辣椒CaSn基因超表达增强转基因烟草对南方根结线虫的抗性-USB迷|专注于互联网分享

2024年5月19日发(作者：真晓蕾)

园艺学报 2014，41（1）：80–88 http: // www. ahs. ac. cn

Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@

辣椒CaSn基因超表达增强转基因烟草对南方根

结线虫的抗性

张文玥

，茆振川

1,*

，沈宝明

1,2

，王刚

，姚玉荣

，冯东昕

，谢丙炎

（

中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 100081；

湖南农业大学

植物保护学院，长沙 410007）

摘要：CaSn基因是在辣椒（Capsicum annuum）‘Santaka’中发现的新型抗菌肽Snakin家族基因。

通过RT-PCR，将CaSn基因从辣椒中分离并构建到pBI-121植物表达载体，通过农杆菌EHA105介导转

化白肋烟（Nicotiana tabacum‘White burley’），筛选到10个独立的转基因株系，并对T1代植株进行抗

南方根结线虫（Meloidogyne incognita）鉴定及靶标基因表达分析。结果表明CaSn已转入白肋烟，能够进

行超量表达，并且转CaSn基因白肋烟上的根结数量比转空载体对照和非转基因对照减少70%，同时不同

转基因烟草株系间对南方根结线虫的抗性也存在着一定差别。通过试验证明了辣椒中的抗菌肽基因CaSn

具有抗南方根结线虫作用，对于植物抗线虫资源的挖掘及利用提供了重要理论依据。

关键词：辣椒；Snakin；转基因超表达；南方根结线虫；抗性鉴定

中图分类号：S 641.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）01-0080-09

Overexpression of Pepper CaSn Gene Enhances Resistance to Meloidogyne

incognita in Transgenic Plants

ZHANG Wen-yue

，MAO Zhen-chuan

1,*

，SHEN Bao-ming

1,2

，WANG Gang

，YAO Yu-rong

，FENG

Dong-xin

，and XIE Bing-yan

（

Key Laboratory of Horticultural Crops Biology and Genetic Improvement，Ministry of Agriculture，Institute of Vegetables

and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；Hunan Agricultural University，Changsha

410007，China）

Abstract：The CaSn gene is a small cysteine-rich antimicrobial peptide encoding gene and belongs to

the snakin family. The gene was cloned from pepper（Capsicum annuum‘Santaka’）by RT-PCR and

constructed to the plant expression vector pBI-121，and transformed into burley tobacco via agrobacterium

mediated method. The CaSn transgenic plants were selected by PCR and GUS staining analyses，and ten

independent transgenic tobacco plants had been obtained. The CaSn gene was stably inherited and

overexpressed in transgenic T1 generation plants by RT-qPCR detection. Compared to the empty vector

control and non-transgenetic control plants，the number of the root-knots in the transgenic plants was

reduced by 70%. Meanwhile，difference was also shown in 10 independent transgenic lines in terms of

收稿日期：2013–07–09；修回日期：2013–11–18

基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（2009CB119000）；国家公益性行业（农业）科研专项（201103018）；国家自然科学基金项

目（30971905）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-25-B01）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：maozhenchuan@）

1期张文玥等：辣椒CaSn基因超表达增强转基因烟草对南方根结线虫的抗性 81

their resistance to root-knot nematodes. This study indicated that the CaSn participated in defense against

root-knot nematodes，and had an important role in excavating and utilization of nematodes-resistant

germplasms of plants.

Key words：pepper；Snakin；transgenic overexpression；Meloidogyne incognita；resistance identification

采用抗根结线虫（Meloidogyne spp.）基因是防治植物寄生性线虫根结线虫的高效措施，但是面

临着线虫毒性种群分化导致抗性极易丧失等问题。现在抗Mi及Me基因的毒性线虫已经在世界范围

内有报道（Eddaoudi et al.，1997；刘维志和段玉玺，2000；Ornat et al.，2001；Abad et al.，2008）。

植物为了自我保护，自身进化出许多防卫反应的机制，其中就有合成具有抗真菌活性的低分子

量的肽段（Selitrennikoff，2001）。现已发现了超过500种抗菌肽（Antimicrobial protein AMP），它

们在抵抗病原物侵染中起到了重要作用（Lopez-Solanilla et al.，2003）。在茄科的多种植物中常发现

高水平的蛋白抑制剂（Kim et al.，2009），这些蛋白抑制剂包括硫堇类物质（thionons）、脂质转移蛋

白（lipid transfer proteins）、Snakins（Silverstein et al.，2007）。其中Snakin家族是一个新的AMP家

族，根据其氨基酸结构，Snakin家族分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚家族（Berrocal-Lobo et al.，2002）。其中从

，

马铃薯中分离出的Snakin-1（

SN1）和Snakin-2（SN2）都属于Snakin家族（Almasia et al.，2008）

并具有抗细菌和真菌的活性（Segura et al.，1999；Almasia et al.，2008）。CaSnakin蛋白是在抗性辣

椒（Capsicum annuum）‘Santaka’中发现的一段富含半光氨酸的短肽，含有6个二硫键稳定其结构，

符合Snakin家族的分子结构特征（Berrocal-Lobo et al.，2002）。VIGS试验证实通过敲除抗根结线虫

辣椒中的CaSn基因，根结线虫的数量显著增加（Mao et al.，2011）。基于辣椒CaSn基因，作者分

离并构建了该基因的表达载体pBI-CaSn，通过农杆菌介导转入到白肋烟中，获得超表达CaSn株系，

并对转基因烟草进行抗南方根结线虫鉴定，以验证CaSn基因功能，并为新型转基因抗线虫新品种

培育提供重要的基因来源和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

辣椒（Capsicum annuum）抗线虫品种‘Santaka’，含有抗线虫基因N基因，由中国农业科学院

蔬菜花卉研究所辣椒组惠赠。南方根结线虫（Meloidogyne incognita），白肋烟（Nicotiana tabacum

‘White burley’），保存于中国农业科学院蔬菜花卉研究所病害组。南方根结线虫为生理小种1，利

用单卵块繁殖方式在温室的‘茄门’甜椒（Capsicum annuum L.）上扩繁，挑取成熟线虫卵块在无

菌水中28 ℃条件下孵化，收集2龄幼虫（茆振川等，2007），调整线虫悬浮液浓度至1 000条 · mL

-1

，

用于对线虫的抗性鉴定。

1.2 CaSn基因的克隆及超表达载体的构建

采用Trizol（Invitrogen）法提取‘Santaka’辣椒叶片组织的总RNA，采用Trans ScriptⅡOne-Step

gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix进行反转录合成cDNA（Transgen)。根据辣椒CaSn基

因序列设计特异引物GSP1、GSP2（Mao et al.，2011）（表1），从抗根结线虫辣椒‘Santaka’中克

隆到CaSn基因cDNA水平上的ORF，并进行测序检测验证。设计两端带有XbaⅠ，SmaⅠ酶切位

点的特异引物CasneF、CasneR（表1），通过该引物克隆到pBI-121表达载体上，构建PBI-CaSn双

元表达载体，电击转化到农杆菌EHA105菌株。

82 园艺学报 41卷

表1 本试验中所用的引物序列

Table 1 Some primer sequences in experiments

引物名称 Primer 引物序列 Primer sequence（5′–3′）

GSP1 TGCGTCTGTTGCCGTGAGTA

GSP2 TCAGCGAGGTGCCGATTA

CasneF GACTCTAGAATGGCCATCTCTAAAGC

CasneR CCACCCGGGATTTTAAGGGCATTTGC

NPTⅡF ATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGG

NPTⅡR TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGAT

Casn-F CATGTTGCCAGCAATGCTA

GUS-R AGTCTGCCAGTTCAGTTCGT

SG-F ATGACTACTCACGGCAACAG

SG-R CCGCATAATTACGAATATCTG

actin-F CTTAACCCAAAGGCT AATCGTG

actin-R GCCTGCCAAGTCAAGACGG

注：表中的横线分别代表CasneF和CasneR引物中的XbaⅠ，SmaⅠ酶切位点。

Note：The restriction sites XbaⅠand SmaⅠin CasneF and CasneR，respectively，are shown with underlines.

1.3 转基因烟草植株的获得

用农杆菌介导法将PBI-CaSn进行烟草遗传转化，首先将白肋烟种子进行表面消毒，在1/2MS

培养基上培育健康的无菌苗，当叶片生长到直径约5 cm时将叶片剪切为0.5 ~ 1.0 cm的碎片，用筛

选到的阳性农杆菌菌液浸润烟草叶片。经过共培养，筛选培养，20 d左右获得抗性芽，转移到1/2MS

培养基进行生根，获得T0代转基因烟草（林国平等，2005）。当根系发育比较发达时，逐渐打开

封口膜，炼苗5 ~ 6 d后移苗。从组培室移入温室进行正常的栽培管理，以获得转基因的烟草种子

（T1）。设置转pBI-121空载体的烟草为阴性对照。

1.4 转基因烟草植株的检测

1.4.1 PCR检测

选取T0代烟草植株叶片为材料，采用SDS法提取总DNA，进行转基因植株PCR检测。以pBI-121

在载体中的NPTⅡ基因序列设计引物NPTⅡ F、NPTⅡ R，并以目的基因CaSn片段设计上游特异

引物Casn-F，载体上含有的GUS基因设计下游特异引物GUS-R（表1），检测阳性植株。PCR反应

条件为94 ℃预变性4min；94 ℃变性40 s，62 ℃退火30 s，72 ℃分别延伸50 s、30 s，共35个循

环；72 ℃延伸10 min。PCR产物在1%凝胶电泳进行检测，确定阳性植株。

1.4.2 GUS染色

取转入空载体和转入PBI-CaSn质粒的T0代烟草的根部，进行GUS染色，以正常的非转基因

烟草作为空白对照，参照GUS染色液说明书（北京奥博来），37

℃温育过夜，用75%的乙醇脱色，

直至阴性对照为白色，观察各组织的染色情况。

1.4.3 RT-qPCR

选取CaSn T1代转基因植株、空载体植株和非转基因植株的新鲜叶片进行取样，每个转基因株

系分别随机取10株，将样品等量混合均匀，并重复3次取样。用Trizol法（Invitrogen）分别提取

样品的总RNA，采用TransScriptⅡ One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix进行反转

录合成第一链cDNA（Transgen）。以actin-F、actin-R为内参引物，利用CaSn基因下游序列，GUS

基因上游序列设计特异引物引物SG-F、SG-R（表1），以反转录的cDNA为模板，每个样本重复4

。利用CFX Manager软

次，根据荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq

说明书进行操作（TaKaRa）

1期张文玥等：辣椒CaSn基因超表达增强转基因烟草对南方根结线虫的抗性 83

件以及Excel软件进行CaSn基因的表达量分析。反应程序为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，58 ℃

退火30 s，40个循环。

1.5 转基因烟草植株抗根结线虫鉴定

将获得的T1代种子进行正常播种育苗，在温室中生长3 ~ 4周时移苗，生长至6片真叶时接种

南方根结线虫2龄幼虫，每株接种1 000条，每个株系调查10株，3次重复，共10个株系。以相

同的方法对转入空载体的T1代和正常的非转基因烟草作为对照。接种6周后统计根结数量。采用

SAS9.1统计分析根结数量差异显著性及效果。

2 结果与分析

2.1 CaSn基因克隆及表达载体PBI-CaSn构建

通过GSP1，GSP2引物，以抗性辣椒cDNA为模板进行PCR，获得了CaSn基因的ORF，通过

测序得知该ORF长度为315 bp，编码具有104个氨基酸的小分子蛋白，其核酸序列及编码蛋白质

序列均与CaSnakin蛋白完全相同，说明克隆到的ORF为CaSn基因，基因克隆正确。

以Casn ORF质粒为模板，利用带有酶切接头的引物CasneF、CasneR进行PCR，用XbaⅠ和

SmaⅠ克隆到pBI-121表达载体（图1）上，命名为PBI-CaSn。将重组质粒PBI-CaSn转化到感受态

DH5a中。摇菌后提取质粒酶切鉴定，酶切下的小片段长度为315 bp，将该片段回收后送测序公司

测序检测，其碱基序列与CaSn基因完全相同，说明CaSn基因已连接到pBI-121表达载体上。将

PBI-CaSn质粒电击转化到农杆菌EHA105菌株，并以转pBI-121空载体的农杆菌作为阴性对照。

图1 PBI-CaSn重组质粒T-DNA区域结构图

RB：右边界；LB：左边界；NOS-pro：NOS启动子；NPTⅡ：卡那霉素抗性基因；

CaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子；β-glucruonidase：GUS基因；

NOS-ter：NOS终止子；CaSn：辣椒中抗菌蛋白基因。

Fig. 1 Schematic diagram of the T-DNA region of the binary vector PBI-CaSn

RB：Right border；LB：Left border；NOS-pro：NOS promoter；NPTⅡ：Neomycin phosphotransferase gene；

CaMV35S：Cauliflower mosaic virus 35S promoter；β-glucruonidase：GUS gene；

NOS-ter：NOS terminal；CaSn：The CaSn gene.

2.2 转基因烟草的获得和PCR鉴定

利用农杆菌介导的方法侵染烟草叶片，经筛选培养后愈伤组织上形成抗性芽（图2，A），待抗

性芽2 ~ 3 cm时转移到生根培养基上生根培养（图2，B），获得T0代转基因株系（图2，C ~ E）。

随机选取T0代烟草10株Sn1 ~ Sn10，筛选阳性植株。通过NPTⅡF/NPTⅡR，Casn-F/GUS-R引

物进行PCR检测（图3），可以看到转CaSn基因的烟草分别扩增出682 bp、792 bp的片段，说明外源

基因已整合到烟草基因组中，而转入空载体的片段仅扩增出792 bp片段(图3，B中11泳道)，说明

pBI-121空载体也已整合到烟草基因组中，而非转基因烟草没有扩增出片段(图3，A和B中12泳道)。

84 园艺学报 41卷

图2 植物表达载体PBI-CaSn转化烟草

A：筛选培养；B：生根培养；C：炼苗；D ~ E：再生植株。

Fig. 2 The regeneration processing of independent transgenic tabacco plants with PBI-CaSn

A：Screening culture；B：Rooting culture；C：Hardening plantlets；D–E：Regenerated plants.

图3 转基因烟草PCR验证结果

M：DL2000；1 ~ 10：转基因植株Sn1 ~ Sn10；11：转空载体烟草；12：非转基因烟草；13：PBI-CaSn质粒。

Fig. 3 PCR analysis of transgenic tobacco plants

M：DL2000；1–10：Transgenic line Sn1–Sn10；11：pBI-121 transgenic tobacco；

12：Wild-type tobacco；13：PBI-CaSn transformation vector.

2.3 转基因烟草GUS染色分析

通过GUS组织染色可以看到（图4），转空载体及目的基因的株系根部经组织染色后均呈现蓝

色，说明pBI-121空载体以及PBI-CaSn表达载体已成功整合到烟草组织中并表达，而非转基因的烟

草根部没有颜色变化。

图4 转基因烟草根部GUS染色检测

1 ~ 10：转基因植株Sn1 ~ Sn10；11：转空载体烟草；12：非转基因烟草。

Fig. 4 The GUS test with transgenic tobacco plant roots

1–10：Transgenic line Sn1 ~ Sn10；11：pBI-121 transgenic tobacco；12：Wild-type tobacco.

1期张文玥等：辣椒CaSn基因超表达增强转基因烟草对南方根结线虫的抗性 85

2.4 T1代转基因烟草的RT-PCR表达分析

通过RT-qPCR体系分别检测10个独立的T1代株系。提取T1转基因植株RNA，反转录成cDNA

后进行检测，以确定在基因组中及转录水平上的表达情况。通过数据分析（图5）发现CaSn基因在

转基因烟草中都有表达，相对于内参基因，在Sn7中表达量最高为16.11，而在Sn1中表达量最低

为1.34，其中Sn7的表达量是Sn1的12倍。Sn2，Sn5，Sn6的表达量较高，是Sn1的8 ~ 10倍。

而Sn3，Sn4，Sn8，Sn9，Sn10的表达量较低，是Sn1的1 ~ 5倍。非转基因野生型烟草及转空载体

烟草中表达量接近于0。表明CaSn基因已在转录水平上得到表达。

图5 T1代转基因烟草Sn1 ~ Sn10株系RT-qPCR分析

Fig. 5 CaSn gene RT-qPCR analysis of Sn1–Sn10 transgenic tobacco lines

2.5 T1代转基因烟草的抗病性鉴定

在接种根结线虫6周后检测植株上的根结情况，发现转CaSn基因植株比对照植株根结少（图6）。

转基因植株中根结数量平均为22.68个，空载体及未转基因的对照中根结数量平均为69.85个，转

基因植株的根结数为对照的1/2 ~ 1/3。

从表2可以看出非转基因野生型烟草与转空载体烟草间根结数量差异不显著，而Sn1 ~ Sn10根

表2 不同转基因烟草株系的根结数显著性分析

Table 2 Significant analysis of root knots of different transgenic tobacco lines

转基因株系Transformant

非转基因野生型Wild type

转空载体烟草Empty vector control

Sn1

Sn2

Sn3

Sn4

Sn5

Sn6

Sn7

Sn8

Sn9

Sn10

根结数Root-knot number

69.2 ± 1.2 a

70.5 ± 1.3 a

29.4 ± 1.1 c

16.2 ± 1.3 gh

34.2 ± 1.1 b

25.5 ± 1.3 d

24.7 ± 2.0 d

18.1 ± 0.7 fg

21.9 ± 1.2 e

21.7 ± 2.0 e

15.2 ± 1.7 h

19.9 ± 1.0 ef

减少率/ % Decrease ratio

–

57.91

76.81

51.04

63.49

64.64

74.09

68.65

68.93

78.24

71.51

注：同列数字后不同字母表示在0.05水平上差异显著；减少率：不同株系相对于非转基因野生型与转空载体烟草平均数的根结减少率。

Note：Within the same column followed by different letters are significantly different at P < 0.05 level. Decrease ratio：Disease ratio represents

the reduce percentage of treatment plants compared to the average of wild type and empty vector control.

86 园艺学报 41卷

结数量均显著低于这两个对照，10个株系间也有显著性差异，Sn1抗线虫效果显著低于Sn2，却显

著高于Sn3。说明CaSn基因可以显著增强寄主对根结线虫的抗性。而不同株系间存在的抗性差异可

能与转基因插入的拷贝数量不同相关。

图6 转基因烟草株系Sn1 ~ Sn10对南方根结线虫的抗性

Fig. 6 Resistance identification of Sn1 ~ Sn10 transgenic tobacco plants to Meloidogyne incognita

3 讨论

CaSn基因属于Snakin基因家族，其编码的CaSnakin蛋白是在辣椒中发现的一段富含半光氨酸

的短肽，属于新型的抗菌肽。Mao等（2011）等通过VIGS，证实敲除抗根结线虫辣椒中的CaSn基

1期张文玥等：辣椒CaSn基因超表达增强转基因烟草对南方根结线虫的抗性 87

因以后，根结线虫的数量显著增加，初步证实了CaSn基因具有防御根结线虫的作用，能提高植物

对南方根结线虫的抗性。通过原核过表达体系，将CaSn基因编码的蛋白CaSnakin进行分离纯化，

发现该蛋白对根结线虫则表现出高效的杀线虫功能。在本研究中通过在感病白肋烟中超表达CaSn

基因，筛选到10个独立的转基因株系，发现转CaSn基因白肋烟上的根结数量显著减少，只有转空

载体对照和非转基因烟草的30%，同时不同转基因烟草株系对南方根结线虫的抗性也存在着一定差

别。说明辣椒中的抗菌肽基因CaSn对南方根结根结线虫具有防御作用。由于Snakin基因来源于茄

科，在马铃薯和辣椒中均有报道（Segura et al.，1999；Almasia et al.，2008；Mao et al.，2011），因

此，在利用CaSn基因进行抗根结线虫转基因具有生物安全性。植物寄生性线虫通过口针从特定的

植物细胞中吸收营养，根结线虫可以吸收43 kD的蛋白质（Urwin et al.，1997；Wei et al.，2003）。

由于CaSnakin蛋白分子质量较小，成熟的蛋白只有7.03 kD，因此在防治根结线虫中具有突出的利

用优势。同时，由于其分子量小可以其他类型的抗菌肽联合应用，而起到叠加抗性的作用，如已经

报道的马铃薯Snakin基因（SN1）与防御素基因（PTH1）的重组蛋白超表达后的抗菌作用（Kovalskaya

& Hammond，2009）。

Snakin 家族基因按照表达特点分为两类，SN1为植物本身组成型表达的一个防御蛋白，而SN2

是被生物及非生物因素诱导表达的蛋白。无论是离体还是活体条件下SN1和SN2都具有抗菌活性，

Bipolaris maydis

例如抗细菌（Clavibacter michiganensis）及真菌（Fusarium solani，Fusarium culmorum，

和Botrytis cinerea）作用（Almasia et al.，2008）。辣椒中的CaSn基因属于Snakin家族中的Ⅱ型亚

家族，并且与马铃薯中的Snakin2（SN2）高度同源，因此，辣椒中的CaSn是否具有抗细菌、真菌

的功能还有待进一步研究。

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《园艺学报》是中国园艺学会和中国农业科学院蔬菜花卉研究所主办的学术期刊，创刊于1962年，刊载有关果

树、蔬菜、观赏植物、茶及药用植物等方面的学术论文、研究报告、专题文献综述、问题与讨论、新技术新品种以

及园艺研究动态与信息等，适合园艺科研人员、大专院校师生及农业技术推广部门专业技术人员阅读参考。

《园艺学报》是中文核心期刊，中国科技核心期刊；被英国《CAB文摘数据库》、美国CA化学文摘、日本CBST

科学技术文献速报、俄罗斯AJ文摘杂志、CSCD中国科学引文数据库等多家数据库收录。《园艺学报》荣获“第三

届国家期刊奖”及“新中国60年有影响力的期刊”、“中国国际影响力优秀学术期刊”、“百种中国杰出学术期刊”、

“中国权威学术期刊”、“中国精品科技期刊”等称号。

《中国学术期刊影响因子年报》2013年公布的《园艺学报》复合总被引频次为11 071，复合影响因子为1.734；

期刊总被引频次为5 146，期刊影响因子为1.112。

《中国科技期刊引证报告》2013年公布的《园艺学报》扩展总被引频次为6

106，扩展影响因子为1.333；核心

总被引频次为4

328，核心影响因子为1.047；在中国科技核心期刊综合评价总分排名中居第29位。

《园艺学报》为月刊，每月25日出版。每期定价40元，全年480元。国内外公开发行，全国各地邮局办理订

阅，国内邮发代号82–471，国外发行由中国国际图书贸易总公司承办，代号M448。漏订者可直接寄款至编辑部订购。

编辑部地址：北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院蔬菜花卉研究所《园艺学报》编辑部。

邮政编码：100081；电话：（010）82109523。

E-mail：yuanyixuebao@。

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