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姬松茸多糖对体外高糖培养乳鼠心肌细胞保护作用

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2024年5月12日发(作者:泰天罡)

2011(6) 龟闽苗 

姬松茸多糖对体外高糖培养乳鼠心肌细胞保护作用 

杨旭东 张 杰 王春涛 

(黑龙江省牡丹江医学院,黑龙江牡丹江157011) 

摘要 目的:探讨姬松茸多糖(Agaricus blazeiMurill Polysac— 

实验室提供。Trizol(Sigma公司),RT—PCR试剂盒(大连宝生 

物有限公司);荧光显微镜(奥林巴斯)。 

1.2试验方法 

1-2_1 细胞培养与分组取乳鼠心脏,用D—Hanks洗涤3 

charides,ABPS)对体外高糖培养乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用 

及其机制。方法:将Wistar乳鼠原代细胞随机分为5组,A:空白 

对照组;B:高糖组;C:O.4mg/mLABPS组;D:0.8mg/mLABPS 

组。用荧光显微镜测定各组细胞凋亡情况,RT—PCR法检测bcl- 

2、caspase一3基因表达量的变化。结果:经ABPS干预后,凋亡细 

次,剪成碎片,加入0.25%胰蛋白酶消化细胞5 airn后,接种 

于10%胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO2孵箱中培 

养。实验组:0.4、0.8 mg/mL的ABPS溶液,葡萄糖浓度为 

25 mmol/L,正常对照组:正常培养心肌细胞,高糖组:葡萄糖 

浓度为25 mmo ̄L。 

胞明显减少,bcl一2表达增加,caspase-3表达减少。结论:ABPS 

抑制体外高糖培养的乳鼠心肌的凋亡,其机制可能与抑制C8S— 

pase一3、激活bcl一2表达有关。 

关键词 姬松茸多糖细胞凋亡bcl一2 caspase一3 

文章编号 1000~8357(2011)06-0065-02 

1.2.2 MTT实验测定各组心肌细胞生长及增殖活性 各组 

细胞加5 g/L四甲基唑氮蓝(MTr)20 trL孵育;4 h后,弃上 

姬松茸为蘑菇科蘑菇属真菌,多糖为其主要成分,具有增 

强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等作用…嘲。抗肿瘤方 

面的药用价值研究较多,关于其治疗糖尿病的研究较少。试验 

以体外模拟糖尿病时体内高糖环境,研究ABPS对高糖环境 

的心肌细胞的保护作用。 

清,加入DMS0l50 L,完全显色后,采用酶标仪测定各孔 

490nm处吸光度(OD)值。按下列公式计算细胞生长抑制率 

(inhibition rate,IR)。IR=(对照组OD一实验组on)/(对照组 

OD一空白组0D)×loo%。 

l-2.3 细胞凋亡检测 给药48 h后,用胰酶消化细胞,冷 

PBS(pH 7.2)洗3遍,固定液4℃固定,10 min后弃固定液,蒸 

馏水洗3遍,室温干燥,用5 mg/L Hoechst33258染色15 airn, 

置于荧光显微镜上观察细胞形态并计算细胞凋亡率。 

1材料与方法 

1.1 供试材料 

1.1.1 实验动物 Wistar乳鼠雌雄各半,出生2~3 d,由哈尔 

滨医科大学实验动物中心提供。 

菌 

1.

 

1.2 药物、试剂与仪器 ABPS溶液由牡丹江医学院中心 

健 

1.2.4 RT—PCR

cDNA。 

检测bcl一2、caspase一3 mRNA表达:参考 

Trozol试剂盒提取细胞总RNA,按RT—PCR试剂盒操作提取 

康 

反应条件:94℃2 min,94℃30 S,50-60℃30 S,72℃ 

1 airn,35次循环。取5 LPCR产物,加l L上样缓冲液,上 

样后电压90 V,电泳2 h,DL2 000为Maker,结果用凝胶成像 

细胞存活率降f氐,经ABPS干预后心肌细胞存活率明显增高, 

差异有显著意义(P<O.01);高糖环境中,心肌细胞凋亡率增 

高,经ABPS干预后心肌细胞凋亡率明显降低,差异有显著意 

义(P<O.O1),见表1,图l、2。 

表1 各组心肌细胞存活率( ±s,%) 

系统扫描,测定光密度值并计算bcl-2、caspase一3/18-actin的 

灰度值。 

1.2.5统计学分析实验数据以(X ̄S)表示,统计学处理采用 

SPSS l1.5软件,多组间数据比较采用方差分析,两组间比较 

采用t检验。 

2试验结果 

2.1 各组心肌细胞增殖抑制率及凋亡率高糖环境中,心肌 

注:与对照组比较, P<0.O1;与高糖组比较,#P<O.叭 

收稿日期:2011"-05一l3一稿;2011-07—15修改稿。 

基金项目:治疗胰岛素抵抗中草药筛选评价系统的建立及新药 

寻找(11511427) 

2.2各组心肌细胞bcl-2和caspase一3基因表达情况不 

同浓度ABPS作用48 h后,与高糖组相比,随着药物浓度的 

提高,细胞中caspase-3基因表达逐渐降低,bcl一2基因表达 

65 

e—mail:xingzheolmdj@126.corn 

食用菌与健康 

熟 撕 “ 《 ∞ 

在国苗 

2011(6) 

图1 0.8 mg/mLABPS组细胞凋亡情况 

图2高糖组细胞凋亡情况 

逐渐增加。见表2。 

表2 ABPS对心肌细胞bcl-2和caspase-3表达影响(瞄,mg,mL) 

显降低caspase一3基因mRNA表达,上调bcl一2基因mRNA 

表达。据此结果,可以推断ABPS正因为降低caspase一3基因 

mRNA表达、上调bcl-2基因mRNA表达实现了抑制心肌细 

胞凋亡的作用,但在实验动物体内是否具有上述作用等问题 

还有待于进一步证实。露 

参考文献 

注:与对照组比较, P<O.0l;与高糖组比较,#P<0.01 

[1】MizunoM et a1.MinatoK,ItoH,et a1.Antitumorpolysaccharidefrom 

the mycelium of liquid—cultured Agaricus blazei Murill【J1. 

3 讨 论 

糖尿病心肌病是糖尿病严重并发症之一,细胞凋亡在糖 

尿病心肌病中起关键作用,可导致心肌细胞丢失及心力衰竭。 

Biochemistry and molecular Biology International,1999,47(4): 

707—714. 

[2]刘常金,谷文英.巴西蘑菇胞外多糖的分离及抗肿瘤活性研究叨. 

食品与发酵工业,200l,27(11):27—29. 

[3]陆利霞,谷文英,丁霄霖.姬松茸多糖体外免疫及抗肿瘤作用初 

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡(Programed cell death,PCD), 

是在一种受基因调控的细胞主动死亡过程。细胞凋亡涉及多 

基因,其中bcl一2基因是一种凋亡抑制基因,位于18q21,其编 

步研究药【J].药物生物技术,2002,9(6):326—329. 

[4】Lalier L,Cartron PF,Juin P,et a1.Bax activation and mitochondrial 

insertionduringapoptosis[J].Apoptosis,2007,12(5):887-896. 

[5]Han HS,Park YM,Hwang TS.Diferential expression of Bcl一2,Bcl— 

码的蛋白只有与调节蛋白Bax形成二聚体时才有活性,当 

Bcl一2/Bax比率高时,Bcl一2抑制细胞凋亡 。bcl一2基因可以 

稳定线粒体膜,抑制caspase一3的激活,使细胞免于凋亡I51-[61。 

caspase一3是细胞凋亡信号转导通路中的ICE蛋白酶家族的 

成员,caspase一3被凋亡信号启动后,才能转变为成熟的酶,并 

XL and p53 in colorectal cancer….J Gastroenterol Hepatol,2006 

(21):1 108—1 1l4. 

[6】郭文娟,王爱英.凋亡抑制基因Bcl—xL的研究进展l J1.世界华人 

消化杂志,2008,16(25):2871—2876. 

酶切其特异的底物,通过影响特定信号分子参与细胞凋亡。 

caspase一3的活化是DNA片段化及染色质凝聚等凋亡形态所 

必需的 。 

[7】闻春生,应斌武,张永刚,等.槲皮素对肺腺癌细胞株A549细胞 

中凋亡相关因子caspase-3表达的影响【J].中国肺癌杂志, 

2008,11(2):194—197. 

结果显示:ABPS对体外高糖环境培养的心肌细胞具有 

保护作用,可提高心肌细胞存活率,降低细胞凋亡率,并可明 

●●●I I4p-●II●h●●●h●●◆●I●●●●●1,11●●II●◆ I●

[8】黄健,魏秀岩,孙博航,等.冬凌草甲素诱导HepG2肝癌细胞凋亡 

机制的研究【J].中国现代中药,2 010,12(12):28—32. 

il●●II●nh● ● ih●◆Ih◆ ●II● 

(上接P56) 

参考文献 

【1】边广.秀珍菇菇蚊菇蝇的消长规律及无公害防治技术研究【D】. 

[J].吉林农业大学学报,1998,20(增刊):132. 

【6]陈祝安,黄基荣.不同来源绿僵菌对云斑金龟蛴螬致病力评价…. 

微生物学通报,1997,24(2):81—83. 

[7】张永军,王中康,殷幼平.球孢白僵菌的生物学特性及对小麦蚜 

福建农林大学硕士学位论文,2009. 

【2】杨东霞,王升厚,衣杰,等.8种杀虫剂对食用菌菇蝇抑制作用的 

研究Ⅲ.江苏农业科学,2009(6):192—194. 

f3 裘晖,吴振强,梁世中.金龟子绿僵菌及其杀虫机理l3】J1.农药, 

2004,43(8):342—345. 

虫的毒力fJ1.西南农业大学学报,2001,23(2):144—146. 

【8】章玉苹,黄少华,李敦松,等.球孢白僵菌Beauveria bassianaB6菌 

株对桔小实蝇的控制作用【I1.中国生物防治,2010,26(增刊): 

14-18. 

【4】宋漳,景云,蔡和谦.应用绿僵菌防治马尾松毛虫初探IJ].福建林 

学院学报,1997,17(2):1o7—109. 

【9]袁盛勇,孔琼,张宏瑞,等.蜡蚧轮枝菌对平菇厉眼蕈蚊幼虫和蛹 

的毒力测定IJ].中国农学通报,2009,25(19):194—196. 

【51陈祝安,冯惠英,潘玲聪.不同来源绿僵菌对稻水象甲生物测定 

2024年5月12日发(作者:泰天罡)

2011(6) 龟闽苗 

姬松茸多糖对体外高糖培养乳鼠心肌细胞保护作用 

杨旭东 张 杰 王春涛 

(黑龙江省牡丹江医学院,黑龙江牡丹江157011) 

摘要 目的:探讨姬松茸多糖(Agaricus blazeiMurill Polysac— 

实验室提供。Trizol(Sigma公司),RT—PCR试剂盒(大连宝生 

物有限公司);荧光显微镜(奥林巴斯)。 

1.2试验方法 

1-2_1 细胞培养与分组取乳鼠心脏,用D—Hanks洗涤3 

charides,ABPS)对体外高糖培养乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用 

及其机制。方法:将Wistar乳鼠原代细胞随机分为5组,A:空白 

对照组;B:高糖组;C:O.4mg/mLABPS组;D:0.8mg/mLABPS 

组。用荧光显微镜测定各组细胞凋亡情况,RT—PCR法检测bcl- 

2、caspase一3基因表达量的变化。结果:经ABPS干预后,凋亡细 

次,剪成碎片,加入0.25%胰蛋白酶消化细胞5 airn后,接种 

于10%胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO2孵箱中培 

养。实验组:0.4、0.8 mg/mL的ABPS溶液,葡萄糖浓度为 

25 mmol/L,正常对照组:正常培养心肌细胞,高糖组:葡萄糖 

浓度为25 mmo ̄L。 

胞明显减少,bcl一2表达增加,caspase-3表达减少。结论:ABPS 

抑制体外高糖培养的乳鼠心肌的凋亡,其机制可能与抑制C8S— 

pase一3、激活bcl一2表达有关。 

关键词 姬松茸多糖细胞凋亡bcl一2 caspase一3 

文章编号 1000~8357(2011)06-0065-02 

1.2.2 MTT实验测定各组心肌细胞生长及增殖活性 各组 

细胞加5 g/L四甲基唑氮蓝(MTr)20 trL孵育;4 h后,弃上 

姬松茸为蘑菇科蘑菇属真菌,多糖为其主要成分,具有增 

强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等作用…嘲。抗肿瘤方 

面的药用价值研究较多,关于其治疗糖尿病的研究较少。试验 

以体外模拟糖尿病时体内高糖环境,研究ABPS对高糖环境 

的心肌细胞的保护作用。 

清,加入DMS0l50 L,完全显色后,采用酶标仪测定各孔 

490nm处吸光度(OD)值。按下列公式计算细胞生长抑制率 

(inhibition rate,IR)。IR=(对照组OD一实验组on)/(对照组 

OD一空白组0D)×loo%。 

l-2.3 细胞凋亡检测 给药48 h后,用胰酶消化细胞,冷 

PBS(pH 7.2)洗3遍,固定液4℃固定,10 min后弃固定液,蒸 

馏水洗3遍,室温干燥,用5 mg/L Hoechst33258染色15 airn, 

置于荧光显微镜上观察细胞形态并计算细胞凋亡率。 

1材料与方法 

1.1 供试材料 

1.1.1 实验动物 Wistar乳鼠雌雄各半,出生2~3 d,由哈尔 

滨医科大学实验动物中心提供。 

菌 

1.

 

1.2 药物、试剂与仪器 ABPS溶液由牡丹江医学院中心 

健 

1.2.4 RT—PCR

cDNA。 

检测bcl一2、caspase一3 mRNA表达:参考 

Trozol试剂盒提取细胞总RNA,按RT—PCR试剂盒操作提取 

康 

反应条件:94℃2 min,94℃30 S,50-60℃30 S,72℃ 

1 airn,35次循环。取5 LPCR产物,加l L上样缓冲液,上 

样后电压90 V,电泳2 h,DL2 000为Maker,结果用凝胶成像 

细胞存活率降f氐,经ABPS干预后心肌细胞存活率明显增高, 

差异有显著意义(P<O.01);高糖环境中,心肌细胞凋亡率增 

高,经ABPS干预后心肌细胞凋亡率明显降低,差异有显著意 

义(P<O.O1),见表1,图l、2。 

表1 各组心肌细胞存活率( ±s,%) 

系统扫描,测定光密度值并计算bcl-2、caspase一3/18-actin的 

灰度值。 

1.2.5统计学分析实验数据以(X ̄S)表示,统计学处理采用 

SPSS l1.5软件,多组间数据比较采用方差分析,两组间比较 

采用t检验。 

2试验结果 

2.1 各组心肌细胞增殖抑制率及凋亡率高糖环境中,心肌 

注:与对照组比较, P<0.O1;与高糖组比较,#P<O.叭 

收稿日期:2011"-05一l3一稿;2011-07—15修改稿。 

基金项目:治疗胰岛素抵抗中草药筛选评价系统的建立及新药 

寻找(11511427) 

2.2各组心肌细胞bcl-2和caspase一3基因表达情况不 

同浓度ABPS作用48 h后,与高糖组相比,随着药物浓度的 

提高,细胞中caspase-3基因表达逐渐降低,bcl一2基因表达 

65 

e—mail:xingzheolmdj@126.corn 

食用菌与健康 

熟 撕 “ 《 ∞ 

在国苗 

2011(6) 

图1 0.8 mg/mLABPS组细胞凋亡情况 

图2高糖组细胞凋亡情况 

逐渐增加。见表2。 

表2 ABPS对心肌细胞bcl-2和caspase-3表达影响(瞄,mg,mL) 

显降低caspase一3基因mRNA表达,上调bcl一2基因mRNA 

表达。据此结果,可以推断ABPS正因为降低caspase一3基因 

mRNA表达、上调bcl-2基因mRNA表达实现了抑制心肌细 

胞凋亡的作用,但在实验动物体内是否具有上述作用等问题 

还有待于进一步证实。露 

参考文献 

注:与对照组比较, P<O.0l;与高糖组比较,#P<0.01 

[1】MizunoM et a1.MinatoK,ItoH,et a1.Antitumorpolysaccharidefrom 

the mycelium of liquid—cultured Agaricus blazei Murill【J1. 

3 讨 论 

糖尿病心肌病是糖尿病严重并发症之一,细胞凋亡在糖 

尿病心肌病中起关键作用,可导致心肌细胞丢失及心力衰竭。 

Biochemistry and molecular Biology International,1999,47(4): 

707—714. 

[2]刘常金,谷文英.巴西蘑菇胞外多糖的分离及抗肿瘤活性研究叨. 

食品与发酵工业,200l,27(11):27—29. 

[3]陆利霞,谷文英,丁霄霖.姬松茸多糖体外免疫及抗肿瘤作用初 

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡(Programed cell death,PCD), 

是在一种受基因调控的细胞主动死亡过程。细胞凋亡涉及多 

基因,其中bcl一2基因是一种凋亡抑制基因,位于18q21,其编 

步研究药【J].药物生物技术,2002,9(6):326—329. 

[4】Lalier L,Cartron PF,Juin P,et a1.Bax activation and mitochondrial 

insertionduringapoptosis[J].Apoptosis,2007,12(5):887-896. 

[5]Han HS,Park YM,Hwang TS.Diferential expression of Bcl一2,Bcl— 

码的蛋白只有与调节蛋白Bax形成二聚体时才有活性,当 

Bcl一2/Bax比率高时,Bcl一2抑制细胞凋亡 。bcl一2基因可以 

稳定线粒体膜,抑制caspase一3的激活,使细胞免于凋亡I51-[61。 

caspase一3是细胞凋亡信号转导通路中的ICE蛋白酶家族的 

成员,caspase一3被凋亡信号启动后,才能转变为成熟的酶,并 

XL and p53 in colorectal cancer….J Gastroenterol Hepatol,2006 

(21):1 108—1 1l4. 

[6】郭文娟,王爱英.凋亡抑制基因Bcl—xL的研究进展l J1.世界华人 

消化杂志,2008,16(25):2871—2876. 

酶切其特异的底物,通过影响特定信号分子参与细胞凋亡。 

caspase一3的活化是DNA片段化及染色质凝聚等凋亡形态所 

必需的 。 

[7】闻春生,应斌武,张永刚,等.槲皮素对肺腺癌细胞株A549细胞 

中凋亡相关因子caspase-3表达的影响【J].中国肺癌杂志, 

2008,11(2):194—197. 

结果显示:ABPS对体外高糖环境培养的心肌细胞具有 

保护作用,可提高心肌细胞存活率,降低细胞凋亡率,并可明 

●●●I I4p-●II●h●●●h●●◆●I●●●●●1,11●●II●◆ I●

[8】黄健,魏秀岩,孙博航,等.冬凌草甲素诱导HepG2肝癌细胞凋亡 

机制的研究【J].中国现代中药,2 010,12(12):28—32. 

il●●II●nh● ● ih●◆Ih◆ ●II● 

(上接P56) 

参考文献 

【1】边广.秀珍菇菇蚊菇蝇的消长规律及无公害防治技术研究【D】. 

[J].吉林农业大学学报,1998,20(增刊):132. 

【6]陈祝安,黄基荣.不同来源绿僵菌对云斑金龟蛴螬致病力评价…. 

微生物学通报,1997,24(2):81—83. 

[7】张永军,王中康,殷幼平.球孢白僵菌的生物学特性及对小麦蚜 

福建农林大学硕士学位论文,2009. 

【2】杨东霞,王升厚,衣杰,等.8种杀虫剂对食用菌菇蝇抑制作用的 

研究Ⅲ.江苏农业科学,2009(6):192—194. 

f3 裘晖,吴振强,梁世中.金龟子绿僵菌及其杀虫机理l3】J1.农药, 

2004,43(8):342—345. 

虫的毒力fJ1.西南农业大学学报,2001,23(2):144—146. 

【8】章玉苹,黄少华,李敦松,等.球孢白僵菌Beauveria bassianaB6菌 

株对桔小实蝇的控制作用【I1.中国生物防治,2010,26(增刊): 

14-18. 

【4】宋漳,景云,蔡和谦.应用绿僵菌防治马尾松毛虫初探IJ].福建林 

学院学报,1997,17(2):1o7—109. 

【9]袁盛勇,孔琼,张宏瑞,等.蜡蚧轮枝菌对平菇厉眼蕈蚊幼虫和蛹 

的毒力测定IJ].中国农学通报,2009,25(19):194—196. 

【51陈祝安,冯惠英,潘玲聪.不同来源绿僵菌对稻水象甲生物测定 

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