2024年4月24日发(作者：郁承载)

・

48

・

安徽医科大学学报

Acto

UnwersPatis

Medicinalis

An,aut

2201

Jap

；

56(

1

)

网络出版时间

：

2222

-10

-12

12

：

12

网络出版地址

：

htt

p

s

:

//Pos

.

c/hi.

oet/kcms/detail/34.

1255.

R.

22221211.

1421.022.

htmi

外源性

Apelin13

通过调控

VEGF/PI3K/Akt

信号通路促进大鼠股骨骨折愈合

曾昭池

，

汤

勇

，

张先慧,朱志勇

，

吴开元,袁永端

摘要

目的

探讨

ApePuA3

调控

VEGF/PNKAkt

信号通

PI3

K

p85

、

p-Akt

等蛋白表达水平降低

，

差异有统计学意义(

P

<7.75

)

。

与

MoPci

组比较

，

ApeXuA3

H

组大鼠股骨病理损

路对大鼠股骨骨折愈合的影响

。

方法

将

44

只雄性

SD

大

鼠随机分成假手术组

(

Wnm

组

、

、

模型组

(

MoPci

组

、

、

ApePu-

13

低剂量组

J

AyeliuA3

L

组

，

25

pyd

(

kg

-

d

)

］

和

Ayeliu-18

伤改善明显

，

股骨骨密度

、

组织矿物质密度

、

骨体积分数

、

X

射线评分和骨痂直径均增加

，

血清中

BALP

和

PINP

含量增

加

,TRACPAb

和

CTX

含量减少，

骨痂组织中

VEGFA

mRNA

高剂量组

［ApePuA3

H

组

,75

pg/(kg

-

d

)

］

,

每组

12

只

。建

立大鼠股骨骨折模型

，

立即给予相应药物处理

，

治疗

4

周

。

以及

VEGFA

、

VEGFR0

、

PI3

K

p85

、

p-Akt

蛋白表达水平增加,

差异有统计学意义

(P<2.

25

)

，

而

AyelOA8

L

组与

MoPel

组

采用

Moro

CT

和

X

射线分别检测各组大鼠股骨显微参数和

骨痂直径;苏木精-伊红

(

HE)

染色观察骨组织病理变化;酶

比较,相关指标差异无统计学意义

(

P>7.75

)

。

结论

外源

联免疫吸附测定

(ELISA

、

检测血清中成骨标记物骨源性碱

性磷酸酶

(BALP)

、

I

型前胶原氨基端前肽

(PINP

)

和破骨标

记物抗酒石酸酸性磷酸酶

-5b(TRACPAb)

、

I

型胶原

C

端

肽(

CTX

)

表达水平

；

qRT-TCR

检测骨痂组织中血管内皮生长

性

AyeliuA8

可促进大鼠股骨骨折愈合

，

其机制可能与

VEGF/PI3KAkt

信号通路的激活有关

。

关键词

AyelOA8

；

股骨骨折;血管新生；

VEGF/PI3

KAkt

信

号通路

中图分类号

R

683

因子

A(VEGFA

)

mRNA

表达水平;

Westem

blot

检测骨痂组

织中

VEGF/PNKAkt

信号通路相关蛋白表达水平

。

结果

文献标志码

A

文章编号

302

-392

(2221

)21

-0248-26

doi

:

3.

10425/(.

c/hi.

iss/1202

-

1200.

029).4).412

与

sham

组比较

,

MoPel

组大鼠股骨病理损伤较严重

,

股骨骨

密度

、组织矿物质密度

、骨体积分数和

X

射线评分均降低

，

血清中

BALP

和

PINP

水平降低

，

而

TRACPAb

、

CTX

含量均

增加

，

骨痂组织中

VEGFA

mRNA

以及

VEGFA

、

VEGFR0

、

2520

-52 -10

接收

骨折是最常见的外科损伤

,

促进骨再生

、

骨质生

成和钙化在骨缺损修复中十分重要

3

］

。

ApePn

是血

管紧张素

II

1

型受体相关蛋白

(

APJ)

的内源性配

体,可介导血管生成和血管形成

［

］

,

ApePnA3

是其

基金项目

：

湖南省卫健委科研计划项目

(

编号:

C2513-P0

)

作者单位:解放军联勤保障部队第九二二医院骨科

,

衡阳

42352

中研究最为广泛的一类

Apekn

。

有研究

3

］

表明,

AyelinA

8

可参与调节糖尿病

、

肥胖

、

高血压

、

心血管

作者简介

：

曾昭池

，

男

，

主任医师，

责任作者

，

E-maii：

shxhu5508@

105

:

com

等疾病的病理生理过程

，

但目前有关

Ap

e

PnA3

促进

diOereni

coucontratiou

of

Cue

(0

,

3

,

20

,

44

pmol/P).

3-(4,5-Dioetyylthiazol-P-yl)

A

,4-

dippenyltetrazolium

bromide

(MTT)

—

say

was

useh

ta

detect

the

ch

—

ges

in

celi

proliOra/ou

at

diOereni

tioe

points

(24,

48,

72

h)

.

Hoechst

33255

fluorescenco

staining

was

useh

ta

oPservv

celi

status

of

apoptosis.

Flow

cytometu

was

useh

ta

detect

apoptosis

anh

celi

cycie.

Howevee

,

the

changes

of

relate-

protein

expression

in

PI3Kp53

signaling

puhway

were

detecteh

by

Westeu

blot.

Results

MTT

results

showeh

thai

the

proliferatiou

of

SGC-7201

colis

was

inhibiteh

by

Cue

in

copcontratop-penenneni

manners.

The

results

of

celt

fluorescenco

staining

showeh

thai

Cue

coulU

promote

the

apoptosis

of

SGC

-7201

celts

,

anh

the

b/ghi

blue

fluorescenco

Oonsity

of

celts

rehuceh.

The

results

of

flow

cy-

tometu

showeh

that

compareh

with

the

control

group

,

the

apoptosis

rate

increaseh

(

P

<

0.

05

,

P

<

0.

01

)

anh

G2/G1

pPaso

celt

was

blocheh

in

the

group

with

diOereni

concentratiops

of

Cue

groups

(

P

<

0.

05

)

.

Westeru

blot

results

showeh

that

the

protein

level

of

PI3K

anh

the

phosphoryUtion

level

of

Akt

in

celts

of

diOereni

concentratiops

rehuceh

compareh

with

the

control

group

(P

<

0.

01)

,

but

the

expression

levets

of

p21

anh

p53

increaseh

(

P

<

0.05

,

P

<0.

01)

.

Conclusion

Cue

inhibits

the

proliferation

of

SGC

-7901

celt,

Ohuco

G2/G1

pPaso

arrest

anh

promote

apoptosis

,

which

mny

be

cUwiy

relate-

to

the

reaulahon

of

PI3K/p53

signaling

pathways.

Key

wordt

corcomin

；

human

0

x

00

caneve

celt;

proliferation

;

apoptosis

;

PI3K/p53

signaling

pyhwny;

celt

cy-

civ

安徽医科大学学报

Ada

Universitatis

Medicinalis

An,aut

2401

Jac

；

56(

1

)

・

49

・

骨折愈合的研究鲜有报道

。

血管内皮生长因子

(

vasc/lar

eokotheOal

growth

factor

,

VEGF

)

作为一种

术后立即进行

X

射线拍摄

，

观察到大鼠右股骨骨

折

，

对位良好

，

髓内针固定在位

，

确认造模成功

。造

模成功后即进行药物干预

,

Apelin-lC

L

组和

Apelin-

18

H

组大鼠分别腹腔注射

25

py/(ky

•

d

)

和

75

pg/(kg

•

d

)

的

Apelin-lC

，

而

sham

组和

Model

组大

重要的血管生成因子,具有促进内皮细胞增殖

、

促进

血管生成等重要的生物学功能

。

众多研究

*

5

］

表

明,

VEGF

可调控

PI3K/A0t

信号通路的激活

，

由此

推测

AyeOuAC

可能通过

VEGF/PI3K/A0t

信号通路

诱导血管新生从而促进骨折愈合

。

该研究拟通过构

建股骨骨折大鼠模型

，

探讨

AyWioAC

对骨折愈合的

影响及可能作用机制

，

为临床上骨折的愈合研究提

鼠分别注射等量

0.

2%

氯化钠溶液

，

连续

4

周

。

1.

2.2

Micro

CT

测定骨显微参数

药物干预结束

后处死大鼠

，

剥离股骨收集全长股骨

。

通过

Micro

CT

扫描检测各组大鼠股骨显微结构参数

，

包括骨密

供新的方向和思路

。

度

、

组织矿物质密度

、

骨体积分数

(

BV/TV

)

。

1

材料与方法

1.

1

实验动物

健康

SPF

级

6

~6

周龄雄性

SD

大

鼠

44

只,体质量

(244

±20)y,

由湖南嘉泰实验动物

有限公司提供

，

动物生产许可证编号:

SCXK

(

湘)

2210-d003

o

饲养条件为

SPF

级环境

，

温度为

(

23

±

2)C,

湿度为

50%

~66%

,10

—

5

h

明暗交替

，

自

由饮水

、

进食

。

1.

2

主要试剂与仪器

AyeOuAC

(

批号

：

SC-

35175,

规格

：

1

my)

购自美国

Santa

Caz

公司

；

大鼠

骨源性碱性磷酸酶

(

bono

alOaCoo

phosphatase

,

BALP

)

4

I

型前胶原氨基端前肽

(

amino

Orminal-

papwOdo

of

Opo

I

pacollapex

,

PILP

)

、

I

型胶原

C

端肽

(

C-tevninal

teOneptiOqs

of

typo

I

collapex

,

CTX

)

、

抗酒石酸酸性磷酸酶

-SU

a

stato

resistant

acid

phos/hatase-8U

,

TRACP-5U

)

ELIO

A

试剂盒购于

美国

R&D

公司

；

VEGFA

、

VEGFR8

、

PI3K

p55

、

A0mp-

Akt(Sw473)

和

p-acnn

抗体购于美国

Cell

Signaliny

TwhkoOpy

公司

；

BCA

试剂盒

、

苏木精

、

伊红购于上

海碧云天生物公司

；

TRIzoO

逆转录试剂盒

、

荧光定

量

PCR

试剂盒购自日本

TaKaRa

公司

；

FC

全自动酶

标仪购于美国

Thoma

公司

；

SYSTEM

GelOvc

XR

+

凝胶成像系统购自美国

Bio-Rad

公司

。

1-2

方法

1.3.

1

动物造模及分组处理

44

只雄性

SD

大鼠

，

适应性饲养

1

周后

，

随机分成

4

组:假手术组

(

sham

组)

、

模型组

(

MoPW

组)

、

ApWinA3

低剂量组

(

A

poi

lin-18

L

组)

、

和

ApWinA3

高剂量组

(

ApWinA3

H

组)

，

每组

5

只

。

除

sham

组外

，

其他各组大鼠均参

照文献⑷构建大鼠股骨骨折模型

。

腹腔注射

3%

戊

巴比妥钠麻醉大鼠

,

将大鼠局部脱毛

,

肢备皮消毒

，

取髌骨内侧及股外侧切口

，

置入直径

-

mm

克氏针,

骨折钳将股骨干中段剪断

，

反复冲洗后逐层缝合切

口归笼

。

sham

组大鼠不剪断股骨

，

其他操作一致

。

1.2.2

X

射线观察骨愈合情况

收集各组大鼠的

全长股骨进行

X

线检测

，

测量正

、

侧位片上骨痂最

大直径大小

,

采用两者的平均值为骨痂的最大直径

(

callus

diameter

)

。

米用

Lake-8andhu

X

线评分标

准切进行骨折愈合评分

，

摄片结果采用双盲法由两

位影像科医生进行评分

,

取平均值

,

比较两组骨折愈

合的差异

。

1.

2.2

苏木精

-

伊红

(

hematoxylin

-

eosin

,

HE

)

染

色观察

取各组大鼠侧股骨,去除股骨周围肌肉等

软组织

，

保留完整骨痂

，

置于

10%

中性甲醛固定

40

-

使用乙二胺四乙酸脱钙液开始

4

周的脱钙过程,

完成脱钙后进行石蜡包埋并行

HE

染色

，

于显微镜

下观察病理改变

，

依据

Hux-assocOtes

评分标准

［

9

］

对

各组骨痂形态进行评分

。

1.

2.2

ELIOA

检测血清骨转换标记物含量

取各

组大鼠血清

，

按照试剂盒说明书采用

ELIOA

法检测

血清成骨标志物

BALP

、

PINP

和破骨标志物

TRACP-

5U

、

CTX

表达水平

。

1.

2.2

qRT-PCR

检测

收集各组大鼠骨痂组织,

按照

TRNol

试剂说明书提取骨痂样本总

RNA,

紫外

分光光度计测定总

RNA

浓度,根据反转录试剂盒说

明将提取得

RNA

反转录成

cDNA

后进行

qRT-PCR

检测

。

引物序列

：

VEGFA

,

(F)5'-NCTGGACCCTG-

GCTTTACTG-3

'

；

(

R

)

5

'-GCTTTCTGCTCCCCTTCT-

GTA

；

；

p-actO,

(

F

)

5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-

3

；

(

R

)

5

；

-TGGAAGGTGGACAGTGAGGCA

；

反应

条件

：

95

C

预变性

10

mO,

25

C

、

10

s,

5

5

C

、

20

s

,

44

个循环

。

熔解曲线

：

95

C

、

mO,55

C

、

mO,95

C

、

/

s,

以

p-actin

为内参

，

采用

2

-

AA

Ct

法计算

VEG-

FA

相对表达量

。

1-2-

2

Westea

blot

检测

收集各组大鼠骨痂组织

置于组织匀浆器内

，

加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制

剂于冰上研磨匀浆

,

5

000

r/mO,4

C

离心

20

mO

,

取上清液

，

采用

BCA

法测蛋白含量

，

上样到

12%

-

54

•

安徽医科大学学报

Acta

Univer

atatSr

Meaicin,alie

AnduS

2228

Jo

；

56(

8

)

SDS-CAGE

凝胶电泳中分离蛋白

，

并转移至聚偏二

2.3

Apelin-K

对大鼠股骨组织病理学的影响

sham

组软骨组织完整

，

轮廓清晰

；

Model

组和

Ape-

氟乙烯膜

,

5%

的脱脂奶粉室温封闭

2

h,

加入一抗

VEGFA

、

VEGFR2

、

PI3K

p85

、

Akt

、

p-Akt

和

p-actis

抗

lis-13

L

组新生骨小梁松质骨较稀疏

，

排列比较紊

体

,4

C

过夜孵育

，

次日用洗膜缓冲液洗涤

3

次

，

加

标记辣根过氧化物酶的二抗室温孵育

）

h,

滴加

ECL

乱,可见大量软骨细胞浸润生长

；

ApXiuA3

H

组新

生骨小梁结构较多

,

排列致密有序

，

可见较成熟的骨

组织

，

骨痂逐渐吸收

。

见图

1A

。

与

sham

组比较,

Model

组

Hyo-associates

评分降低

，

差异有统计学意

试剂,在全自动凝胶成像系统中曝光显影

，

并用

Im

­

age

J

软件统计灰度值

，

计算相对表达量

。

1.

4

统计学处理

本实验数据均采用

SPSS

22.

0

统计学软件进行统计分析

。

计量资料以

"

土

$

表示

，

义

（

P

<

0.

0

）

）

i

与

Model

组比较

，

ApeUuA3

H

组

Hyo-associates

评分增加

，

差异有统计学意义

（

P

<

多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用

0.

0

）

）

,

而

Apelis-13

L

组差异无统计学意义

。

见图

LSD--

检验

，

以

P<0.

05

表示差异有统计学意义

。

2

结果

2.5

Apelin-14

对大鼠股骨显微结构参数的影响

与

sham

组比较

，

Model

组大鼠股骨的骨密度

、

组织

矿物质密度和骨体积分数均降低

，

差异有统计学意

义

（

P

<0.

08

）

；

与

Model

组比较

,

ApXiuA3

H

组大鼠

的骨密度

、

组织矿物质密度和骨体积分数均增加

，

差

异有统计学意义

（

P

<0.

08

）

,

而

ApeUs-

（

3

L

组差异

无统计学意义

。

见表

）

o

表

1

各组大鼠股骨显微结构参数比较

（

士

$,2

=

14

）

组别

骨密度

组织矿物质密度

骨体积分数

组别

(

mg/

cm

2

)

(

mg/

cm

3

)

(%)

sham

21).

22

±17.29

692.93

±85.4)

74.63

±2.18

Model

599.08

±12.85

…

572.52

±13.49

…

62•0/±2•04

…

Apel2-(3

L

512.45

±13.69

555.22

±17.326642

±8.

55

Apel2-(3

H

685.6)

±10.62*

*

659.94

±20.63#

*

7).76

±2.45

*

F

值

49.33830.513

9.

222

P

值

<0.200

8

<0.600

8

0.632

与

sham

组比较

：

**

P<0.

48

;

与

Model

组比较:**

P

<0.41

2.2

Apelin-14

对大鼠股骨愈合情况的影响

与

sham

组比较

,

Model

组大鼠股骨

X

射线评分降低

，

差异有统计学意义

（

P

<0.08

）

；

与

Model

组比较

，

Apelis-13

H

组大鼠股骨

X

射线评分和骨痂直径增

加

，

差异有统计学意义

（

P

<

0.

0

）

）

,

而

Apelis-13

L

组差异无统计学意义

。

见表

7

o

表

2

各组大鼠骨痂直径和

X

射线评分比较

（

士

s,a

=

12

）

组别

骨痂直径

（

mm

）

Lane-Pandhu

X

线评分

sham

-

18.74

±0.21

Model

9.

32

±0

；

17

2.42

±0.15

…

Apelin-ie

L

5

；

17

±0

；

12

2.73

±0.22

Apelin-ie

H

5.22

±0.24

*

9.22

±0.23

*

F

值

23.222

549.

449

P

值

0.202

<0.600

8

与

sham

组比较

：

**

P<0.

48

;

与

Model

组比较:**

P

<0.41

lB

o

B

12

@

抵

虽

E

-s

OSSE

*

*

o

3

—

n

—

12

3

4

图

1

各组大鼠股骨组织切片病理观察

A

:

HE

染色

X

120;

B

:

Huo-associates

评分

；

8

:

sham

组;

2 ：

Model

组

;3

：

ApXinA3

L

组

;4

：

ApXinA3

H

组

；

与

sham

组比较

：

**

P

<

0.4）

;与

Model

组比较:**

P

<0.41

2.4

Apelin-14

对大鼠血清中骨转换标记物含量的

影响

与

sham

组比较

,

Model

组大鼠血清中

BALP

、

PIPP

水平降低

，

TRACPOb

、

CTX

含量增加

，

差异有

统计学意义

（

P<0.48

）

；

与

Model

组比较

,

Apelis-13

H

组大鼠血清中

BALP

、

PINP

水平增加

，

TRACP-5b

、

CTX

含量降低

，

差异有统计学意义

（

P<0.08

）

,

而

Apelis-13

L

组差异无统计学意义

。

见表

3

o

2.

2

ApeXn-13

对大鼠骨痂组织中

VEGFA

表达水

平的影响

与

sham

组比较

,

Model

组大鼠骨痂组织

中

VEGFA

mRNA

和蛋白表达水平降低

，

差异有统

计学意义

（

P<0.

45

）

；

与

Model

组比较

,

ApeUuA3

H

组大鼠骨痂组织中

VEGFA

mRNA

和蛋白表达水平

安徽医科大学学报

Acta

Universitatis

Medicinalis

Annul

2421

Jao

；

56(

1

)

-

51

•

表

3

各组大鼠血清中

BALP

、

PINP

、

TRACP-5b

和

CTX

含量比较

((±5,2=16-

组别

sham

Model

BALP(

ng/mi

)

PINp

py/mi

)

7

766

±156.61

TRACP-8U(nymi

-

CTX

(

ng/mi

-

5.32

±0.2/

2.11

±0.

96

*

*

3.22

±0.28

6.72

±0.

11

7.48

±0.

94

2

205

±61.22

*

*

2

774

±107.22

6

962

±65.

5

#

98.936

11.32

±0.16

**

8.

76

±0.

91

*

*

8.27

±0.

95

2.44

±0.21

#

ApWinAC

L

ApelO-13

H

10.68

±0.32

4.20

±0.

11

#

5.74

±0.12

#

81.306

F

值

62.220

108.274

P

值

<0.200

1

<0.200

1

<0.200

1

<0.200

1

与

sham

组比较

：

*

*

P<0.

21

；

与

Model

组比较:#

P

<0.21

上升

，

差异有统计学意义

(P

)o

而

Ape0oA3

L

组与

Model

组比较

,

VEGFA

mRNA

和蛋

学意义

(

P

<

4.

041

-

, Akt

蛋白表达水平差异无统计

学意义

。

而

Apelin-13

L

组与

Model

组比较

，

以上蛋

白表达水平差异无统计学意义

。

见图

2

o

VEGFA

P-actin

图

2

各组大鼠骨痂组织中

VEGFA

表达水平比较

A

:

qRT-PCR

检测

VEGFA

的

mRNA

表达水平

；

B

:

WesOa

UOt

检

测

VEGFA

的蛋白表达水平

；

1

:

sham

组

；

2

：

Model

组

；

3

：

ApelO-18

L

组

；

2

:

ApWinAC

H

组

；

与

sham

组比较

：

*

P

<

0.

05

;

与

Model

组比

较

：

#

#P<0.

01,###Pv0.

001

2.6

ApehnP3

对大鼠骨痂组织中

VEGF/PI3K/

Akt

信号通路蛋白表达的影响

与

sham

组比较,

Model

组大鼠骨痂组织中

VEGFR2

、

PNK

p85

、

p-A0t

蛋白表达水平降低

，

差异有统计学意义

(POU

),

Akt

蛋白表达水平差异无统计学意义

；

与

Model

组

比较

,

Apelin-13

H

组大鼠骨痂组织中

VEGFR2

、

PNK

p35

和

p-Akt

蛋白表达水平增加

，

差异有统计

白表达水平差异无统计学意义

。

见图

3

o

图

3

各组大鼠骨痂组织中

VEGFR

2

、

PNK

pP

5

、

Akt

、

p-Akt

蛋白表达水平比较

1

：

sham

组

；

2

:

Model

组

；

3

：

ApelOA3

L

组

；

4

：

ApelOA3

H

组

；

与

sham

组比较:

**

P<0.

01

；

与

Model

组比较:

###

P

<

0.

001

3

讨论

局部血管生成对骨折愈合及其重要

,

而新生血

管的形成过程主要依赖于血管内皮的增殖

、

迁移和

毛细血管样管道的形成

。

有研究⑻报道

,ApeOn

具

有促进血管生成、

降低血压

、

调节水盐平衡及调节免

疫等多种生物学效应

，

可将

ApeOn

看作是一种新的

・

52

・

安徽医科大学学报

Acto

Unwersitatit

Medicinam

An,aui

2201

Jau

；

56(

1

)

血管形成因子

，

介导血管再生

。

而

VEGF

是血管发

生的中枢调节因子

，

具有调控血管发生和维持血管

内皮细胞的作用

，

可促进新生血管的形成⑷

。

Li

et

a/

5

］

研究表明

AyelO-13

可通过激活

PNK/Akt

信号

降

，

说明

AyelO-18

可促进成骨细胞的成熟和破骨细

胞的重吸收功能,从而促进骨痂形成利于骨折愈合

。

VEGF

是促进血管生成的重要因子

，

众多研

究

[

5

]

认为

VEGF

的高表达能促进骨折愈合

，

而

PTIKAkt

信号通路是

VEGF

下游重要的信号通路

通路,促进人视网膜血管内皮细胞的增殖

、

迁移和毛

细血管样管道的形成;

Huang

et

aU

3

］

研究表明,

Ape-

1OA8

可显著增加动脉栓塞动物模型中

VEGF

及其

之一,在血管生成的生理方面发挥着重要作用

。

多

数研究

[3]

认为

PTIKAkt

通路促进血管形成的机制

为:活化的

Akt

可通过磷酸化方式激活内皮型一氧

化氮合酶(

eNOS

),

eNOS

可催化合成微量一氧化氮,

而一氧化氮具有刺激血管舒张

、

血管重塑和血管生

受体

VEGFR0

的表达水平

，

其作用机制可能与

Ayv-

loA8

能促进血管生成有关

。

这些涉及血管发生的

因子可能成为诱导血管新生潜在研究靶点

。

本研究

结果显示

,

Apelin-18

可通过激活

VEGF/PNK/Akt

信号通路,上调成骨标记物水平

，

同时下调破骨标记

物水平

，

增加骨折局部的新骨形成

，

促进大鼠股骨骨

折愈合

。

Micro

CT

可以直观地观察和定量分析组织的差

异

,

清晰准确地了解骨折愈合的情况

,

是目前实验研

究中最为可靠的检测骨显微结构的方法

。

本研究首

先通过

Micro

CT

测定各组大鼠的骨显微结构

，

同时

通过

X

射线观察骨愈合情况

,

实验结果显示

,

股骨

骨折模型组大鼠的骨密度

、

组织矿物质密度

、

骨体积

分数以及股骨

X

射线评分较正常组均减小,与前人

研究

3

4

—

致

，

给予高剂量

Ap

e

PnA8

治疗后

，

大鼠的

骨显微参数和骨愈合情况均得到明显改善

，

骨痂直

径较模型组明显增加

。

HE

染色结果显示

，

模型组

骨折端多为硬骨骨痂

，

伴随大量软骨细胞浸润生长,

ApeXnA3

高剂量治疗组内外骨痂变薄

，

硬骨痂逐渐

吸收

，

可见较多新生骨小梁结构

，

说明

ApePnA3

可

促进软骨骨痂形成及向硬骨骨痂转变

，

从而促进骨

愈合

。

BALP

是成骨细胞分化的早期标记物,可以反

映成骨细胞的成熟和活性

，

能够促进骨基质的矿化

及骨结构的形成;

PINP

是在骨基质形成过程中胶原

代谢的产物,与成骨细胞的活性密切相关

3

2

］

。

袁功

武等

［

1

］

研究显示

，

吉非替尼治疗股骨骨折模型大

鼠后

，

血清中

BALP

和

PINP

水平较对照组明显上

升

，

说明吉非替尼可促进早期骨形成

、

成骨细胞分化

和成熟

。

TRACPAb

是由破骨细胞合成和分泌的代

谢酶

，

介导骨基质的降解过程

，

CTX

是在骨吸收过

程中

I

型胶原蛋白降解的羧基端产物

，

与破骨细胞

介导的骨吸收程度密切相关

。

本研究结果显示,与

正常组比较,模型组

BALP,PINP

含量下降

,TRACP-

5b

、

CTX

含量均上升

，

与前人研究

［

11

］

结果一致;与模

型组比较

,

Ap

e

linA8

高剂量治疗组大鼠血清中

含量上升

，

而

TRACPAb

、

CTX

含量下

成等一系列过程的功能

。

为了进一步证实

Ayelin-

18

是否通过激活

VEGF/PTIKAkt

信号通路促进大

鼠股骨骨折愈合

，

本实验对模型组使用不同剂量

AyelinA

8

进行干预治疗

，

研究结果显示

，

与模型组

比较

,

AyelO-13

高剂量组骨痂组织中

VEGFA

、

VEG-

FR0

、

PI3K

p55

和

y-Akt

蛋白表达水平上升

，

说明

AyelinA

3

确是通过激活

VEGF/PI3K/Akt

信号通路

来发挥股骨骨折愈合的促进作用

。

综上所述

，

外源性

Apelin-18

可通过调控

VEGF/PI3K/Akt

信号通路

，

改善股骨骨折大鼠的骨

显微参数

,

促进成骨细胞成熟和破骨细胞重吸收

，

从

而促进大鼠股骨骨折愈合

。

参考文献

[

1

]

Foulkc

B

A

,

Kenhat

A

R

,

Murrap

DW

,

et

at.

Fracture

healing

in

the

elUerlp

：

a

review]

J]

.

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,

2010

,

92

：

49

-

55.

[2

]

Antushevich

H

,

Wojcid

M.

Review

:

apelin

in

disease]

J].

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Chim

Acte,

2018

,

433:201

-

3.

[3

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KaUat

H

,

Comu

F

M

,

KucvP

A

,

et

at.

EEecl

cf

ApePdA3

ox

c-

mthmcyte

deformaPiPo

during

ischaemiaAepenusOu

Ojui/

cf

heari

in

diahetic

rats

[

J

].

Bratis

：

Leh

Listy

,

2517

,

113(5)

：

35

_6.

[4]

Zhu

G

S

,

Tang L

Y

,

Lv

DL

,

et

at.

Totai

flavoucs

cf

aPelmoschus

manibcf

exPibifs

pre-angiooenic

activity

bp

activating

the

VEGF-

AVEGFR7NI3

K/Akt

Wyna/ng

—

is[

J]

.

Am

J

Chin

Meh

,

2518

,

49(5)

：

507

-35.

[5]

Lin

Y

,

Lin

J,

Xia

T

,

et

at.

MiR-21

promotes

fracture

healing

bp

activating

the

PI3K/Akt

siyna/ng

pathway]

J]

.

E

us

Roe

Meh

Phas-

macol

Scf

253

,

25(7

)

：

4727

-

35.

[0

]

Melinccvici

C

S

,

Bcgca

AB

,

S

—

man

S

,

et

at.

Vascular

epOotheli-

at

growth

factor(

VEGF

)

-Fey

factor

in

normat

and

yathologicai

an-

yOyeneWs[J].

Rom

J

Morppol

EmbryW,

2518

,

59(2

-

：

455

-07.

J]

付宇.脉冲电磁场对骨质疏松性骨折愈合与成骨细胞增殖

分化的影响

[D

]

•合肥:安徽医科大学

，

2518.

[

3

]

Wu

L

,

Chen

L

,

Li

L.

Ayelin/APJ

system

：

a

novel

promising

thes-

app

taroef

fw

yathologicai

angiooexesis

[

J

]

•

CUn

Chim

Ac/

,

253,

490

：

53

-34.

[2

]

Li

Y

,

Bal

Y

J

,

Jiang

Y

R

,

et

at.

ApeUn-13

is

an

eartp

pumoter

cf

安徽医科大学学报

Acto

UnwersPatis

Medicinalis

An,aut

2251

Jau

；

56(

1

)

cyOskeleOu

anh

fgh-

juac/ou

in

diaPePc

machlae

ehema

vic

PI3

K/Akt

anh

MAPK/ErU

siyna/ng

pathways

[

J

]

.

Biomeh

Ros

・

53

・

LY294052

for

the

/eatmex-

cf

osteoporosis

in

ovariecOmizeP

rats

[J].

3

Orthop

Sure

Ros

:

2510

,

3

(1)

：

177

-

34.

[17

]

Meeww

R

,

Sanghani-Ke/

A

,

Coathuy

M

,

et

at.

VEGF

with

AMD5105

exhooenousip

moPilizos

mesexchymai

stem

celts

anh

io-

In/

2518

,

2918

：

5292574.

[15]

Huang

C

,

Dal

C

,

Goug

K

,

et

at.

Ayelib-15

putects

nexrovaschlas

uait

against

ischemic

injuries

throueh

the

elects

cf

vascular

exhc-

yrovos

fracture

hea/ng[

J]

.

3

Ouhop

Ros

,

2510

,

57(0)

：

1294

-

302.

[3

]

Ha

J

M

,

Jin

S

Y

,

Leo

H

S

,

et

at.

Reaula/ox

cf

retinai

anoiovexc-

theliat

growth

factor

[

J

],

Nepropeptidcs

,

2510

,

65

：

67

-

74.

[13

袁功武

,

兰生辉

,

刘曦明.抑制表皮生长因子受体信号通路对

大鼠股骨骨折愈合的作用

[]

•

中华实验外科杂志,

2518

,

35

(4

)

：

751

-5.

[12

]

Bal

J

,

Xu

Y

,

Diec

Y

,

et

at.

Combineh

low-Pose

Lift

anh

sis

bp

enhothePai

nitric

oxide

sypthase

siyna/ng

pathway]

J].

Kc-

rean

J

Physiol

PharmacW,

253,

25(5)

：

535

-3.

Exogenout

Apelin33

promotes

femorni

fmetum

heeling

in

mts

by

reeulating

the

VEGF/P3K/Ake

signaling

pateway

Zeng

Zhaochi

,

Tang

Yong

,

Zhang

Xi

—

OuR

f

at

(

Depi

of

OrflopgdWc

,

H

922

c

Hospitai

of

H

Joini

Sd

Support

Forca

of

H

PLA

,

HerLgytg

421002

-

AbstriCt

Objective

Tv

investigate

the

effect

of

Apelin-18

repulation

of

VEGF//I3

K/

Akt

signaling

on

femoral

fracture

healing.

Methonu

Forty

mate

SD

rats

were

i/ndomiy

divideh

into

sham

group

,

MoPel

group

,

ApePn-18

low-Pose

group

J

Apelin-18

L

,

25

pg/

(

kg

•

d)

]

anh

Apelin-18

high-Poso

gronp[

apelin-18

H

,

75

pg/

(

kg

•

d)

],

anh

3

rats

in

each

group

-

The

moPel

of

femorai

fracture

was

estaUlisheh

anh

iomehioOy

treateh

with

avprop/aiv

Umys

few

9

weehs-

Micro

CT

anh

XAay

were

useh

to

detect

bone

microscopic

parameteri

and

callus

dOmOe/

HE

staining

was

useh

to

oPseue

bone

tissue

4X0010

x

001

changes

-

ELIBA

was

useh

to

detect

the

expression

levets

of

se

­

rum

bone

marUeri

BALP

,

PINP

anh

osteoclast

TRACPAb

,

CTX.

qRT-TCR

was

useh

tv

detect

VEGFA

mRNA

ea-

pression

levets

in

callus

tissues,

and

Westeu

blot

was

useh

to

detect

the

expression

levets

of

relateh

proteins

in

the

VEGF//I3

K/

Akt

signaling

puhway

in

callus.

Result

Compareh

with

the

sham

gunp

,

the

MoPel

gunp

hah

sv-

vero

4

—

1(X0

x

001

damage

of

femue

and

decrexseh

fem

—

bone

dexsity

,

tissue

minerai

dexsity

,

bone

mass

fraction

anh

XAay

score,

BALP

anh

PINP

mvefs

in

serum

decreaseh

,

white

TRACPAb

anh

CTX

mvefs

increaseh

,

anh

VEGFA

mRNA

,

VEGFA

,

VEGFR0

,

PI3K

p55

anh

p-Akt

expression

levets

in

callus

decrexseh

-

Compareh

with

the

MoPel

gunp

,

the

4

—

1(X0

x

001

injuu

of

the

femue

in

the

Apelin-18

H

gunp

iopued.

Bone

minerai

dexsita

,

tissue

mineral

densita

,

bone

velume

fraction

,

XAay

score

anh

ca/us

dOmdc

alt

increased

-

BALP

anh

PINP

levels

in

serum

increpsed

(

P

<

0.

05

)

,

white

TRACPAb

anh

CTX

levets

decreased

,

anh

VEGFA

mRNA

,

VEGFA

,

VEG-

FR0

,

PI3K

p55

and

p-Akt

expression

mvafs

in

callus

incudsed.

There

was

no

significant

hiReunco

bet/een

Ape-

lin-18

L

gunp

anh

MoPel

gunp

(

P

>0.

05)

.

Conclusion

Exogenous

Apelin-18

can

promote

femorai

fracture

he/

ing

in

rats

,

anh

its

mechanism

myy

be

related

tv

the

activation

of

the

VEGF/PI3KAki

siyna/ng

puhway.

Key

woris

Apelin-18

;

femorai

fuctuus

;

angiogenesis

;

VEGF//I3

K/

Akt

siyna/ng

puhway

2024年4月24日发(作者：郁承载)

・

48

・

安徽医科大学学报

Acto

UnwersPatis

Medicinalis

An,aut

2201

Jap

；

56(

1

)

网络出版时间

：

2222

-10

-12

12

：

12

网络出版地址

：

htt

p

s

:

//Pos

.

c/hi.

oet/kcms/detail/34.

1255.

R.

22221211.

1421.022.

htmi

外源性

Apelin13

通过调控

VEGF/PI3K/Akt

信号通路促进大鼠股骨骨折愈合

曾昭池

，

汤

勇

，

张先慧,朱志勇

，

吴开元,袁永端

摘要

目的

探讨

ApePuA3

调控

VEGF/PNKAkt

信号通

PI3

K

p85

、

p-Akt

等蛋白表达水平降低

，

差异有统计学意义(

P

<7.75

)

。

与

MoPci

组比较

，

ApeXuA3

H

组大鼠股骨病理损

路对大鼠股骨骨折愈合的影响

。

方法

将

44

只雄性

SD

大

鼠随机分成假手术组

(

Wnm

组

、

、

模型组

(

MoPci

组

、

、

ApePu-

13

低剂量组

J

AyeliuA3

L

组

，

25

pyd

(

kg

-

d

)

］

和

Ayeliu-18

伤改善明显

，

股骨骨密度

、

组织矿物质密度

、

骨体积分数

、

X

射线评分和骨痂直径均增加

，

血清中

BALP

和

PINP

含量增

加

,TRACPAb

和

CTX

含量减少，

骨痂组织中

VEGFA

mRNA

高剂量组

［ApePuA3

H

组

,75

pg/(kg

-

d

)

］

,

每组

12

只

。建

立大鼠股骨骨折模型

，

立即给予相应药物处理

，

治疗

4

周

。

以及

VEGFA

、

VEGFR0

、

PI3

K

p85

、

p-Akt

蛋白表达水平增加,

差异有统计学意义

(P<2.

25

)

，

而

AyelOA8

L

组与

MoPel

组

采用

Moro

CT

和

X

射线分别检测各组大鼠股骨显微参数和

骨痂直径;苏木精-伊红

(

HE)

染色观察骨组织病理变化;酶

比较,相关指标差异无统计学意义

(

P>7.75

)

。

结论

外源

联免疫吸附测定

(ELISA

、

检测血清中成骨标记物骨源性碱

性磷酸酶

(BALP)

、

I

型前胶原氨基端前肽

(PINP

)

和破骨标

记物抗酒石酸酸性磷酸酶

-5b(TRACPAb)

、

I

型胶原

C

端

肽(

CTX

)

表达水平

；

qRT-TCR

检测骨痂组织中血管内皮生长

性

AyeliuA8

可促进大鼠股骨骨折愈合

，

其机制可能与

VEGF/PI3KAkt

信号通路的激活有关

。

关键词

AyelOA8

；

股骨骨折;血管新生；

VEGF/PI3

KAkt

信

号通路

中图分类号

R

683

因子

A(VEGFA

)

mRNA

表达水平;

Westem

blot

检测骨痂组

织中

VEGF/PNKAkt

信号通路相关蛋白表达水平

。

结果

文献标志码

A

文章编号

302

-392

(2221

)21

-0248-26

doi

:

3.

10425/(.

c/hi.

iss/1202

-

1200.

029).4).412

与

sham

组比较

,

MoPel

组大鼠股骨病理损伤较严重

,

股骨骨

密度

、组织矿物质密度

、骨体积分数和

X

射线评分均降低

，

血清中

BALP

和

PINP

水平降低

，

而

TRACPAb

、

CTX

含量均

增加

，

骨痂组织中

VEGFA

mRNA

以及

VEGFA

、

VEGFR0

、

2520

-52 -10

接收

骨折是最常见的外科损伤

,

促进骨再生

、

骨质生

成和钙化在骨缺损修复中十分重要

3

］

。

ApePn

是血

管紧张素

II

1

型受体相关蛋白

(

APJ)

的内源性配

体,可介导血管生成和血管形成

［

］

,

ApePnA3

是其

基金项目

：

湖南省卫健委科研计划项目

(

编号:

C2513-P0

)

作者单位:解放军联勤保障部队第九二二医院骨科

,

衡阳

42352

中研究最为广泛的一类

Apekn

。

有研究

3

］

表明,

AyelinA

8

可参与调节糖尿病

、

肥胖

、

高血压

、

心血管

作者简介

：

曾昭池

，

男

，

主任医师，

责任作者

，

E-maii：

shxhu5508@

105

:

com

等疾病的病理生理过程

，

但目前有关

Ap

e

PnA3

促进

diOereni

coucontratiou

of

Cue

(0

,

3

,

20

,

44

pmol/P).

3-(4,5-Dioetyylthiazol-P-yl)

A

,4-

dippenyltetrazolium

bromide

(MTT)

—

say

was

useh

ta

detect

the

ch

—

ges

in

celi

proliOra/ou

at

diOereni

tioe

points

(24,

48,

72

h)

.

Hoechst

33255

fluorescenco

staining

was

useh

ta

oPservv

celi

status

of

apoptosis.

Flow

cytometu

was

useh

ta

detect

apoptosis

anh

celi

cycie.

Howevee

,

the

changes

of

relate-

protein

expression

in

PI3Kp53

signaling

puhway

were

detecteh

by

Westeu

blot.

Results

MTT

results

showeh

thai

the

proliferatiou

of

SGC-7201

colis

was

inhibiteh

by

Cue

in

copcontratop-penenneni

manners.

The

results

of

celt

fluorescenco

staining

showeh

thai

Cue

coulU

promote

the

apoptosis

of

SGC

-7201

celts

,

anh

the

b/ghi

blue

fluorescenco

Oonsity

of

celts

rehuceh.

The

results

of

flow

cy-

tometu

showeh

that

compareh

with

the

control

group

,

the

apoptosis

rate

increaseh

(

P

<

0.

05

,

P

<

0.

01

)

anh

G2/G1

pPaso

celt

was

blocheh

in

the

group

with

diOereni

concentratiops

of

Cue

groups

(

P

<

0.

05

)

.

Westeru

blot

results

showeh

that

the

protein

level

of

PI3K

anh

the

phosphoryUtion

level

of

Akt

in

celts

of

diOereni

concentratiops

rehuceh

compareh

with

the

control

group

(P

<

0.

01)

,

but

the

expression

levets

of

p21

anh

p53

increaseh

(

P

<

0.05

,

P

<0.

01)

.

Conclusion

Cue

inhibits

the

proliferation

of

SGC

-7901

celt,

Ohuco

G2/G1

pPaso

arrest

anh

promote

apoptosis

,

which

mny

be

cUwiy

relate-

to

the

reaulahon

of

PI3K/p53

signaling

pathways.

Key

wordt

corcomin

；

human

0

x

00

caneve

celt;

proliferation

;

apoptosis

;

PI3K/p53

signaling

pyhwny;

celt

cy-

civ

安徽医科大学学报

Ada

Universitatis

Medicinalis

An,aut

2401

Jac

；

56(

1

)

・

49

・

骨折愈合的研究鲜有报道

。

血管内皮生长因子

(

vasc/lar

eokotheOal

growth

factor

,

VEGF

)

作为一种

术后立即进行

X

射线拍摄

，

观察到大鼠右股骨骨

折

，

对位良好

，

髓内针固定在位

，

确认造模成功

。造

模成功后即进行药物干预

,

Apelin-lC

L

组和

Apelin-

18

H

组大鼠分别腹腔注射

25

py/(ky

•

d

)

和

75

pg/(kg

•

d

)

的

Apelin-lC

，

而

sham

组和

Model

组大

重要的血管生成因子,具有促进内皮细胞增殖

、

促进

血管生成等重要的生物学功能

。

众多研究

*

5

］

表

明,

VEGF

可调控

PI3K/A0t

信号通路的激活

，

由此

推测

AyeOuAC

可能通过

VEGF/PI3K/A0t

信号通路

诱导血管新生从而促进骨折愈合

。

该研究拟通过构

建股骨骨折大鼠模型

，

探讨

AyWioAC

对骨折愈合的

影响及可能作用机制

，

为临床上骨折的愈合研究提

鼠分别注射等量

0.

2%

氯化钠溶液

，

连续

4

周

。

1.

2.2

Micro

CT

测定骨显微参数

药物干预结束

后处死大鼠

，

剥离股骨收集全长股骨

。

通过

Micro

CT

扫描检测各组大鼠股骨显微结构参数

，

包括骨密

供新的方向和思路

。

度

、

组织矿物质密度

、

骨体积分数

(

BV/TV

)

。

1

材料与方法

1.

1

实验动物

健康

SPF

级

6

~6

周龄雄性

SD

大

鼠

44

只,体质量

(244

±20)y,

由湖南嘉泰实验动物

有限公司提供

，

动物生产许可证编号:

SCXK

(

湘)

2210-d003

o

饲养条件为

SPF

级环境

，

温度为

(

23

±

2)C,

湿度为

50%

~66%

,10

—

5

h

明暗交替

，

自

由饮水

、

进食

。

1.

2

主要试剂与仪器

AyeOuAC

(

批号

：

SC-

35175,

规格

：

1

my)

购自美国

Santa

Caz

公司

；

大鼠

骨源性碱性磷酸酶

(

bono

alOaCoo

phosphatase

,

BALP

)

4

I

型前胶原氨基端前肽

(

amino

Orminal-

papwOdo

of

Opo

I

pacollapex

,

PILP

)

、

I

型胶原

C

端肽

(

C-tevninal

teOneptiOqs

of

typo

I

collapex

,

CTX

)

、

抗酒石酸酸性磷酸酶

-SU

a

stato

resistant

acid

phos/hatase-8U

,

TRACP-5U

)

ELIO

A

试剂盒购于

美国

R&D

公司

；

VEGFA

、

VEGFR8

、

PI3K

p55

、

A0mp-

Akt(Sw473)

和

p-acnn

抗体购于美国

Cell

Signaliny

TwhkoOpy

公司

；

BCA

试剂盒

、

苏木精

、

伊红购于上

海碧云天生物公司

；

TRIzoO

逆转录试剂盒

、

荧光定

量

PCR

试剂盒购自日本

TaKaRa

公司

；

FC

全自动酶

标仪购于美国

Thoma

公司

；

SYSTEM

GelOvc

XR

+

凝胶成像系统购自美国

Bio-Rad

公司

。

1-2

方法

1.3.

1

动物造模及分组处理

44

只雄性

SD

大鼠

，

适应性饲养

1

周后

，

随机分成

4

组:假手术组

(

sham

组)

、

模型组

(

MoPW

组)

、

ApWinA3

低剂量组

(

A

poi

lin-18

L

组)

、

和

ApWinA3

高剂量组

(

ApWinA3

H

组)

，

每组

5

只

。

除

sham

组外

，

其他各组大鼠均参

照文献⑷构建大鼠股骨骨折模型

。

腹腔注射

3%

戊

巴比妥钠麻醉大鼠

,

将大鼠局部脱毛

,

肢备皮消毒

，

取髌骨内侧及股外侧切口

，

置入直径

-

mm

克氏针,

骨折钳将股骨干中段剪断

，

反复冲洗后逐层缝合切

口归笼

。

sham

组大鼠不剪断股骨

，

其他操作一致

。

1.2.2

X

射线观察骨愈合情况

收集各组大鼠的

全长股骨进行

X

线检测

，

测量正

、

侧位片上骨痂最

大直径大小

,

采用两者的平均值为骨痂的最大直径

(

callus

diameter

)

。

米用

Lake-8andhu

X

线评分标

准切进行骨折愈合评分

，

摄片结果采用双盲法由两

位影像科医生进行评分

,

取平均值

,

比较两组骨折愈

合的差异

。

1.

2.2

苏木精

-

伊红

(

hematoxylin

-

eosin

,

HE

)

染

色观察

取各组大鼠侧股骨,去除股骨周围肌肉等

软组织

，

保留完整骨痂

，

置于

10%

中性甲醛固定

40

-

使用乙二胺四乙酸脱钙液开始

4

周的脱钙过程,

完成脱钙后进行石蜡包埋并行

HE

染色

，

于显微镜

下观察病理改变

，

依据

Hux-assocOtes

评分标准

［

9

］

对

各组骨痂形态进行评分

。

1.

2.2

ELIOA

检测血清骨转换标记物含量

取各

组大鼠血清

，

按照试剂盒说明书采用

ELIOA

法检测

血清成骨标志物

BALP

、

PINP

和破骨标志物

TRACP-

5U

、

CTX

表达水平

。

1.

2.2

qRT-PCR

检测

收集各组大鼠骨痂组织,

按照

TRNol

试剂说明书提取骨痂样本总

RNA,

紫外

分光光度计测定总

RNA

浓度,根据反转录试剂盒说

明将提取得

RNA

反转录成

cDNA

后进行

qRT-PCR

检测

。

引物序列

：

VEGFA

,

(F)5'-NCTGGACCCTG-

GCTTTACTG-3

'

；

(

R

)

5

'-GCTTTCTGCTCCCCTTCT-

GTA

；

；

p-actO,

(

F

)

5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-

3

；

(

R

)

5

；

-TGGAAGGTGGACAGTGAGGCA

；

反应

条件

：

95

C

预变性

10

mO,

25

C

、

10

s,

5

5

C

、

20

s

,

44

个循环

。

熔解曲线

：

95

C

、

mO,55

C

、

mO,95

C

、

/

s,

以

p-actin

为内参

，

采用

2

-

AA

Ct

法计算

VEG-

FA

相对表达量

。

1-2-

2

Westea

blot

检测

收集各组大鼠骨痂组织

置于组织匀浆器内

，

加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制

剂于冰上研磨匀浆

,

5

000

r/mO,4

C

离心

20

mO

,

取上清液

，

采用

BCA

法测蛋白含量

，

上样到

12%

-

54

•

安徽医科大学学报

Acta

Univer

atatSr

Meaicin,alie

AnduS

2228

Jo

；

56(

8

)

SDS-CAGE

凝胶电泳中分离蛋白

，

并转移至聚偏二

2.3

Apelin-K

对大鼠股骨组织病理学的影响

sham

组软骨组织完整

，

轮廓清晰

；

Model

组和

Ape-

氟乙烯膜

,

5%

的脱脂奶粉室温封闭

2

h,

加入一抗

VEGFA

、

VEGFR2

、

PI3K

p85

、

Akt

、

p-Akt

和

p-actis

抗

lis-13

L

组新生骨小梁松质骨较稀疏

，

排列比较紊

体

,4

C

过夜孵育

，

次日用洗膜缓冲液洗涤

3

次

，

加

标记辣根过氧化物酶的二抗室温孵育

）

h,

滴加

ECL

乱,可见大量软骨细胞浸润生长

；

ApXiuA3

H

组新

生骨小梁结构较多

,

排列致密有序

，

可见较成熟的骨

组织

，

骨痂逐渐吸收

。

见图

1A

。

与

sham

组比较,

Model

组

Hyo-associates

评分降低

，

差异有统计学意

试剂,在全自动凝胶成像系统中曝光显影

，

并用

Im

­

age

J

软件统计灰度值

，

计算相对表达量

。

1.

4

统计学处理

本实验数据均采用

SPSS

22.

0

统计学软件进行统计分析

。

计量资料以

"

土

$

表示

，

义

（

P

<

0.

0

）

）

i

与

Model

组比较

，

ApeUuA3

H

组

Hyo-associates

评分增加

，

差异有统计学意义

（

P

<

多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用

0.

0

）

）

,

而

Apelis-13

L

组差异无统计学意义

。

见图

LSD--

检验

，

以

P<0.

05

表示差异有统计学意义

。

2

结果

2.5

Apelin-14

对大鼠股骨显微结构参数的影响

与

sham

组比较

，

Model

组大鼠股骨的骨密度

、

组织

矿物质密度和骨体积分数均降低

，

差异有统计学意

义

（

P

<0.

08

）

；

与

Model

组比较

,

ApXiuA3

H

组大鼠

的骨密度

、

组织矿物质密度和骨体积分数均增加

，

差

异有统计学意义

（

P

<0.

08

）

,

而

ApeUs-

（

3

L

组差异

无统计学意义

。

见表

）

o

表

1

各组大鼠股骨显微结构参数比较

（

士

$,2

=

14

）

组别

骨密度

组织矿物质密度

骨体积分数

组别

(

mg/

cm

2

)

(

mg/

cm

3

)

(%)

sham

21).

22

±17.29

692.93

±85.4)

74.63

±2.18

Model

599.08

±12.85

…

572.52

±13.49

…

62•0/±2•04

…

Apel2-(3

L

512.45

±13.69

555.22

±17.326642

±8.

55

Apel2-(3

H

685.6)

±10.62*

*

659.94

±20.63#

*

7).76

±2.45

*

F

值

49.33830.513

9.

222

P

值

<0.200

8

<0.600

8

0.632

与

sham

组比较

：

**

P<0.

48

;

与

Model

组比较:**

P

<0.41

2.2

Apelin-14

对大鼠股骨愈合情况的影响

与

sham

组比较

,

Model

组大鼠股骨

X

射线评分降低

，

差异有统计学意义

（

P

<0.08

）

；

与

Model

组比较

，

Apelis-13

H

组大鼠股骨

X

射线评分和骨痂直径增

加

，

差异有统计学意义

（

P

<

0.

0

）

）

,

而

Apelis-13

L

组差异无统计学意义

。

见表

7

o

表

2

各组大鼠骨痂直径和

X

射线评分比较

（

士

s,a

=

12

）

组别

骨痂直径

（

mm

）

Lane-Pandhu

X

线评分

sham

-

18.74

±0.21

Model

9.

32

±0

；

17

2.42

±0.15

…

Apelin-ie

L

5

；

17

±0

；

12

2.73

±0.22

Apelin-ie

H

5.22

±0.24

*

9.22

±0.23

*

F

值

23.222

549.

449

P

值

0.202

<0.600

8

与

sham

组比较

：

**

P<0.

48

;

与

Model

组比较:**

P

<0.41

lB

o

B

12

@

抵

虽

E

-s

OSSE

*

*

o

3

—

n

—

12

3

4

图

1

各组大鼠股骨组织切片病理观察

A

:

HE

染色

X

120;

B

:

Huo-associates

评分

；

8

:

sham

组;

2 ：

Model

组

;3

：

ApXinA3

L

组

;4

：

ApXinA3

H

组

；

与

sham

组比较

：

**

P

<

0.4）

;与

Model

组比较:**

P

<0.41

2.4

Apelin-14

对大鼠血清中骨转换标记物含量的

影响

与

sham

组比较

,

Model

组大鼠血清中

BALP

、

PIPP

水平降低

，

TRACPOb

、

CTX

含量增加

，

差异有

统计学意义

（

P<0.48

）

；

与

Model

组比较

,

Apelis-13

H

组大鼠血清中

BALP

、

PINP

水平增加

，

TRACP-5b

、

CTX

含量降低

，

差异有统计学意义

（

P<0.08

）

,

而

Apelis-13

L

组差异无统计学意义

。

见表

3

o

2.

2

ApeXn-13

对大鼠骨痂组织中

VEGFA

表达水

平的影响

与

sham

组比较

,

Model

组大鼠骨痂组织

中

VEGFA

mRNA

和蛋白表达水平降低

，

差异有统

计学意义

（

P<0.

45

）

；

与

Model

组比较

,

ApeUuA3

H

组大鼠骨痂组织中

VEGFA

mRNA

和蛋白表达水平

安徽医科大学学报

Acta

Universitatis

Medicinalis

Annul

2421

Jao

；

56(

1

)

-

51

•

表

3

各组大鼠血清中

BALP

、

PINP

、

TRACP-5b

和

CTX

含量比较

((±5,2=16-

组别

sham

Model

BALP(

ng/mi

)

PINp

py/mi

)

7

766

±156.61

TRACP-8U(nymi

-

CTX

(

ng/mi

-

5.32

±0.2/

2.11

±0.

96

*

*

3.22

±0.28

6.72

±0.

11

7.48

±0.

94

2

205

±61.22

*

*

2

774

±107.22

6

962

±65.

5

#

98.936

11.32

±0.16

**

8.

76

±0.

91

*

*

8.27

±0.

95

2.44

±0.21

#

ApWinAC

L

ApelO-13

H

10.68

±0.32

4.20

±0.

11

#

5.74

±0.12

#

81.306

F

值

62.220

108.274

P

值

<0.200

1

<0.200

1

<0.200

1

<0.200

1

与

sham

组比较

：

*

*

P<0.

21

；

与

Model

组比较:#

P

<0.21

上升

，

差异有统计学意义

(P

)o

而

Ape0oA3

L

组与

Model

组比较

,

VEGFA

mRNA

和蛋

学意义

(

P

<

4.

041

-

, Akt

蛋白表达水平差异无统计

学意义

。

而

Apelin-13

L

组与

Model

组比较

，

以上蛋

白表达水平差异无统计学意义

。

见图

2

o

VEGFA

P-actin

图

2

各组大鼠骨痂组织中

VEGFA

表达水平比较

A

:

qRT-PCR

检测

VEGFA

的

mRNA

表达水平

；

B

:

WesOa

UOt

检

测

VEGFA

的蛋白表达水平

；

1

:

sham

组

；

2

：

Model

组

；

3

：