓＬ表达，增
强促细胞凋亡调控基因Ｂａｘ蛋白表达，降低细胞凋亡保护基
因ＮＦ—ＫＢ、Ｂｃ１ ２及突变型Ｐ 基因表达，从而起到诱导细胞凋
亡作用。
２．３ ＲＴ—ＰＣＲ检测ＹＨＲＪ方对凋亡调控基因Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ
表达影响见表３（由于经费原因，ｎ＝６）。表３结果显示：
与Ｎｓ组及ＤＤＰ组比较，ＹＨＲｊ等效剂量组能明显增高Ｂａｘ基
因ｍＲＮＡ表达（Ｐ＜０．００１）。与Ｎｓ组比较，各加药组能明显
降低Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ表达（Ｐ＜０．０５或 ＜０．００ １），与ＤＤＰ组比
较，ＹＨＲＪ高剂量组能明显降低Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ表达（Ｐ＝
０．Ｏ０１）
表３ ＹＨＲＪ方对荷Ｈ２２６１５小鼠肿瘤细胞凋亡调控基因
Ｂａｘ、ＢｃＩ－２ ｍＲＮＡ表达影响（ｎ＝６）
各组荧光强度与阳性对照组荧光强度比值
组别
Ｂａｘ Ｂｃｌ一２
与ＮＳ组比较，｝Ｐ＜０．０５，｝ Ｐ＜０．００１；与ＤＤＰ组比较，☆Ｐ＝
０．００１．＃＃＃Ｐ＜０．００１
３讨论
细胞凋亡（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ＡＰＯ）是细胞由于内外环境的变
化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起细胞主动死亡的
过程，是细胞死亡的两种方式之一。现代医学研究表明，诱
导细胞凋亡是药物发挥抗肿瘤作用的重要机制之一。在细胞
的凋亡过程中，许多癌基因、原癌基因和抑癌基因参与了细
胞凋亡过程的调控 ’ ，主要有Ｆａｓ／ＦａｓＬ、Ｂｃｌ一２基因家族、
抑癌基因、ＮＦ—ｘＢ基因。其中Ｆａｓ属于肿瘤坏死因子／神经
生长因子（ＴＮＦ／ＮＧＦ）转移膜受体超家族，当它受到抗体及
配体ＦａｓＬ的刺激时诱导细胞凋亡 。Ｂｃｌ一２和Ｂａｘ同为Ｂｃｌ一２
家族成员，Ｂａｘ能促进细胞凋亡，Ｂｃｌ一２能抑制细胞凋亡，在
促凋亡因素刺激下，Ｂａｘ／Ｂｃ１．２比值将决定细胞的死活 ］。
Ｐ”基因与肿瘤关系最为密切，６０％以上的人类肿瘤细胞中存
在Ｐ５３基因的突变失活，野生型Ｐ”能抑制肿瘤发生，是抗癌
基因，而突变型则反而促进肿瘤发生，成为癌基因 川。ＮＦ．
．ｃＢ是由Ｒｅｌ蛋白家族中的成员以同源或异源二聚体形式组成
的一类蛋白质，以非活性形式存在于胞质。一旦接受刺激信
号，ＮＦ—ＫＢ活化并易位核内，调节下游基因的表达。最近发
７７２１具一定的诱导凋亡及抑制肝癌细胞效应，能上调 、
Ｐ ＷＡＦ１／ＣＩＰ１基因的表达，且对肿瘤细胞端粒酶活性有抑制
作用。杨雁等¨ 研究发现黄芪总苷具有诱导肝癌细胞株
ＨｅｐＧ２细胞和Ｂｅｌ￣４０２细胞凋亡的作用，能七调肝癌细胞的
ｗｔＰ 表达。李伯利等 研究发现，冬凌草甲索能够明显抑制
ＨｅｐＧ２细胞增殖，并诱导肝癌细胞凋亡，其作用途径可能与
调ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ表达有关。郑国灿等” 通过丹参酮Ｉ
（Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ Ｉ）对人肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）的体外实验研究发
现，丹参酮Ｉ有抑制ＨｅｐＧ２细胞生长，阻滞ＨｅｐＧ２细胞周期
于Ｇｏ～Ｇ 期的作用，并可通过下调Ｂｃｌ・２基因表达（Ｐ＜
０．０１）、上调Ｂａｘ基因表达（Ｐ＜０．０１）诱导ＨｅｐＧ２细胞凋
亡。王春涛等 研究证实，白花蛇舌草体外诱导人肝癌
ＨｅｐＧ２细胞凋亡的作用。以上说明，在抑制肝癌生长方面，
中药可能主要是通过诱导细胞凋亡实现的。
我们前期的研究结果显示，ＹＨＲＪ方对Ｈ： 移植瘤小鼠肝
癌细胞具有诱导细胞凋亡作用，荧光显微镜下可观察到典型
的凋亡形态学变化，流式细胞术检测结果显示细胞周期出现
Ｇ。／Ｇ．期阻滞，并出现典型的凋亡峰。从本研究实验结果看，
ＹＨＲＪ方能增高促凋亡信号转导基因Ｆａｓ蛋白表达，减低ＦａｓＬ
基因蛋白表达，促进凋亡调控基因Ｂａｘ基因蛋白表达，降低
凋亡抑制基因Ｂｃ１．２基因与蛋白表达以及降低突变型 蛋白
表达与ＮＦ．ＫＢ基因与蛋白表达。分析以上结果，我们认为
ＹＨＲＪ方可能从多个方面发挥其促肝癌细胞凋亡作用：①调节
凋亡信号转导基因Ｆａｓ／ＦａｓＬ表达水平。体内实验结果显示，
ＹＨＲＪ方增高荷Ｈ： 瘤小鼠癌细胞凋亡信号转导基因Ｆａｓ蛋白
表达，从而可以提高肿瘤细胞对凋亡的敏感性，减低ＦａｓＬ表
达则同样也增加了肿瘤细胞对凋亡的敏感性，能增强机体Ｔ
淋巴细胞对其的免疫监视作用 ；②调节凋亡相关调控基因
Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２、突变型 、ＮＦ－ＫＢ的表达。Ｂａｘ／Ｂｃｌ￣是调节细
胞凋亡的重要相关基因，Ｂｃｌ一２高表达，可提高细胞凋亡的阈
值，抑制细胞凋亡，而Ｂａｘ的高表达则可促进细胞凋亡。
ＹＨＲＪ方可以使Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２比值升高，从而促进细胞凋亡。
ＹＨＲＪ方能降低促进肿瘤发生的突变型 表达水平。ＮＦ—ＫＢ
是ＴＮＦ死亡途径中重要的抑制凋亡的基因，其高表达的作用
可以产生高浓度的ＩＡＰ（凋亡蛋白抑制因子），进而下调
Ｃａｓｐａｓｅ而阻断细胞凋亡 ，ＹＨＰｄ方能使其阻断细胞凋亡
的环节得到抑制。
中药复方的特点是多成分、多系统、多器官、多效应，
因此作用机制可能是多方面。 （下转第３６２页）
・
３６２・
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第６期
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（修回日期：２０１０—０９—１６编辑：胡肃平）