2024年4月22日发(作者：谷梁飞光)
・
56
・
J
Shanxi
Meh
Univ
,
Jan.
2021
,
VW
52
No
-
幽门螺杆菌上调
miR
・
7
致胃上皮细胞
GES-1
凋亡
鄢春锦
，
刘
芬
，
严晓丹
，
姜
成
*
（
福建中医药大学中西医结合学院病原生物学教研室
，
福州
370169
；
通讯作者,
：
jcS93666@
sina.
im
）
摘要
：
目的
探讨
miR-S
对幽门螺杆菌感染胃上皮细胞凋亡的影响
。
方法
以呦感染
GESD
细胞
，
感染
24h
的细胞分
为
-
：
50
（
细胞
：
细菌）
组和
1
：
10
组;当感染比率为
1
：
10
（
细胞:细菌
）
时
，
按感染时间分为
24
h
组和
48
h
组
，同时设未感染细
胞为空白对照组
，
观察不同感染菌量和感染时间对
GESD
细胞
miR-S
和
RELA
表达的影响
。
以
miRSDp
类似物转染
GESD
细胞设为
miR-S
mimms
组,
mb
-
阴性序列转染
GES-1
为阴性对照组
（
NC
组
）
，
未转染细胞作为空白对照组
，观察各组细胞增
殖凋亡及
RELA
蛋白表达情况
。
实时定量
PCR
法检测
miR-S
表达量
,CCKD
法检测细胞增殖能力
，流式细胞仪检测细胞凋亡
率,
Western
blot
检测
RELA
蛋白表达量
。
结果
与空白对照相比较
，
感染
24
h
时
-
：
54
组及
-
：
10
组的
miR-S
表达量上调
，
差异有统计学意义
（
P<2.25
）
。当感染率
1
：
10
时
，
与空白对照组比较
，
感染
24
h
组和
48
h
组
miR-S
表达量均显著上调
（
P<
0.
05
）
,48
h
组
RELA
蛋白显著下降
（
P<0.
05
）
,
但
24
h
组差异无统计学意义
。
转染实验中发现
，
与空白对照组和
NC
组相比
较,
mimics
组细胞增殖能力明显下降
（
P<0.
05
）
,
细胞凋亡率明显增加
（
P<0.
05
）
,
RELA
蛋白表达显著降低
（
P<0.
05
）
o
结
论
Hp
通过上调感染细胞的
miR-S
分子调控其靶基因
RELA
的表达
，
抑制细胞增殖,促进细胞凋亡
，
这可能是呦导致胃上皮
细胞损伤致病的机制之一
。
关键词
：
幽门螺杆菌
；
胃上皮细胞
GESD
；
凋亡
；
miR-S
；
RELA
中图分类号
：
R473
文献标志码
：
A
文章编号
：
107
-6611
（
2021
）
01
-0052
-06
DOI
：
10.13753/L
Rwo
107
-6611.2021.01.
01
Helicobacter
pylori
inducre
apoptosis
of
gastric
eqitheliae
cells
GES-1
by
uprequlating
miR-1
eepression
YAN
Chunjin,
LIN
Fen,
YAN
XiaoUan
,
JINNG
Cheng*
(
Department
of
Pathogenic
Biology
,
College
nf
Inteprated
TraUitional
Chinese
and
Westera
Medician
,
Fujiaa
University
of
TraUitionai
Chiaese
Mepiciac
,
Fuzhon
350122
,
China
；
*
Correseonaina
authna,
：
jcl23666@
sina.
com)
AbstrecC
:
Objectiee
To
investi/te
the
ebect
of
miR-S
on
apopmsis
of
gasWic
epithe/al
cells
GES-1
infected
by
Hp.
Methofs
GES-1
cells
were
divided
into
-
:
50
garp
and
-
:
10
grorp
according
to
the
ratio
of
cell
and
bacte/a
when
infected
with
Hp
for
24
h
,
and
GES-1
cells
were
divided
into
24
h
garp
and
48
h
garp
according
to
the
infection
time
when
the
ceimbacte/a
ratio
of
-
:
10
,
and
the
uninfected
cells
were
chosen
as
control
garp.
GES-1
cells
was
tansfected
with
miR-S-5p
mimics
in
mimics
garp
and
miR-segative
sequences
in
NC
garp,anh
GES-1
cells
without
Weatwent
were
chosen
as
control
garp.
The
cell
proliferation
was
tested
by CCK-C
,
the
apopmsis
rate
was
evaluated
by
5ow
cytometa
,
the
amount
of
miR-S
of
cells
was
hetected
by
real-time
quantitative
PCR
,
and
RELA
protein
was
measured
by
Western
blot.
Resulis
Compared
with
control
garp,the
expression
of
miR-S
was
significanSy
uprequmted
in
-
：
50
garp
,1
：
140
garp
after
infected
with
Hp
for
24
h(
P
<
0.
05
)
.
Compared
with
control
garp
,the
expression
of
miR-S
was
sig-
nihcantly
uprequmted
in
24
h
grorp
and
48
h
garp
at
the
ratio
of
cell
and
bacte/a
of
-
：
140(
P<0.
05)
,
and
the
amount
of
RELA
pro
min
was
reduced
significanSy
in
48
h
garp(
P
<
0.
05
).
Compared
with
control
grorp
and
NC
garp
,
the
cell
proliferation
was
signifi
cantly
decreased
in
mimics
garp
,
the
cell
apopmsis
was
significantly
increased
,
and
the
level
of
RELA
protein
was
decreased
signifi
cantly
(
all
P<0.
05).
Conclusion
Hp
downrequmtes
the
expression
of
miR-S
target
gene
RELA
contributing
to
cell
apopmsis
tharah
uprequmting
miR-S
in
infected
cebs,which
is
one
of
the
mechanisms
of
gastric
epithebal
cell
damaye
induced
by
Hp
.
Keq
words
：
HePcobacOs
p-ylort
；
gastric
epithe/al
cell
line
GES-1
；
apopmsis
；
microRNA-S；
RELA
micaRNA
（
miRNA
）
是一类非编码小分子
RNA
,
H0
后胃黏膜的多种
miRNA
表达水平发生改变
,影
长约
22
bp,
具有在转录后水平调控基因表达的功
能
。
研究表明
，
感染幽门螺杆菌
（
HePcoOacter
pylort
；
基金项目
：
福建省自然科学基金资助项目
（
2018
J01878
-
响了胃上皮细胞增殖
、
凋亡
、
炎性反应
、
癌基因或抑
癌基因的表达
,
参与消化道疾病的发生和发展
［
］
。
作者简介
：
鄢春锦
，
男
，1979
-09
生
，
硕士
，
实验师,
:
845092547@
qq.
com
收稿日期
：
2022
-1
-1
山西医科大学学报
，
2021
年
-
月
，
第
52
卷第
（
期
miR-S
是一类较为保守的
miRNA,2001
年被发现
，
位于第
9
号染色体
，
有
miR-S
-1
、
miR-S
-2
、
miR-SO
三
种不同的
DNA
序列
，
但其成熟序列相同
。
据报道
miR-S
在多种肿瘤中表达下降
，
如
MALT
淋巴瘤
、
胃
癌
、
宫颈癌
、
结直肠癌
、
乳腺癌等宀
2
,
具有抑增殖促
凋亡的作用
。
人们早先观察到
Ho
感染可致胃上皮细胞凋
亡
[]
,
本课题组前期研究工作同样表明
，
幽门螺杆
菌感染可抑制正常胃上皮细胞
GESO
的生长⑷
，
并
导致细胞凋亡
[]
,
前期研究也发现细胞细菌比
1
：
52
与
1
：
105
这两种浓度和
24
h
与
42
U
这两种感染时
间对细胞的增殖凋亡影响显著
，
适合用于在后续实
验中对其凋亡机制做进一步探讨
。
在
Hi
致细胞凋亡过程中
，
具有抑增殖促凋亡
作用的
miR-S
是否起了作用
？
如果确实有
，
那么
miR-S
是如何起作用的
，
其靶基因可能是什么
？
根据生物学信息软件
Tajethcgd
、
miRBase
和相
关文献报道
J]
,NF-pB
成员
RELA
是
miR-S
的靶基
因
,
miR-S
可通过抑制
RELA
表达改变
NF-pB
通路
活性
，
抑制下游分子包括与细胞增殖凋亡有关分子
如
Bcl-S
家族蛋白表达
，
从而影响细胞的增殖凋亡
。
为此我们假设
：
幽门螺杆菌通过调控
miR-S
水
平改变靶基因
RELA
的表达
，
导致感染细胞凋亡
。
为了验证这一假设
，
我们进行了以下实验
。
1
材料与方法
1.2
材料
人胃黏膜上皮细胞
GESO
购自中国医学科学
院肿瘤所
；
幽门螺杆菌标准菌株
NCTC11627
,
来源
于福建医科大学病原生物学系
；
DMEM
基础培养
基
、
青霉素一链霉素混合液购自美国
Hy/ona
公司
；
胎牛血清
、
含
EDTA
胰蛋白酶
、
OptWMEM
®
I
Rv-
dpceP
Sejm
Medium
购自美国
Gibca
公司
；
布氏培
养基和抗生素混合液
（
TMP
、
万古霉素
、
多黏菌素
B
）
购自北京陆桥技术公司
;
CCK-5
增强型溶液购自大
连美仑生物公司
；
RNAmisi
mpjRNA
快速提取试剂
盒购自北京艾德莱生物公司
;
NovScUpt
®
Plus
AllLu-
ona
1st
Strand
cDNA
Syathesis
SuperMio
（
gDNA
Pur/v
）
^NovodtaS
®
SYBR
qPCRSuperMio
Plus
购自上
海近岸蛋白科技公司
；
RIPA
强裂解液
、
PMSF
、
Au
upix
V
PE/7-AAD
双染细胞凋亡检测试剂盒购自
-
57
-
江苏凯基生物公司
;
PhosUTOP™
购自瑞士
Rocha
公
司
；
CochtaimSDS-LAGE
凝胶制备试剂盒购自北京康
为世纪公司
；
PageRuler™
1
Prestained
Protein
Lahdaf
购自美国
Therms
公司
；
BCA
蛋白定量试剂盒
、
SDS-
PAGE
蛋白上样缓冲液
（
5X
）
、
封闭液购自上海碧云
天生物公司
；
PVDF
膜购自美国
MidipOTj
公司
；
ECL
化学发光试剂盒购自苏州宇恒公司
；
HRPpaipupdwi
AfUnipun
Goat
Anti-Mossa
IgG
（
H
+
L
）
HRP-conju-
gated
Affiniqura
Goat
Anti-Radbit
IgG（H
+
L
）
、
RELA
抗体
（
兔抗
）
、
GAPDH
抗体
（
鼠抗
）
购自美国
pnteixi
tech
公司
;
Liqofectamine™
1
3700
Transfec/ox
Reayext
购自美国
Rvitnpep
公司
。
1.2
细菌培养
H
细菌培养在含抗生素混合液的布氏培养基
（
含
5%
脱纤维冻融羊血
），
37
C
饱和湿度烛缸培养
3
U
用接种环刮取培养基上的
Hp
活菌
，
悬于少量
PBS
液中
，
用分光光度计测定其吸光度
A
值
[5]
,
1^66
3
um
为
1
xl^cfu/m
1
。
1-
3
细胞培养
用
1%
双抗
15%
胎牛血清的高糖
DMEM
培养
，
培养环境为
5%CO
2
、
3
7
C
饱和湿度的二氧化碳培
养箱
。
当细胞生长达到
89%
融合时
，
用
0.25%
胰蛋
白酶消化传代
。
1.0
Hp
对
GESO
细胞
miR-S
及
RELA
表达影响的
实验分组
将细胞接种贴壁培养
7
-
按一定比例感染细菌
继续培养
。
细菌感染时换不含抗生素培养基培养
。
分析细菌感染量对细胞
miR-S
表达的影响时
，
感染
时间定为
24
-
感染组分为
1
：
52
组
（
细胞
：
细菌
）
和
1
：
75
组;分析感染时间对细胞
miR-S
表达的影响
时
，
感染率为
1
：
105,
感染时间组分为
24
h
组和
45
U
组
。
在
Ho
感染对细胞
RELA
蛋白表达的影响实验
中
，
感染组分为
1
：
50
组和
1
：
75
组
，
感染
48
-
同
时设未感染细胞为空白对照组
。
1-
5
瞬时转染
GESO
细胞构建
miR-S
过表达细胞
模型
以
miR-SOp
类似物转染
GESO
细胞设为
miR-S
mimics
组,
miR
-
阴性序列转染
GES-1
为阴性对照
组
（
NC
组
）
，
未转染细胞作为空白对照组
。
实验接
种细胞于
6
孔板,融合至
89%-99%
时转染
。
使用
Opti-MEM
培养基稀释
Liqofectamine
®
3700
试剂
，
充
-
53
-
分混匀
。
使用
Opl-MEM
培养基稀释
DNA
,
制备
DNA
预混液
，
然后添加
P3700
tm
试剂
，
充分混匀
。
在
每管已稀释的
Liqofectamine®
3700
试剂中加入稀释
的
DNA
（
1
：
5
比例
）
。
室温孵育
7
-
7
md
。
加入
DNA-
脂质体复合物至细胞中
,37
C
孵育细胞
42
—
miR-S-S-Sp
mimics
序列为
：
5
，
-
UGGAAGAC-
UAGUGAUUUUGUUGUU
-
3
'
,5
'
-
AACAACAAAAU-
CACUAGUCUUCCA-3'
；
miR-NC
序列为
：
5'
-UCA-
CAACCUCCUAGAAAGAGUAGA
-
3
，
,5'
-
UCUACU-
CUUUCUAGGAGGUUGUGA
-
3,
1.
2
细胞增殖能力的测定
采用
CCK-5
法检测细胞增殖情况
。
在
99
孔板
进行细胞培养处理
，
培养
42
U
后加入
7
口
CCK-5
溶液
，
孵育
1-
5
U
o
用酶标仪测定
452
nm
处的吸光
度
A
值
。
细胞增殖相对值
=
实验组
A
值
/
对照组
A
值
X105%
。
1.
5
实时荧光定量
PCR
检测
miR-S
1.5.1
样品总
RNA
提取
样品中加氯仿
，
剧烈振
荡
7
s,
室温放置
3
mix,
7
005
J
mix
离心
7
miu
。
取上清转入到新的离心管
，
加入
1-
5
倍体积的无水
乙醇
，
涡旋混匀
，
得到样品总
RNA
混合物
。
1.5.2
小分子
RNA
纯化及富集
将混合物加入一
个吸附柱
RA
中
，
7
005
Jmix
离心
37
s,
弃掉废液
。
加
Wash
Solutiox
1,7
200
J
mix
离心
35
s,
弃掉废
液
。
将吸附柱
RA
放回空收集管中
,7
005
Jmix
离
心
2
mix
。
加入
Wash
Solutiox
2/P
,
12
005
J
mix
离
心
35
s,
弃掉废液
，
重复
2
遍
。
取出吸附柱
RA,
放入
一个
RNasa
frev
离心管中
，
加
RNasa
frev
watvr
室温
放置
1
mih,12
005
J
mix
离心
1
mix
。
1.7.3
逆转录
cDNA
逆转录反应体系
7
门
：
Gene
SSecifle
Psmvr
（
RT
:
2
pimol/P
）
1
p!
、
HiscSpt
Enzymv
MP
1
p
i
、
Rnase-fje
H
2
O
2
p
i
、
总
RNA
3
p
i
、
2
xRT
Mio
7
p
i
混匀
。
逆转录条件为
52
C
7
mid,
85
C
2
mid,
4
C
保存
；
其中
miR-SOp
的
RT
引
物为
5'
-
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-
TCGCACTGGAT
ACGACAACAAC
-3'
；
U6
的
RM
物为
5'
-
ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC
-
3'
。
逆
转录产物贮存于
-22
C
o
1.5.2
实时定量
PCR
22
p
i
反应体系
：
5
DNA2
p
i
,
上下游引物
（
2
pmol/P
）
各
2-
2
pi,
2
x
plus
SYBR
nai-
timv
mixtura
16
pi
,
dhH
2
O6.
2
p
i
,
ROX
I
5.
2
p
i
。反
J
SUaupi
Med
Univ
,
Jan.
2021
,
VS
52
No
-
应条件
StayeS
：
95
C
66
s
；
Staye2
：
94
C
22
s,66
C
22
o
,
72
C
35
s,
共
42
个循环
；
Step2
：
95
C
15
s,66
C
60
s
,
95
C
15
s,
66
C
15
o
。
miR-S-Sy
引
物
F
：
5'-
CGCGCGTGGAAGACTAGTGATTTT
-
3',
R
：
5,
-
AGT-
GCAGGGTCCGAGGTATT
-3,U6
弓
|
物
F
：
5
，
-
CTCGCTTCGGCAGCACATATACT
-3',
R
：
5'
-
ACGCT-
TCACGAATTTGCGTGTC
-2
,
0
miR-S
相对表达量是
以
U6
suRNA
基因为内参
，
通过
2
-w
方法获得
。
1,
5
Westers
blat
法检测
RELA
蛋白
用
RCA
裂解液裂解细胞,
BCA
法蛋白定量
，
进
行
SDS-LAGE
蛋白质电泳
，
浓缩胶浓度
5%,
分离胶
浓度
7%
,
电转移法将蛋白转移到
PVDF
膜,放入封
闭液里封闭
。
按说明书比例配好一抗后
，
把膜放在
自封袋中
,
4
C
摇床过夜
，
用
TBST
漂洗滤膜
3
次
，
每
次
5
md
。
将膜放入二抗溶液中
，
室温摇床缓慢摇动
1
U
o
膜用
TBST
漂洗
3
次
，
每次
5
mix
。
ECL
显色
。
以
GAPDH
为内参
，
目的蛋白相对含量是以目的条
带的光密度值与各自内参的光密度值之比值表示
。
各抗体的工作浓度如下
：
HRP-conjupated
Affinipun
Goat
Anti-Moasa
IgG
1
:
2
005
、
HRP-conjupated
AfC
niqura
Goat
Anti-Radbit
IgG
1
:
2
005
、
RELA
抗体
（
兔
抗
）
15
005,
GAPDH
抗体
（
鼠抗
）
1
：
3
005
。
1-
2
流式细胞仪检测细胞凋亡
收集转染后
48
h
细胞进行凋亡检测
。
细胞用
不含
EDTA
的胰酶消化收集
，
用
PBS
洗涤细胞二
次
，
离心收集细胞
。
在
52
p
i
的
Bindinp
Buffvr
中加
入
5
p
i
7
-
AAD
染液
，
混匀收集细胞中加入上述
7
-AAD
染液,混匀;室温
、
避光
、
反应
5-15miu
。
反
应后再加入
450
pi
的
Bindinp
Buffvr
混匀
，
加入
1
pl
Annexin
V
-PE
混匀
，
室温
、
避光
、
反应
7
mix
；
U
内
上机检测凋亡细胞
。
3
7
数据处理和统计分析
实验数据用
斤
+
s
表示
。
采用
SPSS
19.
2
统计软
件
,
多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较
采用
LSD-1
检验分析
，
以
P
<5.
05
为差异有统计学
意义
。
2
结果
2.
2
H
感染对
GESO
细胞
miR-S
及
RELA
表达的
影响
2.
1.
2
Ho
感染对
GESO
细胞
miR-S
表达的影响
山西医科大学学报
,
2021
年
、
月
，
第
52
卷第
、
期
结果显示
，
、
：
54
组和
9
94
组与空白对照组比较
miRO
表达增加
,
差异有统计学意义
（
P<4.
45,
见图
1
）
o
与空白对照组比较
,24
h
组和
48
h
组
miRO
表
达显著增加
,
差异有统计学意义
（
P<4.
25
,
见图
2
）
o
说明
Ho
感染与
miRO
表达存在时间
、
量效关系,
H
感染确实影响了
miRO
表达
。
0
J—
—
-------------------------------------------------
空白组
1：
50
组
1
：
100
组
与空白对照组比较
，
护
<2.
25
；
与
、
：
52
组比较,
#P<2. 25
图
、
Hp
感染量对
GESN
细胞
miRO
表达的影响
Figure
1
E
—
ect
of
Hp
infection
amount
on
tie
expression
of
miRO
in
GES-1
cells
*
«
«
fc
吳
卜
出
卫
与空白对照组比较
,
护
<2.
25
；
与
24
h
组比较
,
#P<2. 25
图
2
Ho
感染时间对
GESN
细胞
miRO
表达的影响
Figure
2
E
—
ect
of
Hp
infection
time
on
tie
expression
of
miRO
in
GESN
cells
2.
9
2
Ho
感染对
GESN
细胞
RELA
表达的影响
结果显示与空白对照组比较
,
感染组
RELA
蛋白表
达下降
，
其中
1
:
124
组差异有统计学意义
（
P<
4.
45,
见表
1,
图
3
）
o
2.
2
过表达
miRO
对
GESN
细胞增殖
、凋亡及
RE
LA
表达的影响
2.
2.
1
瞬时转染
GESN
细胞构建
miRO
过表达细
胞模型
mimics
组细胞中
miRO
表达量显著高于空
白对照组和
NC
组
,
差异有统计学意义
（P
V
4.
45
,
见
表
2
）
,
而
NC
组与空白对照组无显著差异
，
说明
miRO
过表达细胞模型构建成功
。
・
59
・
表
1
Hp
感染对
GES-1
细胞
RELA
表达的影响
（
元
土
pc
二
3
）
Table
1
Effect
of
Hp
infection
on
the
expression
of
RELA
in
GES-1
cells
（
无土
pc
二
3
）
组别
细胞
：
细菌
RELA/GAPDH
光密度比值
空白对照组
1
：
2.
974
±2.
122
、
：
52
组
9
52
2.
807
±2.
062
1
：
102
组
9
12
2.
666
±2.
061
*
与空白对照组比较
,
P
<
2.
25
RELA
■■A
■■■*
gapdh
空白组
l：
50
组
l
：
100
组
图
3
不同感染组
RELA
表达情况
Figure
3
Expression
of
RELA
in
diRe/nt
groups
aUer
in-
fecteP
by
Hp
表
2
miR-1
mimics
转染
GES-1
细胞后
miR-7
表达
（
无
土
p
c
二
3
）
Table
2
Expression
of
miR-7
in
GES-1
cells
trrnsfected
with
miR-7
mimics
（
（
±5,2
=3
）
组别
miRO
相对表达量
空白对照组
9
200
±2.
025
NC
组
3.
622
±2.
042
mimics
组
225.
312
±5.
12
、
*
#
与空白对照组比较
,*P<2.
25
；
与
NC
组比较
,
#
P<2.
25
2.
2.
2
过表达
miRO
对
GESN
细胞增殖的影响
与空白对照组和
NC
组对比
，
mimics
组细胞增殖能
力下降
，
差异有统计学意义
（
P<4.
25,
表
3
）
,
而
NC
组与空白对照组差异无统计学意义
，
说明
miRO
抑
制细胞的增殖
。
表
3
过表达
miR-7
对
GES-1
细胞增殖的影响
（
±
）
2
二
6
）
Table
3
Effect
of
overexpression
of
miR-7
on
the
prrliferr-
tion
of
GES-1
ceds
（
（
±5,2
=6
）
组别
相对细胞增殖能力
空白对照组
9
200
±2.
229
NC
组
2.
964
±2.
210
mimics
组
2.
970
±2.29
*
#
与空白对照组比较
2
P<2.
25
；
与
NC
组比较
,
#
P<2.
25
2.
2.
3
过表达
miRO
对
GESN
细胞凋亡的影响
与空白对照组和
NC
组对比
，
mimics
组细胞凋亡率
上升
,
差异有统计学意义
（
P<4.
45
）
,
而
NC
组与空
白对照组比较差异无统计学意义
（
见图
4
、
表
4
）
,
表
明
miRO
促进细胞的凋亡
。
・
60
・
J
Shanxi
Med
Unia
,
Jan.
2021
,
Vol
52
No
1
4
0
I
d
1
X
I
d
CN
w
CN
w
r
、
罅;
:
1
X
0°
1
1
FL1-FITC
A.
空白对照组
n
2
)
1
±
04
FL1-FITCFL1-FITC
组
组
图
4
过表达
miR-S
对
GESD
细胞凋亡的影响
Figure
4
EEect
of
oveaxpassion
of
miR-S
on
tfv
apoptosis
of
GES-1
celts
表
4
过表达
miR-7
对
GES-1
细胞凋亡的影响
(
土
s,a
二
3)
Table
4
Effect
of
overexpression
of
miR-7
on
the
apoptosie
of
GES-1
cells
((±5,4
=3
)
现出时效
、
量效关系
，
并且
miR-S
靶基因
NF-
s
B
成
员
RELA
表达下调
，
说明幽门螺杆菌通过影响
miR-
7
分子表达调控
NF-
s
B
通路
。
转染实验进一步证
组别
细胞凋亡率
（％
）
2.
870
±1.
16
空白对照组
NC
组
明:
Hy
通过调控
miR-S
分子
，
抑制其靶基因
RELA
4.
933
±2.019
16.21
±0.
175
*
#
的表达
，
改变
NF-
s
B
通路活性
，
对细胞的增殖凋亡
发挥调控作用
。
这一调控通路与
Zhav
等
［
4
］
的报道
mimics
组
与空白对照组比较
,*
P<0.
05
；
与
NC
组比较
,
#
P<0.
05
一致,同时他们指出
NF-
s
B
通路的下游效应分子正
2.
2.
4
过表达
miR-S
对
GESD
细胞
RELA
表达的
是与细胞增殖有关的
c-Myc,Cychn
D
和
Bcl-S
家族
蛋白,通过该条通路影响了细胞增殖和凋亡速率
，
使
疾病向癌变方向发展
。
对于幽门螺杆感染是促细胞增殖还是凋亡
，
存
影响
mimics
组细胞中
RELA
蛋白表达量低于空白
对照组和
NC
组
,
差异有统计学意义
（
P<0.
05
）
,
而
空白对照组和
NC
组比较无显著差异
（
见表
5
,
图
5
）
,
说明
miR-S
下调
RELA
的表达
。
表
5
过表达
miR-7
对
GES-1
细胞
RELA
表达的影响
（
土
s,a
二
3
）
Table
5
Effect
of
ovvrexpression
of
miR-7
on
the
expres
sion
of
RELA
R
GES-1
celSs
((
±5,4
=3
)
在矛盾的报道
。
Zhav
等
［
2
］
的实验显示
Hp
感染导
致
miR-S
下调
，
促进了细胞的增殖
；
相反
，
Targoss
等⑸的实验证明幽门螺杆菌感染诱导了细胞凋亡,
我们前期的实验支持这一观点6
7
］
。
造成实验结果
组别
RELA/GAPDH
光密度比值
1.059
±0.
165
1.076
±0.
081
0.
81±0.
092
*
#
不一致
,
可能有如下几方面原因:
①
实验对象方面
,
有的研究是以活体为研究对象
2
⑴
，
而体内影响因
素众多
，
除细菌因素外还有机体免疫炎症反应的复
空白对照组
NC
组
mimics
组
杂影响
，
可因炎症反应下调
miR-S
表达
。
②
细菌菌
株方面
,miRNA
的表达变化与
Hp
的菌株毒力有关
。
与空白对照组比较
,
P
<0.
05
；
与
NC
组比较
,
#
P<0.
05
据报道
，
具有
Ca/A
+
的菌株可引导
miRb84
、
197
过
rela
表达
，而
Ca/A
-
的菌株则不能
［
2
］
。
③
疾病发展阶
GAPDH
段
，
有的实验关注肿瘤阶段
，
认为
miR-S
下降与肿瘤
的增殖
、
侵袭
、
迁移相关
：
2
^
1
^
13
］，
而有的实验则关注
空白对照组
NC
组
mimics
组
图
5
不同转染组
RELA
蛋白的表达
Figure
5
Expression
of
RELA
in
diReant
transfection
groups
由慢性炎症向胃癌转变阶段
［
6
9
1
］
，
对
miR-S
在早期
单纯因细菌感染引发凋亡的作用不明确
。
在我们的
实验中
，
选用正常胃黏膜细胞
GESD
为研究对象,
Hp
菌株为
VacA
+
、
Ca/A
+
菌株
,
观察感染早期
Hp
对
miR-S
表达
、
NF-
s
B
信号通路活性以及细胞凋亡的
3
讨论
感染细胞的
miR-S
与细菌感染量及感染时间呈
影响
，
希望为揭示细菌感染早期致病机制提供见解
。
山西医科大学学报
，
2021
年
-
月
，
第
52
卷第
（
期
从幽门螺杆菌感染引发胃黏膜上皮细胞变性
，
到慢性炎症向胃癌转变过程中
,
miR-S
起到了怎样
的作用
？
其表达在整个过程中的变化规律是怎样
的？
是否会由高向低转化
？
还有哪些靶基因或通路
参与了
miR-S
相关的调控
？
这漫长疾病发生发展过
程
,
应该是个复杂的多分子多通路参与的过程
,
这些
问题都有待今后研究揭示
。
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COX
)-2
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ix-
-
61
-
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heat
shoch
protein
HSP77
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gastric
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,61
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953
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姜成
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上皮细胞
GESO
生长的影响
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姜成
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刘芬
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GESO
细胞凋亡及
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表达的影响
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1-metUylP-pUepylpyPddmm-dhpceP
cell
death
bp
tarjeting
RE-
LA[J].
J
NepnwR25
7,34(32
)
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12725
-12737.
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Guo
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signa/ng
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yastoc
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Cel
l
BdL2515,27(4
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朴英•炎症下调的
mid-9
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Farzam
V
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Samira
T
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Abolfazl
F
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pylos
host-sathogex
interactioss
:
The
triangle
of
vijleuce
fac
tors
,
epiyepe/c
moSificatioss
and
dos-coSing
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J]
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World
J
Clin
Cases
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增
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57
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522.
2024年4月22日发(作者：谷梁飞光)
・
56
・
J
Shanxi
Meh
Univ
,
Jan.
2021
,
VW
52
No
-
幽门螺杆菌上调
miR
・
7
致胃上皮细胞
GES-1
凋亡
鄢春锦
，
刘
芬
，
严晓丹
，
姜
成
*
（
福建中医药大学中西医结合学院病原生物学教研室
，
福州
370169
；
通讯作者,
：
jcS93666@
sina.
im
）
摘要
：
目的
探讨
miR-S
对幽门螺杆菌感染胃上皮细胞凋亡的影响
。
方法
以呦感染
GESD
细胞
，
感染
24h
的细胞分
为
-
：
50
（
细胞
：
细菌）
组和
1
：
10
组;当感染比率为
1
：
10
（
细胞:细菌
）
时
，
按感染时间分为
24
h
组和
48
h
组
，同时设未感染细
胞为空白对照组
，
观察不同感染菌量和感染时间对
GESD
细胞
miR-S
和
RELA
表达的影响
。
以
miRSDp
类似物转染
GESD
细胞设为
miR-S
mimms
组,
mb
-
阴性序列转染
GES-1
为阴性对照组
（
NC
组
）
，
未转染细胞作为空白对照组
，观察各组细胞增
殖凋亡及
RELA
蛋白表达情况
。
实时定量
PCR
法检测
miR-S
表达量
,CCKD
法检测细胞增殖能力
，流式细胞仪检测细胞凋亡
率,
Western
blot
检测
RELA
蛋白表达量
。
结果
与空白对照相比较
，
感染
24
h
时
-
：
54
组及
-
：
10
组的
miR-S
表达量上调
，
差异有统计学意义
（
P<2.25
）
。当感染率
1
：
10
时
，
与空白对照组比较
，
感染
24
h
组和
48
h
组
miR-S
表达量均显著上调
（
P<
0.
05
）
,48
h
组
RELA
蛋白显著下降
（
P<0.
05
）
,
但
24
h
组差异无统计学意义
。
转染实验中发现
，
与空白对照组和
NC
组相比
较,
mimics
组细胞增殖能力明显下降
（
P<0.
05
）
,
细胞凋亡率明显增加
（
P<0.
05
）
,
RELA
蛋白表达显著降低
（
P<0.
05
）
o
结
论
Hp
通过上调感染细胞的
miR-S
分子调控其靶基因
RELA
的表达
，
抑制细胞增殖,促进细胞凋亡
，
这可能是呦导致胃上皮
细胞损伤致病的机制之一
。
关键词
：
幽门螺杆菌
；
胃上皮细胞
GESD
；
凋亡
；
miR-S
；
RELA
中图分类号
：
R473
文献标志码
：
A
文章编号
：
107
-6611
（
2021
）
01
-0052
-06
DOI
：
10.13753/L
Rwo
107
-6611.2021.01.
01
Helicobacter
pylori
inducre
apoptosis
of
gastric
eqitheliae
cells
GES-1
by
uprequlating
miR-1
eepression
YAN
Chunjin,
LIN
Fen,
YAN
XiaoUan
,
JINNG
Cheng*
(
Department
of
Pathogenic
Biology
,
College
nf
Inteprated
TraUitional
Chinese
and
Westera
Medician
,
Fujiaa
University
of
TraUitionai
Chiaese
Mepiciac
,
Fuzhon
350122
,
China
；
*
Correseonaina
authna,
：
jcl23666@
sina.
com)
AbstrecC
:
Objectiee
To
investi/te
the
ebect
of
miR-S
on
apopmsis
of
gasWic
epithe/al
cells
GES-1
infected
by
Hp.
Methofs
GES-1
cells
were
divided
into
-
:
50
garp
and
-
:
10
grorp
according
to
the
ratio
of
cell
and
bacte/a
when
infected
with
Hp
for
24
h
,
and
GES-1
cells
were
divided
into
24
h
garp
and
48
h
garp
according
to
the
infection
time
when
the
ceimbacte/a
ratio
of
-
:
10
,
and
the
uninfected
cells
were
chosen
as
control
garp.
GES-1
cells
was
tansfected
with
miR-S-5p
mimics
in
mimics
garp
and
miR-segative
sequences
in
NC
garp,anh
GES-1
cells
without
Weatwent
were
chosen
as
control
garp.
The
cell
proliferation
was
tested
by CCK-C
,
the
apopmsis
rate
was
evaluated
by
5ow
cytometa
,
the
amount
of
miR-S
of
cells
was
hetected
by
real-time
quantitative
PCR
,
and
RELA
protein
was
measured
by
Western
blot.
Resulis
Compared
with
control
garp,the
expression
of
miR-S
was
significanSy
uprequmted
in
-
：
50
garp
,1
：
140
garp
after
infected
with
Hp
for
24
h(
P
<
0.
05
)
.
Compared
with
control
garp
,the
expression
of
miR-S
was
sig-
nihcantly
uprequmted
in
24
h
grorp
and
48
h
garp
at
the
ratio
of
cell
and
bacte/a
of
-
：
140(
P<0.
05)
,
and
the
amount
of
RELA
pro
min
was
reduced
significanSy
in
48
h
garp(
P
<
0.
05
).
Compared
with
control
grorp
and
NC
garp
,
the
cell
proliferation
was
signifi
cantly
decreased
in
mimics
garp
,
the
cell
apopmsis
was
significantly
increased
,
and
the
level
of
RELA
protein
was
decreased
signifi
cantly
(
all
P<0.
05).
Conclusion
Hp
downrequmtes
the
expression
of
miR-S
target
gene
RELA
contributing
to
cell
apopmsis
tharah
uprequmting
miR-S
in
infected
cebs,which
is
one
of
the
mechanisms
of
gastric
epithebal
cell
damaye
induced
by
Hp
.
Keq
words
：
HePcobacOs
p-ylort
；
gastric
epithe/al
cell
line
GES-1
；
apopmsis
；
microRNA-S；
RELA
micaRNA
（
miRNA
）
是一类非编码小分子
RNA
,
H0
后胃黏膜的多种
miRNA
表达水平发生改变
,影
长约
22
bp,
具有在转录后水平调控基因表达的功
能
。
研究表明
，
感染幽门螺杆菌
（
HePcoOacter
pylort
；
基金项目
：
福建省自然科学基金资助项目
（
2018
J01878
-
响了胃上皮细胞增殖
、
凋亡
、
炎性反应
、
癌基因或抑
癌基因的表达
,
参与消化道疾病的发生和发展
［
］
。
作者简介
：
鄢春锦
，
男
，1979
-09
生
，
硕士
，
实验师,
:
845092547@
qq.
com
收稿日期
：
2022
-1
-1
山西医科大学学报
，
2021
年
-
月
，
第
52
卷第
（
期
miR-S
是一类较为保守的
miRNA,2001
年被发现
，
位于第
9
号染色体
，
有
miR-S
-1
、
miR-S
-2
、
miR-SO
三
种不同的
DNA
序列
，
但其成熟序列相同
。
据报道
miR-S
在多种肿瘤中表达下降
，
如
MALT
淋巴瘤
、
胃
癌
、
宫颈癌
、
结直肠癌
、
乳腺癌等宀
2
,
具有抑增殖促
凋亡的作用
。
人们早先观察到
Ho
感染可致胃上皮细胞凋
亡
[]
,
本课题组前期研究工作同样表明
，
幽门螺杆
菌感染可抑制正常胃上皮细胞
GESO
的生长⑷
，
并
导致细胞凋亡
[]
,
前期研究也发现细胞细菌比
1
：
52
与
1
：
105
这两种浓度和
24
h
与
42
U
这两种感染时
间对细胞的增殖凋亡影响显著
，
适合用于在后续实
验中对其凋亡机制做进一步探讨
。
在
Hi
致细胞凋亡过程中
，
具有抑增殖促凋亡
作用的
miR-S
是否起了作用
？
如果确实有
，
那么
miR-S
是如何起作用的
，
其靶基因可能是什么
？
根据生物学信息软件
Tajethcgd
、
miRBase
和相
关文献报道
J]
,NF-pB
成员
RELA
是
miR-S
的靶基
因
,
miR-S
可通过抑制
RELA
表达改变
NF-pB
通路
活性
，
抑制下游分子包括与细胞增殖凋亡有关分子
如
Bcl-S
家族蛋白表达
，
从而影响细胞的增殖凋亡
。
为此我们假设
：
幽门螺杆菌通过调控
miR-S
水
平改变靶基因
RELA
的表达
，
导致感染细胞凋亡
。
为了验证这一假设
，
我们进行了以下实验
。
1
材料与方法
1.2
材料
人胃黏膜上皮细胞
GESO
购自中国医学科学
院肿瘤所
；
幽门螺杆菌标准菌株
NCTC11627
,
来源
于福建医科大学病原生物学系
；
DMEM
基础培养
基
、
青霉素一链霉素混合液购自美国
Hy/ona
公司
；
胎牛血清
、
含
EDTA
胰蛋白酶
、
OptWMEM
®
I
Rv-
dpceP
Sejm
Medium
购自美国
Gibca
公司
；
布氏培
养基和抗生素混合液
（
TMP
、
万古霉素
、
多黏菌素
B
）
购自北京陆桥技术公司
;
CCK-5
增强型溶液购自大
连美仑生物公司
；
RNAmisi
mpjRNA
快速提取试剂
盒购自北京艾德莱生物公司
;
NovScUpt
®
Plus
AllLu-
ona
1st
Strand
cDNA
Syathesis
SuperMio
（
gDNA
Pur/v
）
^NovodtaS
®
SYBR
qPCRSuperMio
Plus
购自上
海近岸蛋白科技公司
；
RIPA
强裂解液
、
PMSF
、
Au
upix
V
PE/7-AAD
双染细胞凋亡检测试剂盒购自
-
57
-
江苏凯基生物公司
;
PhosUTOP™
购自瑞士
Rocha
公
司
；
CochtaimSDS-LAGE
凝胶制备试剂盒购自北京康
为世纪公司
；
PageRuler™
1
Prestained
Protein
Lahdaf
购自美国
Therms
公司
；
BCA
蛋白定量试剂盒
、
SDS-
PAGE
蛋白上样缓冲液
（
5X
）
、
封闭液购自上海碧云
天生物公司
；
PVDF
膜购自美国
MidipOTj
公司
；
ECL
化学发光试剂盒购自苏州宇恒公司
；
HRPpaipupdwi
AfUnipun
Goat
Anti-Mossa
IgG
（
H
+
L
）
HRP-conju-
gated
Affiniqura
Goat
Anti-Radbit
IgG（H
+
L
）
、
RELA
抗体
（
兔抗
）
、
GAPDH
抗体
（
鼠抗
）
购自美国
pnteixi
tech
公司
;
Liqofectamine™
1
3700
Transfec/ox
Reayext
购自美国
Rvitnpep
公司
。
1.2
细菌培养
H
细菌培养在含抗生素混合液的布氏培养基
（
含
5%
脱纤维冻融羊血
），
37
C
饱和湿度烛缸培养
3
U
用接种环刮取培养基上的
Hp
活菌
，
悬于少量
PBS
液中
，
用分光光度计测定其吸光度
A
值
[5]
,
1^66
3
um
为
1
xl^cfu/m
1
。
1-
3
细胞培养
用
1%
双抗
15%
胎牛血清的高糖
DMEM
培养
，
培养环境为
5%CO
2
、
3
7
C
饱和湿度的二氧化碳培
养箱
。
当细胞生长达到
89%
融合时
，
用
0.25%
胰蛋
白酶消化传代
。
1.0
Hp
对
GESO
细胞
miR-S
及
RELA
表达影响的
实验分组
将细胞接种贴壁培养
7
-
按一定比例感染细菌
继续培养
。
细菌感染时换不含抗生素培养基培养
。
分析细菌感染量对细胞
miR-S
表达的影响时
，
感染
时间定为
24
-
感染组分为
1
：
52
组
（
细胞
：
细菌
）
和
1
：
75
组;分析感染时间对细胞
miR-S
表达的影响
时
，
感染率为
1
：
105,
感染时间组分为
24
h
组和
45
U
组
。
在
Ho
感染对细胞
RELA
蛋白表达的影响实验
中
，
感染组分为
1
：
50
组和
1
：
75
组
，
感染
48
-
同
时设未感染细胞为空白对照组
。
1-
5
瞬时转染
GESO
细胞构建
miR-S
过表达细胞
模型
以
miR-SOp
类似物转染
GESO
细胞设为
miR-S
mimics
组,
miR
-
阴性序列转染
GES-1
为阴性对照
组
（
NC
组
）
，
未转染细胞作为空白对照组
。
实验接
种细胞于
6
孔板,融合至
89%-99%
时转染
。
使用
Opti-MEM
培养基稀释
Liqofectamine
®
3700
试剂
，
充
-
53
-
分混匀
。
使用
Opl-MEM
培养基稀释
DNA
,
制备
DNA
预混液
，
然后添加
P3700
tm
试剂
，
充分混匀
。
在
每管已稀释的
Liqofectamine®
3700
试剂中加入稀释
的
DNA
（
1
：
5
比例
）
。
室温孵育
7
-
7
md
。
加入
DNA-
脂质体复合物至细胞中
,37
C
孵育细胞
42
—
miR-S-S-Sp
mimics
序列为
：
5
，
-
UGGAAGAC-
UAGUGAUUUUGUUGUU
-
3
'
,5
'
-
AACAACAAAAU-
CACUAGUCUUCCA-3'
；
miR-NC
序列为
：
5'
-UCA-
CAACCUCCUAGAAAGAGUAGA
-
3
，
,5'
-
UCUACU-
CUUUCUAGGAGGUUGUGA
-
3,
1.
2
细胞增殖能力的测定
采用
CCK-5
法检测细胞增殖情况
。
在
99
孔板
进行细胞培养处理
，
培养
42
U
后加入
7
口
CCK-5
溶液
，
孵育
1-
5
U
o
用酶标仪测定
452
nm
处的吸光
度
A
值
。
细胞增殖相对值
=
实验组
A
值
/
对照组
A
值
X105%
。
1.
5
实时荧光定量
PCR
检测
miR-S
1.5.1
样品总
RNA
提取
样品中加氯仿
，
剧烈振
荡
7
s,
室温放置
3
mix,
7
005
J
mix
离心
7
miu
。
取上清转入到新的离心管
，
加入
1-
5
倍体积的无水
乙醇
，
涡旋混匀
，
得到样品总
RNA
混合物
。
1.5.2
小分子
RNA
纯化及富集
将混合物加入一
个吸附柱
RA
中
，
7
005
Jmix
离心
37
s,
弃掉废液
。
加
Wash
Solutiox
1,7
200
J
mix
离心
35
s,
弃掉废
液
。
将吸附柱
RA
放回空收集管中
,7
005
Jmix
离
心
2
mix
。
加入
Wash
Solutiox
2/P
,
12
005
J
mix
离
心
35
s,
弃掉废液
，
重复
2
遍
。
取出吸附柱
RA,
放入
一个
RNasa
frev
离心管中
，
加
RNasa
frev
watvr
室温
放置
1
mih,12
005
J
mix
离心
1
mix
。
1.7.3
逆转录
cDNA
逆转录反应体系
7
门
：
Gene
SSecifle
Psmvr
（
RT
:
2
pimol/P
）
1
p!
、
HiscSpt
Enzymv
MP
1
p
i
、
Rnase-fje
H
2
O
2
p
i
、
总
RNA
3
p
i
、
2
xRT
Mio
7
p
i
混匀
。
逆转录条件为
52
C
7
mid,
85
C
2
mid,
4
C
保存
；
其中
miR-SOp
的
RT
引
物为
5'
-
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-
TCGCACTGGAT
ACGACAACAAC
-3'
；
U6
的
RM
物为
5'
-
ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC
-
3'
。
逆
转录产物贮存于
-22
C
o
1.5.2
实时定量
PCR
22
p
i
反应体系
：
5
DNA2
p
i
,
上下游引物
（
2
pmol/P
）
各
2-
2
pi,
2
x
plus
SYBR
nai-
timv
mixtura
16
pi
,
dhH
2
O6.
2
p
i
,
ROX
I
5.
2
p
i
。反
J
SUaupi
Med
Univ
,
Jan.
2021
,
VS
52
No
-
应条件
StayeS
：
95
C
66
s
；
Staye2
：
94
C
22
s,66
C
22
o
,
72
C
35
s,
共
42
个循环
；
Step2
：
95
C
15
s,66
C
60
s
,
95
C
15
s,
66
C
15
o
。
miR-S-Sy
引
物
F
：
5'-
CGCGCGTGGAAGACTAGTGATTTT
-
3',
R
：
5,
-
AGT-
GCAGGGTCCGAGGTATT
-3,U6
弓
|
物
F
：
5
，
-
CTCGCTTCGGCAGCACATATACT
-3',
R
：
5'
-
ACGCT-
TCACGAATTTGCGTGTC
-2
,
0
miR-S
相对表达量是
以
U6
suRNA
基因为内参
，
通过
2
-w
方法获得
。
1,
5
Westers
blat
法检测
RELA
蛋白
用
RCA
裂解液裂解细胞,
BCA
法蛋白定量
，
进
行
SDS-LAGE
蛋白质电泳
，
浓缩胶浓度
5%,
分离胶
浓度
7%
,
电转移法将蛋白转移到
PVDF
膜,放入封
闭液里封闭
。
按说明书比例配好一抗后
，
把膜放在
自封袋中
,
4
C
摇床过夜
，
用
TBST
漂洗滤膜
3
次
，
每
次
5
md
。
将膜放入二抗溶液中
，
室温摇床缓慢摇动
1
U
o
膜用
TBST
漂洗
3
次
，
每次
5
mix
。
ECL
显色
。
以
GAPDH
为内参
，
目的蛋白相对含量是以目的条
带的光密度值与各自内参的光密度值之比值表示
。
各抗体的工作浓度如下
：
HRP-conjupated
Affinipun
Goat
Anti-Moasa
IgG
1
:
2
005
、
HRP-conjupated
AfC
niqura
Goat
Anti-Radbit
IgG
1
:
2
005
、
RELA
抗体
（
兔
抗
）
15
005,
GAPDH
抗体
（
鼠抗
）
1
：
3
005
。
1-
2
流式细胞仪检测细胞凋亡
收集转染后
48
h
细胞进行凋亡检测
。
细胞用
不含
EDTA
的胰酶消化收集
，
用
PBS
洗涤细胞二
次
，
离心收集细胞
。
在
52
p
i
的
Bindinp
Buffvr
中加
入
5
p
i
7
-
AAD
染液
，
混匀收集细胞中加入上述
7
-AAD
染液,混匀;室温
、
避光
、
反应
5-15miu
。
反
应后再加入
450
pi
的
Bindinp
Buffvr
混匀
，
加入
1
pl
Annexin
V
-PE
混匀
，
室温
、
避光
、
反应
7
mix
；
U
内
上机检测凋亡细胞
。
3
7
数据处理和统计分析
实验数据用
斤
+
s
表示
。
采用
SPSS
19.
2
统计软
件
,
多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较
采用
LSD-1
检验分析
，
以
P
<5.
05
为差异有统计学
意义
。
2
结果
2.
2
H
感染对
GESO
细胞
miR-S
及
RELA
表达的
影响
2.
1.
2
Ho
感染对
GESO
细胞
miR-S
表达的影响
山西医科大学学报
,
2021
年
、
月
，
第
52
卷第
、
期
结果显示
，
、
：
54
组和
9
94
组与空白对照组比较
miRO
表达增加
,
差异有统计学意义
（
P<4.
45,
见图
1
）
o
与空白对照组比较
,24
h
组和
48
h
组
miRO
表
达显著增加
,
差异有统计学意义
（
P<4.
25
,
见图
2
）
o
说明
Ho
感染与
miRO
表达存在时间
、
量效关系,
H
感染确实影响了
miRO
表达
。
0
J—
—
-------------------------------------------------
空白组
1：
50
组
1
：
100
组
与空白对照组比较
，
护
<2.
25
；
与
、
：
52
组比较,
#P<2. 25
图
、
Hp
感染量对
GESN
细胞
miRO
表达的影响
Figure
1
E
—
ect
of
Hp
infection
amount
on
tie
expression
of
miRO
in
GES-1
cells
*
«
«
fc
吳
卜
出
卫
与空白对照组比较
,
护
<2.
25
；
与
24
h
组比较
,
#P<2. 25
图
2
Ho
感染时间对
GESN
细胞
miRO
表达的影响
Figure
2
E
—
ect
of
Hp
infection
time
on
tie
expression
of
miRO
in
GESN
cells
2.
9
2
Ho
感染对
GESN
细胞
RELA
表达的影响
结果显示与空白对照组比较
,
感染组
RELA
蛋白表
达下降
，
其中
1
:
124
组差异有统计学意义
（
P<
4.
45,
见表
1,
图
3
）
o
2.
2
过表达
miRO
对
GESN
细胞增殖
、凋亡及
RE
LA
表达的影响
2.
2.
1
瞬时转染
GESN
细胞构建
miRO
过表达细
胞模型
mimics
组细胞中
miRO
表达量显著高于空
白对照组和
NC
组
,
差异有统计学意义
（P
V
4.
45
,
见
表
2
）
,
而
NC
组与空白对照组无显著差异
，
说明
miRO
过表达细胞模型构建成功
。
・
59
・
表
1
Hp
感染对
GES-1
细胞
RELA
表达的影响
（
元
土
pc
二
3
）
Table
1
Effect
of
Hp
infection
on
the
expression
of
RELA
in
GES-1
cells
（
无土
pc
二
3
）
组别
细胞
：
细菌
RELA/GAPDH
光密度比值
空白对照组
1
：
2.
974
±2.
122
、
：
52
组
9
52
2.
807
±2.
062
1
：
102
组
9
12
2.
666
±2.
061
*
与空白对照组比较
,
P
<
2.
25
RELA
■■A
■■■*
gapdh
空白组
l：
50
组
l
：
100
组
图
3
不同感染组
RELA
表达情况
Figure
3
Expression
of
RELA
in
diRe/nt
groups
aUer
in-
fecteP
by
Hp
表
2
miR-1
mimics
转染
GES-1
细胞后
miR-7
表达
（
无
土
p
c
二
3
）
Table
2
Expression
of
miR-7
in
GES-1
cells
trrnsfected
with
miR-7
mimics
（
（
±5,2
=3
）
组别
miRO
相对表达量
空白对照组
9
200
±2.
025
NC
组
3.
622
±2.
042
mimics
组
225.
312
±5.
12
、
*
#
与空白对照组比较
,*P<2.
25
；
与
NC
组比较
,
#
P<2.
25
2.
2.
2
过表达
miRO
对
GESN
细胞增殖的影响
与空白对照组和
NC
组对比
，
mimics
组细胞增殖能
力下降
，
差异有统计学意义
（
P<4.
25,
表
3
）
,
而
NC
组与空白对照组差异无统计学意义
，
说明
miRO
抑
制细胞的增殖
。
表
3
过表达
miR-7
对
GES-1
细胞增殖的影响
（
±
）
2
二
6
）
Table
3
Effect
of
overexpression
of
miR-7
on
the
prrliferr-
tion
of
GES-1
ceds
（
（
±5,2
=6
）
组别
相对细胞增殖能力
空白对照组
9
200
±2.
229
NC
组
2.
964
±2.
210
mimics
组
2.
970
±2.29
*
#
与空白对照组比较
2
P<2.
25
；
与
NC
组比较
,
#
P<2.
25
2.
2.
3
过表达
miRO
对
GESN
细胞凋亡的影响
与空白对照组和
NC
组对比
，
mimics
组细胞凋亡率
上升
,
差异有统计学意义
（
P<4.
45
）
,
而
NC
组与空
白对照组比较差异无统计学意义
（
见图
4
、
表
4
）
,
表
明
miRO
促进细胞的凋亡
。
・
60
・
J
Shanxi
Med
Unia
,
Jan.
2021
,
Vol
52
No
1
4
0
I
d
1
X
I
d
CN
w
CN
w
r
、
罅;
:
1
X
0°
1
1
FL1-FITC
A.
空白对照组
n
2
)
1
±
04
FL1-FITCFL1-FITC
组
组
图
4
过表达
miR-S
对
GESD
细胞凋亡的影响
Figure
4
EEect
of
oveaxpassion
of
miR-S
on
tfv
apoptosis
of
GES-1
celts
表
4
过表达
miR-7
对
GES-1
细胞凋亡的影响
(
土
s,a
二
3)
Table
4
Effect
of
overexpression
of
miR-7
on
the
apoptosie
of
GES-1
cells
((±5,4
=3
)
现出时效
、
量效关系
，
并且
miR-S
靶基因
NF-
s
B
成
员
RELA
表达下调
，
说明幽门螺杆菌通过影响
miR-
7
分子表达调控
NF-
s
B
通路
。
转染实验进一步证
组别
细胞凋亡率
（％
）
2.
870
±1.
16
空白对照组
NC
组
明:
Hy
通过调控
miR-S
分子
，
抑制其靶基因
RELA
4.
933
±2.019
16.21
±0.
175
*
#
的表达
，
改变
NF-
s
B
通路活性
，
对细胞的增殖凋亡
发挥调控作用
。
这一调控通路与
Zhav
等
［
4
］
的报道
mimics
组
与空白对照组比较
,*
P<0.
05
；
与
NC
组比较
,
#
P<0.
05
一致,同时他们指出
NF-
s
B
通路的下游效应分子正
2.
2.
4
过表达
miR-S
对
GESD
细胞
RELA
表达的
是与细胞增殖有关的
c-Myc,Cychn
D
和
Bcl-S
家族
蛋白,通过该条通路影响了细胞增殖和凋亡速率
，
使
疾病向癌变方向发展
。
对于幽门螺杆感染是促细胞增殖还是凋亡
，
存
影响
mimics
组细胞中
RELA
蛋白表达量低于空白
对照组和
NC
组
,
差异有统计学意义
（
P<0.
05
）
,
而
空白对照组和
NC
组比较无显著差异
（
见表
5
,
图
5
）
,
说明
miR-S
下调
RELA
的表达
。
表
5
过表达
miR-7
对
GES-1
细胞
RELA
表达的影响
（
土
s,a
二
3
）
Table
5
Effect
of
ovvrexpression
of
miR-7
on
the
expres
sion
of
RELA
R
GES-1
celSs
((
±5,4
=3
)
在矛盾的报道
。
Zhav
等
［
2
］
的实验显示
Hp
感染导
致
miR-S
下调
，
促进了细胞的增殖
；
相反
，
Targoss
等⑸的实验证明幽门螺杆菌感染诱导了细胞凋亡,
我们前期的实验支持这一观点6
7
］
。
造成实验结果
组别
RELA/GAPDH
光密度比值
1.059
±0.
165
1.076
±0.
081
0.
81±0.
092
*
#
不一致
,
可能有如下几方面原因:
①
实验对象方面
,
有的研究是以活体为研究对象
2
⑴
，
而体内影响因
素众多
，
除细菌因素外还有机体免疫炎症反应的复
空白对照组
NC
组
mimics
组
杂影响
，
可因炎症反应下调
miR-S
表达
。
②
细菌菌
株方面
,miRNA
的表达变化与
Hp
的菌株毒力有关
。
与空白对照组比较
,
P
<0.
05
；
与
NC
组比较
,
#
P<0.
05
据报道
，
具有
Ca/A
+
的菌株可引导
miRb84
、
197
过
rela
表达
，而
Ca/A
-
的菌株则不能
［
2
］
。
③
疾病发展阶
GAPDH
段
，
有的实验关注肿瘤阶段
，
认为
miR-S
下降与肿瘤
的增殖
、
侵袭
、
迁移相关
：
2
^
1
^
13
］，
而有的实验则关注
空白对照组
NC
组
mimics
组
图
5
不同转染组
RELA
蛋白的表达
Figure
5
Expression
of
RELA
in
diReant
transfection
groups
由慢性炎症向胃癌转变阶段
［
6
9
1
］
，
对
miR-S
在早期
单纯因细菌感染引发凋亡的作用不明确
。
在我们的
实验中
，
选用正常胃黏膜细胞
GESD
为研究对象,
Hp
菌株为
VacA
+
、
Ca/A
+
菌株
,
观察感染早期
Hp
对
miR-S
表达
、
NF-
s
B
信号通路活性以及细胞凋亡的
3
讨论
感染细胞的
miR-S
与细菌感染量及感染时间呈
影响
，
希望为揭示细菌感染早期致病机制提供见解
。
山西医科大学学报
，
2021
年
-
月
，
第
52
卷第
（
期
从幽门螺杆菌感染引发胃黏膜上皮细胞变性
，
到慢性炎症向胃癌转变过程中
,
miR-S
起到了怎样
的作用
？
其表达在整个过程中的变化规律是怎样
的？
是否会由高向低转化
？
还有哪些靶基因或通路
参与了
miR-S
相关的调控
？
这漫长疾病发生发展过
程
,
应该是个复杂的多分子多通路参与的过程
,
这些
问题都有待今后研究揭示
。
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V
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Samira
T
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Abolfazl
F
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U
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of
Ue/codacWr
pylos
host-sathogex
interactioss
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The
triangle
of
vijleuce
fac
tors
,
epiyepe/c
moSificatioss
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增
殖
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