2024年3月5日发(作者：狄苑)
23S rRNA V区A2063G基因突变的肺炎支原体肺炎患儿临床特征分析
黎燕;林小娟;钟礼立;张兵;黄寒;丁小芳;林琳;陈浩峰;黄振;彭力
【摘 要】目的 探讨支气管肺泡灌洗液(BALF)中检出23S rRNA V区A2063G突变基因的肺炎支原体肺炎(MPP)患儿的临床特征.方法 回顾分析2016年4月至2017年10月确诊为MPP且行纤维支气管镜肺泡灌洗治疗,并对BALF标本进行23S
rRNA V区A2063G突变基因检测的297例患儿的临床资料.根据患儿是否检测到突变基因分为突变组和未突变组,比较两组患儿的各项临床指标.结果 297例患儿中,155例BALF中检测到23S rRNA V区A2063G基因突变,阳性率52.1％.突变组和未突变组患儿在性别、年龄、血C反应蛋白、外周血白细胞计数、影像学胸腔积液/胸膜增厚比例、纤维支气管镜下出现严重病变(糜烂/塑型/黄白色痰栓)比例、混合感染发生率、重症及难治性肺炎支原体肺炎发生率的差异均无统计学意义(P>0.05);相比未突变组,突变组患儿住院时间、发热持续时间延长,BALF中支原体DNA(MP-DNA)拷贝量高,且使用大环内酯类抗生素后MP-DNA拷贝量下降缓慢、退热时间长,两组间差异均有统计学意义(P<0.05).Logistic回归分析显示,使用大环内酯类抗生素后的退热时间及MP-DNA载量与23S rRNA V区A2063G突变存在相关性(P<0.01).结论 观察MPP患儿BALF中MP-DNA载量高低以及使用大环内酯类药物后的退热时间可能对识别23S rRNA V区A2063G基因突变有一定的参考价值.
【期刊名称】《临床儿科杂志》
【年(卷),期】2018(036)008
【总页数】6页(P569-574)
【关键词】肺炎支原体;基因突变;肺泡灌洗液;儿童
【作 者】黎燕;林小娟;钟礼立;张兵;黄寒;丁小芳;林琳;陈浩峰;黄振;彭力
【作者单位】湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙
410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005
【正文语种】中 文
肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia，MP）是引起儿童社区获得性肺炎的常见病原体。近年来MP对大环内酯类抗生素耐药的报道在全球范围内日益增多，而我国的耐药率更是达90%以上[1]。有报道指出，耐药MP感染所导致的肺炎发热时间长、肺外并发症多、临床症状重，是难治性肺炎支原体肺炎（refractory
Mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP）重要危险因素之一，早期识别耐药MP菌株对临床治疗有积极的指导意义[2]。目前发现的MP耐药基因突变主要是核糖体50S亚单位23S rRNA V区基因位点突变，其相关的基因突变位点有2063、2064、2067和2617位等，以2063位点的突变最常见，A2063G突变（2063位点发生A→G突变）检出率可达95%以上[3]，是导致MP对大环内酯类抗生素耐药的主要原因。通过检测23S rRNA V区A2063G突变基因，可以了
解儿童MP感染总体耐药趋势。同时利用肺泡灌洗进行病原体检测能反映肺部MP感染的实际情况，与上呼吸道标本相比，其病原体无症状携带状态更少，样本质量更高。本研究对MPP患儿的支气管肺泡灌洗液（bronchlalveolar lavage fluid，BALF）进行23S rRNA的A2063G耐药基因检测，通过比较该耐药基因检测阳性和阴性MPP患儿的临床特点，探讨该基因突变与儿童MPP的临床相关性，提高对耐药突变株感染的MPP的识别能力。
1 对象与方法
1.1 研究对象
回顾分析2016年4月至2017年10月湖南省人民医院儿科临床诊断为MPP且行纤维支气管镜肺泡灌洗治疗，并对BALF标本进行23S rRNA V区A2063G基因检测患儿的临床资料。研究对象入选标准：①年龄1个月～14岁；②符合MPP诊断标准[4-5]；③有相应指征行支气管镜检查[6]，获取BALF；④重症肺炎及RMPP诊断符合国内最新儿童重症肺炎及RMPP诊断标准[7]。排除标准：排除有慢性肺疾病（支气管肺发育不良、肺部先天畸形）、支气管异物、结核感染、先天性心脏病、免疫缺陷、神经退行性疾病和临床资料不全的病例。根据BALF中是否检出23S rRNA V区A2063G突变基因，将研究对象分为突变组和未突变组。
本研究获得医院医学伦理委员会批准，纤维支气管镜肺泡灌洗治疗及标本采集均征得患儿家长知情同意。
1.2 方法
1.2.1 临床资料收集 通过病历查阅获得相关资料，包括性别、年龄、入院时病程、热程、住院时间、治疗后体温恢复正常时间、血常规、凝血功能、胸部CT及X线平片、纤维支气管镜下表现、灌洗治疗次数、BALF中MP-DNA载量及药物治疗情况。
1.2.2 BALF标本采集和测定 收集MPP患儿患侧BALF样本做MP-DNA定量测定
及耐药基因检测，纤维支气管镜肺泡灌洗治疗方法及BALF留取方法见本课题组前期文献[8]。
1.2.3 BALF MP-DNA检测 使用湖南圣湘生物科技有限公司提供的MP核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），检测灵敏度为400 copies/mL。BALF MP-DNA提取后行PCR扩增，读取MP-DNA载量及Ct值。根据荧光强度曲线判断标本或标准品达到临界阈值时所需要的循环数（Ct值），Ct＞39为MP核酸检测阴性，Ct≤39、且内标检测阳性（Ct≤40）为MP阳性。
1.2.4 耐药基因检测 采用浓缩一步法技术处理BALF样本[9]。使用湖南圣湘生物科技有限公司提供MP核酸及A2063G耐药突变位点检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行耐药突变基因检测。①DNA模板制备：吸取BALF1 000 μL于1.5 mL离心管中，加入浓缩液100 μL，振荡混匀后予离心力10 625×g，离心5 min，弃上清（有20 μL 残留）。沉淀中加入50 μL核酸释放剂，震荡混匀后瞬时离心（离心力1 180×g，离心5 s），静置10 min充分裂解，待测。②DNA扩增：吸取上述待测样本、MP-耐药突变对照、MP-阳性对照（不含突变碱基）、MP-阴性对照、MP-1%耐药突变质控各10 μL加入两组反应体系，两组反应体系分别加入40 μL MP-PCR混合液（含MP-PCR反应液及酶混合液）及MP耐药-PCR混合液（含MP耐药-PCR反应液及酶混合液）后上机检测，采用上海宏石96P
Realtime PCR反应仪进行扩增。③结果判读：荧光定量PCR的结果以Ct值显示，根据阴、阳性质控品所得数据进行分析并调节基线。对于检测样本或质控品，MP-PCR混合液对其的扩增曲线Ct值记为Ct1；MP耐药突变-PCR混合液对其的扩增曲线Ct值记为Ct2；ΔCt=Ct2－Ct1，见表1。
1.3 统计学分析
采用 SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布的用均数±标准差表示，两组组间比较采用t检验；偏态分布以中位数（四分位数间距）表示，组
间比较采用非参数检验。计数资料以构成比及率表示，组间比较采用χ2检验。对有统计学意义的指标进行logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
表1 荧光PCR仪检测MP核酸及耐药突变位点结果判读标准ΔCt值 MP-PCR混合液 结果判读≤MP-1%质控的ΔCt值Ct1≤40 MP阳性，发生A 2063 G耐药突变＞MP-1%质控的ΔCt值Ct1≤40 MP阳性，未发生A2063G耐药突变无S曲线 Ct1＞40 MP阴性无S曲线 无S曲线 MP阴性
2 结果
2.1 一般情况
共纳入研究对象297例，男167例、女130例；年龄1个月～14岁。其中155例（52.2%）BALF 23S rRNA V区A2063G耐药突变基因检测阳性，纳入突变组；142例检测阴性纳入未突变组。见表2。
2.2 未突变组和突变组患儿临床资料比较
297例中3岁～组耐药突变基因阳性检出率58.9%（82/139），其次为7～14岁组49.3%（39/79），高于小年龄组，但各组检出率比较差异无统计学意义（χ2=6.60，P=0.086）。未突变组和突变组性别构成比、年龄、起病至入院时病程比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；未突变组与突变组重症MPP及RMPP所占比例差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。
2.3 实验室、影像学及纤维支气管镜检查结果比较
未突变组和突变组患儿入院时WBC，CRP，D二聚体，纤维支气管镜灌洗治疗次数，纤维支气管镜镜下出现糜烂、塑型或黄白色痰栓比例，混合感染率，影像检查提示胸腔积液/胸膜增厚、双侧/单侧出现片状高密度灶/实变影的比例差异均无统计学意义（P＞0.05）；突变组患儿LDH水平、入院时第1次纤维支气管镜BALF
MP-DNA载量高于未突变组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。突变组在病程（起病至行第1次纤维支气管镜检查时间）的各个阶段MPDNA载量高于未
突变组（P＜0.05）。见表3。
使用阿奇霉素或红霉素后，未突变组BALF MPDNA载量与治疗前比较下降明显，log10 MP-DNA载量下降值未突变组为1.73（0.76～2.35，35例），突变组为0.26（－0.61～1.06，58例），差异有统计学意义（Z=4.34，P＜0.001）。配对比较治疗前后BALF log10MP-DNA载量的变化情况，治疗2～3天（≤3天）后复查未突变组下降明显，下降值0.73（0.27～1.48，11例），差异有统计学意义（Z=2.49，P=0.013）；突变组下降值－0.37（－1.19～0.31，22例），治疗前后比较，差异无统计学意义（Z=1.53，P=0.126）。治疗＞3天后，未突变组与突变组BALF log10 MP-DNA载量下降值分别为 2.08（1.38～2.65，24例）和0.54（0.08～1.47，36例），两组治疗前后比较，差异均有统计学意义（Z=3.65、2.11，P均＜0.05）。
表2 两组患儿临床资料比较临床资料 未突变组(n=142) 突变组(n=155) 统计量 P年龄[M(P25～P75)]/岁 4(2～7) 5(3～7) Z=0.73 0.464年龄段[n(%)] χ2=6.60
0.086 1月～ 11(7.7) 5(3.2)1岁～ 34(23.9) 29(18.7)3岁～ 57(40.1)
82(52.9)7～14岁 40(28.1) 39(25.1)性别[n(%)]χ2=2.07 0.150男85(59.8)
81(52.2)女57(40.2) 74(47.8)重症MPP[n(%)] 122(85.9) 140(90.3) χ2=1.38
0.239 RMPP[n(%)] 56(39.4) 67(43.2) χ2=0.43 0.508起病至入院时病程[M(P25～P75)]/d 7(6,14) 7(6,10) Z=0.35 0.723 WBC×109/L[M(P25～P75)]
9.16(6.69,11.64) 8.34(6.44,10.56) Z=1.53 0.125 CRP[M(P25～P75)]/mg·L－1
9.92(1.06,24.0) 11.90(2.71,30.15) Z=1.14 0.252 LDH[M(P25～P75)]/U·L－1
300.7(260.5,378.0) 337.1(268.2,436.8) Z=2.16 0.031 D二聚体[M(P25～P75)]/mg·L－1 0.21(0.0,0.80) 0.36(0.0,1.40) Z=1.68 0.093纤维支气管镜灌洗次数[M(P25～P75)]/次 1(1,2) 1(1,2) Z=1.15 0.246 log10 MP-DNA(±s )
5.08±2.07 6.96±1.74 t=8.39 ＜0.001合并糜烂/塑型/灰白痰栓[n(%)] 42(29.5)
48(30.9) χ2=0.07 0.795影像检查有片状高密度灶/实变[n(%)] 53(37.3) 51(32.9)
χ2=0.64 0.425混合感染率[n(%)] 32(22.5) 30(19.3) χ2=0.45 0.501
表3 两组不同病程BALF log10 MP-DNA载量比较(±s )未突变组 突变组DNA 例数 log10 MPDNA≤7 d 30 6.101.98 26 7.401.66 2.81 0.007＞7 d 67 5.641.97
105 7.111.61 5.11 ＜0.001＞14 d 45 3.691.40 24 5.781.97 4.59 ＜0.001病程t值 P例数 log10 MP-
2.4 治疗及疗效
所有患儿均好转出院。未突变组平均住院时间为8（6～10）天，发热时间为5（2～7）天，使用大环内酯类抗生素后退热时间为1（0～2）天；突变组平均住院时间9（7～10）天，发热时间为7（5～9）天，使用大环内酯类抗生素后退热时间为2（0～4）天。以上3项指标两组之间比较，差异均有统计学意义（Z=2.26～3.21，P均＜0.05）。
未突变组入院前使用大环内酯类抗生素53例（49.5%），突变组90例（66.1%），两组差异有统计学意义（χ2=13.63，P＜0.001）。两组治疗过程中均有更换抗MP药物的情况，即将阿奇霉素或红霉素更换成克拉霉素或多西环素继续治疗，突变组抗MP药物更换率高于未突变组，但差异无统计学意义（χ2=2.10，P=0.147）；联合糖皮质激素治疗者突变组74例（47.7%），未突变组57例（40.1%），两组比较差异无统计学意义（χ2=1.74，P=0.188）。
2.5 多因素logistic回归分析结果
将未突变组与突变组两组比较具有统计学意义的指标，包括LDH、BALF MP-DNA载量、入院前大环内酯类药物使用率、住院时间、发热时间及使用大环内酯类药物后退热时间纳入logistic回归分析，结果显示，使用大环内酯类药物后退热时间（OR=2.28，95%CI=1.39～3.73，P=0.001）以及MP-DNA载量（OR=2.82，95%CI=1.87～4.25，P＜0.001）与耐药突变具有相关性。
3 讨论
大环内酯类抗生素是临床上治疗儿童MP感染的一线药物，其中红霉素及其衍生物最为常用，但大环内酯类抗菌药物耐药日趋增多，在中国尤为突出。有学者认为多数耐药组患儿继续使用大环内酯类抗生素仍然有效[10-12]，因为阿奇霉素胞内浓度高，可达到或超过耐药MP的最小抑菌浓度（MIC），因此耐药MP感染的MPP患儿治疗仍首选阿奇霉素[13]。有研究发现，MP对大环内酯类抗生素耐药率达84%（48/57），但使用阿奇霉素治疗后均显示有效[14]。本研究突变组和未突变组患儿更换成大环内酯类抗生素以外其他抗MP药物的比率为15.4%和9.8%，但差异无统计学意义，也肯定了大环内酯类抗生素对部分耐药MP的治疗效果。日本的一项流行病学调查显示，对大环内酯类抗生素耐药的MPP患儿在治疗开始后48小时内退热，而持续发热的患儿中约70%为耐药株感染者[15]，本研究大环内酯类抗生素药物疗效与该报道相似。本研究也发现突变组患儿住院时间、发热时间、使用大环内酯类抗生素后的退热时间延长，进一步证实耐药突变延长MPP患儿的治疗时间[16-21]，对符合条件的患儿及早更换敏感抗MP药物对提高治疗效果仍有积极意义。本研究突变组患儿发生重症肺炎（90.3%）以及RMPP（85.9%）比例均较未突变组增高，但差异无统计学意义（P＞0.05），与既往部分学者研究结论不同。考虑原因可能为：①各研究监测的耐药突变位点不完全相同；②所纳入的重症肺炎或RMPP的参考标准不全一致；③对耐药MPP的研究多为回顾性研究，不同课题组所采用的治疗方式可能不尽相同，如糖皮质激素使用情况、纤维支气管镜灌洗治疗率及联合其他抗菌药物使用情况不一致等，疗效可能有差异。
一般认为，MPP患儿WBC多在正常范围，重症患儿的WBC可增高或降低，而CRP值在RMPP或重症MPP患儿中多明显升高[5]，LDH水平可作为MPP使用糖皮质激素的参考指标[22-23]。本研究患儿WBC均值9.2×109/L（32.9%患儿高于正常参考范围），CRP均值21.8 mg/L（70.7%患儿高于正常参考范围），
LDH均值362.1 U/L（84.1%患儿高于正常参考范围），因所纳入病例重症MPP（262例，88.2%）所占比例高，因此结论仍符合MPP患儿感染特点。另外突变组LDH水平明显高于未突变组（P＜0.05），但WBC及CRP水平差异无统计学意义，其他实验室指标如D二聚体水平、平均纤维支气管镜肺泡灌洗治疗次数、影像检查有片状高密度灶/肺实变比率以及纤维支气管镜下合并严重病变的比例均无显著差异。既往研究发现，耐药MPP患儿CRP值更高，但WBC、发生叶或段实变比例与敏感组相比无显著差异[24-25]。中国台湾学者的报道则提示，两组患者临床及实验室指标比较均无显著差异[16,26]。
本研究显示，在MPP病程第2周（8～14天）行纤维支气管镜肺泡灌洗治疗的患儿比例增多，突变组105例，未突变组67例，且以突变组居多，耐药突变检出率达 61.0%（105/172），提示耐药株感染的MPP患儿在病程第2周临床症状及肺部损害可能持续不缓解甚至有加重趋势。同时突变组患儿入院前大环内酯类抗生素使用率高于未突变组，这一因素是否影响耐药突变检出率仍需进一步研究。
相关研究显示耐药株感染MPP在持续发热、咳嗽或胸部影像学加重情况下，用妥舒沙星或米诺环素替代大环内酯类抗生素治疗后MP-DNA载量快速下降[27-28]，在一定程度上反映耐药MP与MP-DNA 载量有相关性。另有研究者在230例MPP患儿中检测到2063（A、C、G、T）4组基因型菌株，并发现突变组（基因型为C、G和T）患儿MP-DNA载量高于未突变组（基因型为A），但是3种碱基突变之间MP-DNA载量比较无显著差异；对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素耐药的MPP患儿MP-DNA载量高于非耐药（敏感或中介）组[29]。本研究也发现发生A2063G突变的MPP患儿BALF MP-DNA载量高于未突变组，随着病程的延长两组MP-DNA载量均呈下降趋势。大环内酯类抗生素治疗后未突变组患儿MP载菌量下降较明显，治疗2～3天后MP-DNA载量即出现显著下降，而此时突变组治疗前后载量下降不明显，甚至有部分病例出现MP-DNA载量上升
的情况，说明突变组患儿对大环内酯类抗生素治疗反应不佳。随着治疗时间延长，两组患儿治疗前后MP-DNA载量均有显著差异，与肺组织损伤后修复及机体对病原体的逐渐清除有关。可见观察BALF 中MP-DNA载量及其动态变化在一定程度上可反映MP耐药性。
本研究对突变组与未突变组有统计学意义的临床指标进行logistic回归分析发现，使用大环内酯类抗生素后退热时间以及BALF MP-DNA载量与耐药突变存在相关性，因此对抗感染治疗后持续发热、MPDNA载量明显增高、治疗后下降缓慢甚至持续增高的患儿需警惕耐药MP感染，可能需要延长治疗时间或更换其他敏感药物。
综上所述，本研究发现，发生23 S rRNA V区A2063G耐药基因突变的MPP患儿与无突变者相比，发热持续时间、住院时间及使用大环内酯类抗生素后退热时间延长，BALF MP-DNA载量更高且大环内酯类抗生素治疗后BALF MP-DNA载量下降缓慢，追踪观察MPP患儿使用大环内酯类药物后的退热时间、BALF MP-DNA载量及其治疗后的下降程度可能对判断MP耐药突变有指导意义。但纤维支气管镜检测为有创操作，受到适用条件限制，不能早期采集BALF标本进行MP-DNA定量检测，鼻咽拭子MP-DNA载量测定定量虽误差较大但获取相对简便，本研究没有对鼻咽拭子MP-DNA载量变化做追踪观察，有待以后进一步研究探讨。
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2024年3月5日发(作者：狄苑)
23S rRNA V区A2063G基因突变的肺炎支原体肺炎患儿临床特征分析
黎燕;林小娟;钟礼立;张兵;黄寒;丁小芳;林琳;陈浩峰;黄振;彭力
【摘 要】目的 探讨支气管肺泡灌洗液(BALF)中检出23S rRNA V区A2063G突变基因的肺炎支原体肺炎(MPP)患儿的临床特征.方法 回顾分析2016年4月至2017年10月确诊为MPP且行纤维支气管镜肺泡灌洗治疗,并对BALF标本进行23S
rRNA V区A2063G突变基因检测的297例患儿的临床资料.根据患儿是否检测到突变基因分为突变组和未突变组,比较两组患儿的各项临床指标.结果 297例患儿中,155例BALF中检测到23S rRNA V区A2063G基因突变,阳性率52.1％.突变组和未突变组患儿在性别、年龄、血C反应蛋白、外周血白细胞计数、影像学胸腔积液/胸膜增厚比例、纤维支气管镜下出现严重病变(糜烂/塑型/黄白色痰栓)比例、混合感染发生率、重症及难治性肺炎支原体肺炎发生率的差异均无统计学意义(P>0.05);相比未突变组,突变组患儿住院时间、发热持续时间延长,BALF中支原体DNA(MP-DNA)拷贝量高,且使用大环内酯类抗生素后MP-DNA拷贝量下降缓慢、退热时间长,两组间差异均有统计学意义(P<0.05).Logistic回归分析显示,使用大环内酯类抗生素后的退热时间及MP-DNA载量与23S rRNA V区A2063G突变存在相关性(P<0.01).结论 观察MPP患儿BALF中MP-DNA载量高低以及使用大环内酯类药物后的退热时间可能对识别23S rRNA V区A2063G基因突变有一定的参考价值.
【期刊名称】《临床儿科杂志》
【年(卷),期】2018(036)008
【总页数】6页(P569-574)
【关键词】肺炎支原体;基因突变;肺泡灌洗液;儿童
【作 者】黎燕;林小娟;钟礼立;张兵;黄寒;丁小芳;林琳;陈浩峰;黄振;彭力
【作者单位】湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙
410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005;湖南师范大学第一附属医院儿科,湖南长沙 410005
【正文语种】中 文
肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia，MP）是引起儿童社区获得性肺炎的常见病原体。近年来MP对大环内酯类抗生素耐药的报道在全球范围内日益增多，而我国的耐药率更是达90%以上[1]。有报道指出，耐药MP感染所导致的肺炎发热时间长、肺外并发症多、临床症状重，是难治性肺炎支原体肺炎（refractory
Mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP）重要危险因素之一，早期识别耐药MP菌株对临床治疗有积极的指导意义[2]。目前发现的MP耐药基因突变主要是核糖体50S亚单位23S rRNA V区基因位点突变，其相关的基因突变位点有2063、2064、2067和2617位等，以2063位点的突变最常见，A2063G突变（2063位点发生A→G突变）检出率可达95%以上[3]，是导致MP对大环内酯类抗生素耐药的主要原因。通过检测23S rRNA V区A2063G突变基因，可以了
解儿童MP感染总体耐药趋势。同时利用肺泡灌洗进行病原体检测能反映肺部MP感染的实际情况，与上呼吸道标本相比，其病原体无症状携带状态更少，样本质量更高。本研究对MPP患儿的支气管肺泡灌洗液（bronchlalveolar lavage fluid，BALF）进行23S rRNA的A2063G耐药基因检测，通过比较该耐药基因检测阳性和阴性MPP患儿的临床特点，探讨该基因突变与儿童MPP的临床相关性，提高对耐药突变株感染的MPP的识别能力。
1 对象与方法
1.1 研究对象
回顾分析2016年4月至2017年10月湖南省人民医院儿科临床诊断为MPP且行纤维支气管镜肺泡灌洗治疗，并对BALF标本进行23S rRNA V区A2063G基因检测患儿的临床资料。研究对象入选标准：①年龄1个月～14岁；②符合MPP诊断标准[4-5]；③有相应指征行支气管镜检查[6]，获取BALF；④重症肺炎及RMPP诊断符合国内最新儿童重症肺炎及RMPP诊断标准[7]。排除标准：排除有慢性肺疾病（支气管肺发育不良、肺部先天畸形）、支气管异物、结核感染、先天性心脏病、免疫缺陷、神经退行性疾病和临床资料不全的病例。根据BALF中是否检出23S rRNA V区A2063G突变基因，将研究对象分为突变组和未突变组。
本研究获得医院医学伦理委员会批准，纤维支气管镜肺泡灌洗治疗及标本采集均征得患儿家长知情同意。
1.2 方法
1.2.1 临床资料收集 通过病历查阅获得相关资料，包括性别、年龄、入院时病程、热程、住院时间、治疗后体温恢复正常时间、血常规、凝血功能、胸部CT及X线平片、纤维支气管镜下表现、灌洗治疗次数、BALF中MP-DNA载量及药物治疗情况。
1.2.2 BALF标本采集和测定 收集MPP患儿患侧BALF样本做MP-DNA定量测定
及耐药基因检测，纤维支气管镜肺泡灌洗治疗方法及BALF留取方法见本课题组前期文献[8]。
1.2.3 BALF MP-DNA检测 使用湖南圣湘生物科技有限公司提供的MP核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），检测灵敏度为400 copies/mL。BALF MP-DNA提取后行PCR扩增，读取MP-DNA载量及Ct值。根据荧光强度曲线判断标本或标准品达到临界阈值时所需要的循环数（Ct值），Ct＞39为MP核酸检测阴性，Ct≤39、且内标检测阳性（Ct≤40）为MP阳性。
1.2.4 耐药基因检测 采用浓缩一步法技术处理BALF样本[9]。使用湖南圣湘生物科技有限公司提供MP核酸及A2063G耐药突变位点检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行耐药突变基因检测。①DNA模板制备：吸取BALF1 000 μL于1.5 mL离心管中，加入浓缩液100 μL，振荡混匀后予离心力10 625×g，离心5 min，弃上清（有20 μL 残留）。沉淀中加入50 μL核酸释放剂，震荡混匀后瞬时离心（离心力1 180×g，离心5 s），静置10 min充分裂解，待测。②DNA扩增：吸取上述待测样本、MP-耐药突变对照、MP-阳性对照（不含突变碱基）、MP-阴性对照、MP-1%耐药突变质控各10 μL加入两组反应体系，两组反应体系分别加入40 μL MP-PCR混合液（含MP-PCR反应液及酶混合液）及MP耐药-PCR混合液（含MP耐药-PCR反应液及酶混合液）后上机检测，采用上海宏石96P
Realtime PCR反应仪进行扩增。③结果判读：荧光定量PCR的结果以Ct值显示，根据阴、阳性质控品所得数据进行分析并调节基线。对于检测样本或质控品，MP-PCR混合液对其的扩增曲线Ct值记为Ct1；MP耐药突变-PCR混合液对其的扩增曲线Ct值记为Ct2；ΔCt=Ct2－Ct1，见表1。
1.3 统计学分析
采用 SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布的用均数±标准差表示，两组组间比较采用t检验；偏态分布以中位数（四分位数间距）表示，组
间比较采用非参数检验。计数资料以构成比及率表示，组间比较采用χ2检验。对有统计学意义的指标进行logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
表1 荧光PCR仪检测MP核酸及耐药突变位点结果判读标准ΔCt值 MP-PCR混合液 结果判读≤MP-1%质控的ΔCt值Ct1≤40 MP阳性，发生A 2063 G耐药突变＞MP-1%质控的ΔCt值Ct1≤40 MP阳性，未发生A2063G耐药突变无S曲线 Ct1＞40 MP阴性无S曲线 无S曲线 MP阴性
2 结果
2.1 一般情况
共纳入研究对象297例，男167例、女130例；年龄1个月～14岁。其中155例（52.2%）BALF 23S rRNA V区A2063G耐药突变基因检测阳性，纳入突变组；142例检测阴性纳入未突变组。见表2。
2.2 未突变组和突变组患儿临床资料比较
297例中3岁～组耐药突变基因阳性检出率58.9%（82/139），其次为7～14岁组49.3%（39/79），高于小年龄组，但各组检出率比较差异无统计学意义（χ2=6.60，P=0.086）。未突变组和突变组性别构成比、年龄、起病至入院时病程比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；未突变组与突变组重症MPP及RMPP所占比例差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。
2.3 实验室、影像学及纤维支气管镜检查结果比较
未突变组和突变组患儿入院时WBC，CRP，D二聚体，纤维支气管镜灌洗治疗次数，纤维支气管镜镜下出现糜烂、塑型或黄白色痰栓比例，混合感染率，影像检查提示胸腔积液/胸膜增厚、双侧/单侧出现片状高密度灶/实变影的比例差异均无统计学意义（P＞0.05）；突变组患儿LDH水平、入院时第1次纤维支气管镜BALF
MP-DNA载量高于未突变组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。突变组在病程（起病至行第1次纤维支气管镜检查时间）的各个阶段MPDNA载量高于未
突变组（P＜0.05）。见表3。
使用阿奇霉素或红霉素后，未突变组BALF MPDNA载量与治疗前比较下降明显，log10 MP-DNA载量下降值未突变组为1.73（0.76～2.35，35例），突变组为0.26（－0.61～1.06，58例），差异有统计学意义（Z=4.34，P＜0.001）。配对比较治疗前后BALF log10MP-DNA载量的变化情况，治疗2～3天（≤3天）后复查未突变组下降明显，下降值0.73（0.27～1.48，11例），差异有统计学意义（Z=2.49，P=0.013）；突变组下降值－0.37（－1.19～0.31，22例），治疗前后比较，差异无统计学意义（Z=1.53，P=0.126）。治疗＞3天后，未突变组与突变组BALF log10 MP-DNA载量下降值分别为 2.08（1.38～2.65，24例）和0.54（0.08～1.47，36例），两组治疗前后比较，差异均有统计学意义（Z=3.65、2.11，P均＜0.05）。
表2 两组患儿临床资料比较临床资料 未突变组(n=142) 突变组(n=155) 统计量 P年龄[M(P25～P75)]/岁 4(2～7) 5(3～7) Z=0.73 0.464年龄段[n(%)] χ2=6.60
0.086 1月～ 11(7.7) 5(3.2)1岁～ 34(23.9) 29(18.7)3岁～ 57(40.1)
82(52.9)7～14岁 40(28.1) 39(25.1)性别[n(%)]χ2=2.07 0.150男85(59.8)
81(52.2)女57(40.2) 74(47.8)重症MPP[n(%)] 122(85.9) 140(90.3) χ2=1.38
0.239 RMPP[n(%)] 56(39.4) 67(43.2) χ2=0.43 0.508起病至入院时病程[M(P25～P75)]/d 7(6,14) 7(6,10) Z=0.35 0.723 WBC×109/L[M(P25～P75)]
9.16(6.69,11.64) 8.34(6.44,10.56) Z=1.53 0.125 CRP[M(P25～P75)]/mg·L－1
9.92(1.06,24.0) 11.90(2.71,30.15) Z=1.14 0.252 LDH[M(P25～P75)]/U·L－1
300.7(260.5,378.0) 337.1(268.2,436.8) Z=2.16 0.031 D二聚体[M(P25～P75)]/mg·L－1 0.21(0.0,0.80) 0.36(0.0,1.40) Z=1.68 0.093纤维支气管镜灌洗次数[M(P25～P75)]/次 1(1,2) 1(1,2) Z=1.15 0.246 log10 MP-DNA(±s )
5.08±2.07 6.96±1.74 t=8.39 ＜0.001合并糜烂/塑型/灰白痰栓[n(%)] 42(29.5)
48(30.9) χ2=0.07 0.795影像检查有片状高密度灶/实变[n(%)] 53(37.3) 51(32.9)
χ2=0.64 0.425混合感染率[n(%)] 32(22.5) 30(19.3) χ2=0.45 0.501
表3 两组不同病程BALF log10 MP-DNA载量比较(±s )未突变组 突变组DNA 例数 log10 MPDNA≤7 d 30 6.101.98 26 7.401.66 2.81 0.007＞7 d 67 5.641.97
105 7.111.61 5.11 ＜0.001＞14 d 45 3.691.40 24 5.781.97 4.59 ＜0.001病程t值 P例数 log10 MP-
2.4 治疗及疗效
所有患儿均好转出院。未突变组平均住院时间为8（6～10）天，发热时间为5（2～7）天，使用大环内酯类抗生素后退热时间为1（0～2）天；突变组平均住院时间9（7～10）天，发热时间为7（5～9）天，使用大环内酯类抗生素后退热时间为2（0～4）天。以上3项指标两组之间比较，差异均有统计学意义（Z=2.26～3.21，P均＜0.05）。
未突变组入院前使用大环内酯类抗生素53例（49.5%），突变组90例（66.1%），两组差异有统计学意义（χ2=13.63，P＜0.001）。两组治疗过程中均有更换抗MP药物的情况，即将阿奇霉素或红霉素更换成克拉霉素或多西环素继续治疗，突变组抗MP药物更换率高于未突变组，但差异无统计学意义（χ2=2.10，P=0.147）；联合糖皮质激素治疗者突变组74例（47.7%），未突变组57例（40.1%），两组比较差异无统计学意义（χ2=1.74，P=0.188）。
2.5 多因素logistic回归分析结果
将未突变组与突变组两组比较具有统计学意义的指标，包括LDH、BALF MP-DNA载量、入院前大环内酯类药物使用率、住院时间、发热时间及使用大环内酯类药物后退热时间纳入logistic回归分析，结果显示，使用大环内酯类药物后退热时间（OR=2.28，95%CI=1.39～3.73，P=0.001）以及MP-DNA载量（OR=2.82，95%CI=1.87～4.25，P＜0.001）与耐药突变具有相关性。
3 讨论
大环内酯类抗生素是临床上治疗儿童MP感染的一线药物，其中红霉素及其衍生物最为常用，但大环内酯类抗菌药物耐药日趋增多，在中国尤为突出。有学者认为多数耐药组患儿继续使用大环内酯类抗生素仍然有效[10-12]，因为阿奇霉素胞内浓度高，可达到或超过耐药MP的最小抑菌浓度（MIC），因此耐药MP感染的MPP患儿治疗仍首选阿奇霉素[13]。有研究发现，MP对大环内酯类抗生素耐药率达84%（48/57），但使用阿奇霉素治疗后均显示有效[14]。本研究突变组和未突变组患儿更换成大环内酯类抗生素以外其他抗MP药物的比率为15.4%和9.8%，但差异无统计学意义，也肯定了大环内酯类抗生素对部分耐药MP的治疗效果。日本的一项流行病学调查显示，对大环内酯类抗生素耐药的MPP患儿在治疗开始后48小时内退热，而持续发热的患儿中约70%为耐药株感染者[15]，本研究大环内酯类抗生素药物疗效与该报道相似。本研究也发现突变组患儿住院时间、发热时间、使用大环内酯类抗生素后的退热时间延长，进一步证实耐药突变延长MPP患儿的治疗时间[16-21]，对符合条件的患儿及早更换敏感抗MP药物对提高治疗效果仍有积极意义。本研究突变组患儿发生重症肺炎（90.3%）以及RMPP（85.9%）比例均较未突变组增高，但差异无统计学意义（P＞0.05），与既往部分学者研究结论不同。考虑原因可能为：①各研究监测的耐药突变位点不完全相同；②所纳入的重症肺炎或RMPP的参考标准不全一致；③对耐药MPP的研究多为回顾性研究，不同课题组所采用的治疗方式可能不尽相同，如糖皮质激素使用情况、纤维支气管镜灌洗治疗率及联合其他抗菌药物使用情况不一致等，疗效可能有差异。
一般认为，MPP患儿WBC多在正常范围，重症患儿的WBC可增高或降低，而CRP值在RMPP或重症MPP患儿中多明显升高[5]，LDH水平可作为MPP使用糖皮质激素的参考指标[22-23]。本研究患儿WBC均值9.2×109/L（32.9%患儿高于正常参考范围），CRP均值21.8 mg/L（70.7%患儿高于正常参考范围），
LDH均值362.1 U/L（84.1%患儿高于正常参考范围），因所纳入病例重症MPP（262例，88.2%）所占比例高，因此结论仍符合MPP患儿感染特点。另外突变组LDH水平明显高于未突变组（P＜0.05），但WBC及CRP水平差异无统计学意义，其他实验室指标如D二聚体水平、平均纤维支气管镜肺泡灌洗治疗次数、影像检查有片状高密度灶/肺实变比率以及纤维支气管镜下合并严重病变的比例均无显著差异。既往研究发现，耐药MPP患儿CRP值更高，但WBC、发生叶或段实变比例与敏感组相比无显著差异[24-25]。中国台湾学者的报道则提示，两组患者临床及实验室指标比较均无显著差异[16,26]。
本研究显示，在MPP病程第2周（8～14天）行纤维支气管镜肺泡灌洗治疗的患儿比例增多，突变组105例，未突变组67例，且以突变组居多，耐药突变检出率达 61.0%（105/172），提示耐药株感染的MPP患儿在病程第2周临床症状及肺部损害可能持续不缓解甚至有加重趋势。同时突变组患儿入院前大环内酯类抗生素使用率高于未突变组，这一因素是否影响耐药突变检出率仍需进一步研究。
相关研究显示耐药株感染MPP在持续发热、咳嗽或胸部影像学加重情况下，用妥舒沙星或米诺环素替代大环内酯类抗生素治疗后MP-DNA载量快速下降[27-28]，在一定程度上反映耐药MP与MP-DNA 载量有相关性。另有研究者在230例MPP患儿中检测到2063（A、C、G、T）4组基因型菌株，并发现突变组（基因型为C、G和T）患儿MP-DNA载量高于未突变组（基因型为A），但是3种碱基突变之间MP-DNA载量比较无显著差异；对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素耐药的MPP患儿MP-DNA载量高于非耐药（敏感或中介）组[29]。本研究也发现发生A2063G突变的MPP患儿BALF MP-DNA载量高于未突变组，随着病程的延长两组MP-DNA载量均呈下降趋势。大环内酯类抗生素治疗后未突变组患儿MP载菌量下降较明显，治疗2～3天后MP-DNA载量即出现显著下降，而此时突变组治疗前后载量下降不明显，甚至有部分病例出现MP-DNA载量上升
的情况，说明突变组患儿对大环内酯类抗生素治疗反应不佳。随着治疗时间延长，两组患儿治疗前后MP-DNA载量均有显著差异，与肺组织损伤后修复及机体对病原体的逐渐清除有关。可见观察BALF 中MP-DNA载量及其动态变化在一定程度上可反映MP耐药性。
本研究对突变组与未突变组有统计学意义的临床指标进行logistic回归分析发现，使用大环内酯类抗生素后退热时间以及BALF MP-DNA载量与耐药突变存在相关性，因此对抗感染治疗后持续发热、MPDNA载量明显增高、治疗后下降缓慢甚至持续增高的患儿需警惕耐药MP感染，可能需要延长治疗时间或更换其他敏感药物。
综上所述，本研究发现，发生23 S rRNA V区A2063G耐药基因突变的MPP患儿与无突变者相比，发热持续时间、住院时间及使用大环内酯类抗生素后退热时间延长，BALF MP-DNA载量更高且大环内酯类抗生素治疗后BALF MP-DNA载量下降缓慢，追踪观察MPP患儿使用大环内酯类药物后的退热时间、BALF MP-DNA载量及其治疗后的下降程度可能对判断MP耐药突变有指导意义。但纤维支气管镜检测为有创操作，受到适用条件限制，不能早期采集BALF标本进行MP-DNA定量检测，鼻咽拭子MP-DNA载量测定定量虽误差较大但获取相对简便，本研究没有对鼻咽拭子MP-DNA载量变化做追踪观察，有待以后进一步研究探讨。
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