2024年3月11日发(作者：权星津)
OA-2500S手性柱拆分3种氨基酸对映体
董斌;姜珍;梁爱仙;贾茵农;郭兴杰
【摘 要】目的 建立了柱前衍生结合手性固定相HPLC法拆分了天冬酰胺(Asn)、
蛋氨酸(Met)、色氨酸(Trp)3种氨基酸对映体.方法 利用4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并
噁二唑(NBD-Cl)柱前衍生,采用Sumichiral OA-2500S色谱柱,以甲醇-乙腈
(50∶50,含5 mmol·L-1柠檬酸)为流动相,在470 nm波长下检测.结果 在最佳色谱
条件下,3种氨基酸对映体均达到了基线分离.结论 方法灵敏度高,重现性好.
【期刊名称】《西北药学杂志》
【年(卷),期】2010(025)005
【总页数】3页(P325-327)
【关键词】天冬酰胺;蛋氨酸;色氨酸;NBD-Cl;HPLC
【作 者】董斌;姜珍;梁爱仙;贾茵农;郭兴杰
【作者单位】沈阳药科大学药学院,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学药学院,辽宁,沈
阳,110016;沈阳药科大学药学院,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学药学院,辽宁,沈
阳,110016;沈阳药科大学药学院,辽宁,沈阳,110016
【正文语种】中 文
【中图分类】R917
氨基酸的对映体分离[1]在蛋白质和多肽的研究、有机化学中的不对称合成以及医
药、食品、卫生等领域都具有重要意义。近年来,对氨基酸对映体的分离研究已得
到普遍关注,常用的有手性固定相法[2]、手性衍生化法等。因为大部分氨基酸无紫
外吸收,故笔者采用衍生化试剂NBD-Cl先对其进行柱前衍生,再通过含有手性选择
剂(S)-萘基甘氨酸的OA-2500S色谱柱进行对映体分离。笔者对衍生化条件进行
了考察,并优化了手性分离的色谱条件。在最佳色谱条件下,3种氨基酸衍生物对映
体均达到了完全分离。
1 仪器和试药
1.1 仪器 高效液相色谱仪(PU-2080型高压泵和UV-2075型紫外检测器,日本分光
公司);Sepu3000色谱工作站(山东金普分析仪器有限公司)。
1.2 试药 L-蛋氨酸和L-色氨酸(中国药品生物制品检定所,批号分别为140648-
200401,140686-200401);D-蛋氨酸(New Jersey,Lot:A0276602);D-色氨酸
(Sigma-Aldrich,Lot:1386222);DL-天冬酰胺(中国惠兴生化试剂有限公司,批号
091022);NBD-Cl(New Jersey,USA);甲醇 、乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司
化工分公司);其它试剂均为化学纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:Sumichiral OA-2500S柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m);流动
相:甲醇-乙腈(50 ∶50,含5 mmol·L-1柠檬酸);流速:0.5 mL·min-1;柱温:室温;检测
波长:470 nm;进样量:20 μ L。
2.2 溶液制备 (1)pH8.5硼酸盐缓冲溶液 称取约0.62 g硼酸溶于50 mL水中,用
0.1 mmol·L-1氢氧化钠调pH至8.5,再用水定容至100 mL。
(2)氨基酸供试品溶液 精密称取两种L-氨基酸和D-氨基酸适量,相应对映体混合后
分别用水溶解制成DL-氨基酸浓度为5 mmol·L-1的贮备液;精密称取DL-天冬酰
胺适量,用水溶解制成浓度为5 mmol·L-1的贮备液,置4℃冰箱中保存。使用时,取
100 μ L贮备液,加入400 μ L硼酸盐缓冲液制成浓度为1 mmol·L-1的溶液。
(3)NBD-Cl溶液 精密称取NBD-Cl适量,用甲醇溶解并配制成浓度为16 mmol·L-1
的溶液,置4℃冰箱中避光保存。
2.3 衍生化 取氨基酸供试品溶液100 μ L,加入NBD-Cl溶液100 μ L,60℃水浴中
避光反应1 h,4℃冷却,加入流动相至5.0 mL,过0.2 μ m 滤膜。
2.4 分离条件的选择
2.4.1 甲醇与乙腈的比例对拆分的影响 笔者考察了甲醇与乙腈比例对3种氨基酸对
映体分离的影响(表1)。由表1可知,在乙腈比例为30%～50%范围内,随着乙腈比
例的增加,氨基酸对映体保留时间缩短,分离度逐渐增大;当乙腈含量超过50%时,分
离度(R)变化不明显且略有降低;乙腈比例对保留因子(α)影响不大。因此最终选择甲
醇-乙腈(50∶50)作为流动相。
表1 甲醇与乙腈的比例对氨基酸分离和保留情况的影响tR2:L-氨基酸的保留时间
甲醇-乙腈比例Asn tR2 R α Met tR2 R α Trp tR2 R α 70∶30 28.3 2.27
1.11 26.7 3.72 1.18 29.6 2.92 1.14 60∶40 27.4 2.31 1.12 24.6 3.78
1.18 27.4 3.01 1.15 50∶50 26.1 2.34 1.12 22.6 3.85 1.18 24.7 3.01
1.15 40∶60 25.7 2.28 1.12 20.1 3.81 1.18 22.9 2.96 1.15
2.4.2 柠檬酸浓度对拆分的影响 实验中发现,用甲酸、醋酸替代柠檬酸加入到流动
相中,氨基酸对映体均能达到完全分离,但只有含有柠檬酸的流动相能获得更好的峰
形。笔者参考文献[3]方法考察了柠檬酸浓度在2.5～10 mmol·L-1范围内变化对
氨基酸对映体分离的影响。发现增加柠檬酸浓度对分离度有少许改善。考虑到低酸
浓度对色谱柱有保护作用,最终选择柠檬酸浓度为5 mmol·L-1。
在最佳色谱条件下进样,Asn、Met和Trp 3种氨基酸对映体分离色谱图见图1。
经与左旋氨基酸保留时间对照,3种氨基酸均为右旋体先被洗脱。
图1 3种氨基酸对映体拆分典型色谱图A-天冬酰胺;B-蛋氨酸;C-色氨酸;1-D-氨基
酸;2-L-氨基酸
2.5 方法学考察 本文建立了HPLC结合手性固定相法拆分了3种消旋氨基酸,并对
这一方法进行了方法学验证。考察了线性关系、定量限、重复性、精密度以及稳定
性。以右旋体计,Asn、Met、Trp 3种氨基酸在1～8 mg·L-1(Asn在2～6 mg·L-
1)范围内线性关系良好(r≥0.999 5),定量限分别为40,18和8 ng;同一供试品溶液
连续进样6次,峰面积RSD≤1.5%;按2.3项下方法平行制备6份供试品溶液,各氨
基酸对映体峰面积的RSD≤2.0%;衍生化产物室温放置,至少在8 h内稳定。
2.6 衍生化方法优化 影响NBD-Cl衍生化条件为:衍生化试剂浓度、衍生溶液pH
值、衍生化温度及时间,笔者参照文献[4]对衍生化条件进行了优化。
2.6.1 衍生试剂浓度对反应的影响 本实验考察了氨基酸与衍生化试剂摩尔浓度比在
1∶4～1∶20范围内衍生化试剂浓度对反应的影响,当NBD-Cl浓度为16 mmol·L-
1时,衍生化产率最高。
2.6.2 衍生溶液pH值对反应的影响 氨基酸与NBD-Cl的反应需要在碱性的条件下
进行。笔者考察了在pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0的条件下进行反应时氨基酸
衍生物峰面积的变化。结果表明,随着pH增加,峰面积显著增加,但在pH8.5以上,
衍生化副产物(NBD-OH)峰面积明显增加,因此最终选择在pH8.5条件下进行衍生
化反应,既能得到较高的反应产物收率,又能避免衍生剂副产物的过量生成。
2.6.3 衍生化温度、时间对反应的影响 在40～70℃之间,分别考察了相同时长衍生
化反应的效率。而后在同一温度下分别避光反应40,50,60,70和80 min。结果显
示,随着反应温度与时间的增加,峰面积明显增大。但在70℃时有副产物出现,而且
在60℃以上,色谱峰面积呈现缓和变化趋势,为了避免因温度过高和反应时间过长产
生衍生化副产物,最终选择60℃避光反应1 h。
3 讨论
本文优化了 NBD-Cl与 Asn、Met、Trp三种氨基酸衍生反应的条件,并考察了各
氨基酸衍生物在(S)-萘基甘氨酸手性固定相上的拆分条件。结果表明,3种氨基酸对
映体均能在Sumichiral OA-2500S手性柱上达到完全分离。本法简单,灵敏,适合
于氨基酸的对映体分离研究。
参考文献:
【相关文献】
[1] 张莹,张阳阳,杨奇,等.氨基酸对映体拆分的研究进展[J].辽宁大学学报,2002,29(3):193-197.
[2] 傅强,贺浪冲,常春.人血清蛋白键合固定相的合成及DL(±)氨基酸的手性HPLC分离[J].西北药学
杂志,1997,12(3):99-101.
[3] A Morikawa1,K Hamase1,T Inoue,et tions in D-amino acid levels in the brains
of mice and rats after the administration of D-amino acids[J].Amino Acids,2007,32:13-20.
[4] 杨彩玲,张海霞,刘满仓.样品前处理技术在色谱分析中的应用[D].兰州大学,2008.
2024年3月11日发(作者：权星津)
OA-2500S手性柱拆分3种氨基酸对映体
董斌;姜珍;梁爱仙;贾茵农;郭兴杰
【摘 要】目的 建立了柱前衍生结合手性固定相HPLC法拆分了天冬酰胺(Asn)、
蛋氨酸(Met)、色氨酸(Trp)3种氨基酸对映体.方法 利用4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并
噁二唑(NBD-Cl)柱前衍生,采用Sumichiral OA-2500S色谱柱,以甲醇-乙腈
(50∶50,含5 mmol·L-1柠檬酸)为流动相,在470 nm波长下检测.结果 在最佳色谱
条件下,3种氨基酸对映体均达到了基线分离.结论 方法灵敏度高,重现性好.
【期刊名称】《西北药学杂志》
【年(卷),期】2010(025)005
【总页数】3页(P325-327)
【关键词】天冬酰胺;蛋氨酸;色氨酸;NBD-Cl;HPLC
【作 者】董斌;姜珍;梁爱仙;贾茵农;郭兴杰
【作者单位】沈阳药科大学药学院,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学药学院,辽宁,沈
阳,110016;沈阳药科大学药学院,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学药学院,辽宁,沈
阳,110016;沈阳药科大学药学院,辽宁,沈阳,110016
【正文语种】中 文
【中图分类】R917
氨基酸的对映体分离[1]在蛋白质和多肽的研究、有机化学中的不对称合成以及医
药、食品、卫生等领域都具有重要意义。近年来,对氨基酸对映体的分离研究已得
到普遍关注,常用的有手性固定相法[2]、手性衍生化法等。因为大部分氨基酸无紫
外吸收,故笔者采用衍生化试剂NBD-Cl先对其进行柱前衍生,再通过含有手性选择
剂(S)-萘基甘氨酸的OA-2500S色谱柱进行对映体分离。笔者对衍生化条件进行
了考察,并优化了手性分离的色谱条件。在最佳色谱条件下,3种氨基酸衍生物对映
体均达到了完全分离。
1 仪器和试药
1.1 仪器 高效液相色谱仪(PU-2080型高压泵和UV-2075型紫外检测器,日本分光
公司);Sepu3000色谱工作站(山东金普分析仪器有限公司)。
1.2 试药 L-蛋氨酸和L-色氨酸(中国药品生物制品检定所,批号分别为140648-
200401,140686-200401);D-蛋氨酸(New Jersey,Lot:A0276602);D-色氨酸
(Sigma-Aldrich,Lot:1386222);DL-天冬酰胺(中国惠兴生化试剂有限公司,批号
091022);NBD-Cl(New Jersey,USA);甲醇 、乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司
化工分公司);其它试剂均为化学纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:Sumichiral OA-2500S柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m);流动
相:甲醇-乙腈(50 ∶50,含5 mmol·L-1柠檬酸);流速:0.5 mL·min-1;柱温:室温;检测
波长:470 nm;进样量:20 μ L。
2.2 溶液制备 (1)pH8.5硼酸盐缓冲溶液 称取约0.62 g硼酸溶于50 mL水中,用
0.1 mmol·L-1氢氧化钠调pH至8.5,再用水定容至100 mL。
(2)氨基酸供试品溶液 精密称取两种L-氨基酸和D-氨基酸适量,相应对映体混合后
分别用水溶解制成DL-氨基酸浓度为5 mmol·L-1的贮备液;精密称取DL-天冬酰
胺适量,用水溶解制成浓度为5 mmol·L-1的贮备液,置4℃冰箱中保存。使用时,取
100 μ L贮备液,加入400 μ L硼酸盐缓冲液制成浓度为1 mmol·L-1的溶液。
(3)NBD-Cl溶液 精密称取NBD-Cl适量,用甲醇溶解并配制成浓度为16 mmol·L-1
的溶液,置4℃冰箱中避光保存。
2.3 衍生化 取氨基酸供试品溶液100 μ L,加入NBD-Cl溶液100 μ L,60℃水浴中
避光反应1 h,4℃冷却,加入流动相至5.0 mL,过0.2 μ m 滤膜。
2.4 分离条件的选择
2.4.1 甲醇与乙腈的比例对拆分的影响 笔者考察了甲醇与乙腈比例对3种氨基酸对
映体分离的影响(表1)。由表1可知,在乙腈比例为30%～50%范围内,随着乙腈比
例的增加,氨基酸对映体保留时间缩短,分离度逐渐增大;当乙腈含量超过50%时,分
离度(R)变化不明显且略有降低;乙腈比例对保留因子(α)影响不大。因此最终选择甲
醇-乙腈(50∶50)作为流动相。
表1 甲醇与乙腈的比例对氨基酸分离和保留情况的影响tR2:L-氨基酸的保留时间
甲醇-乙腈比例Asn tR2 R α Met tR2 R α Trp tR2 R α 70∶30 28.3 2.27
1.11 26.7 3.72 1.18 29.6 2.92 1.14 60∶40 27.4 2.31 1.12 24.6 3.78
1.18 27.4 3.01 1.15 50∶50 26.1 2.34 1.12 22.6 3.85 1.18 24.7 3.01
1.15 40∶60 25.7 2.28 1.12 20.1 3.81 1.18 22.9 2.96 1.15
2.4.2 柠檬酸浓度对拆分的影响 实验中发现,用甲酸、醋酸替代柠檬酸加入到流动
相中,氨基酸对映体均能达到完全分离,但只有含有柠檬酸的流动相能获得更好的峰
形。笔者参考文献[3]方法考察了柠檬酸浓度在2.5～10 mmol·L-1范围内变化对
氨基酸对映体分离的影响。发现增加柠檬酸浓度对分离度有少许改善。考虑到低酸
浓度对色谱柱有保护作用,最终选择柠檬酸浓度为5 mmol·L-1。
在最佳色谱条件下进样,Asn、Met和Trp 3种氨基酸对映体分离色谱图见图1。
经与左旋氨基酸保留时间对照,3种氨基酸均为右旋体先被洗脱。
图1 3种氨基酸对映体拆分典型色谱图A-天冬酰胺;B-蛋氨酸;C-色氨酸;1-D-氨基
酸;2-L-氨基酸
2.5 方法学考察 本文建立了HPLC结合手性固定相法拆分了3种消旋氨基酸,并对
这一方法进行了方法学验证。考察了线性关系、定量限、重复性、精密度以及稳定
性。以右旋体计,Asn、Met、Trp 3种氨基酸在1～8 mg·L-1(Asn在2～6 mg·L-
1)范围内线性关系良好(r≥0.999 5),定量限分别为40,18和8 ng;同一供试品溶液
连续进样6次,峰面积RSD≤1.5%;按2.3项下方法平行制备6份供试品溶液,各氨
基酸对映体峰面积的RSD≤2.0%;衍生化产物室温放置,至少在8 h内稳定。
2.6 衍生化方法优化 影响NBD-Cl衍生化条件为:衍生化试剂浓度、衍生溶液pH
值、衍生化温度及时间,笔者参照文献[4]对衍生化条件进行了优化。
2.6.1 衍生试剂浓度对反应的影响 本实验考察了氨基酸与衍生化试剂摩尔浓度比在
1∶4～1∶20范围内衍生化试剂浓度对反应的影响,当NBD-Cl浓度为16 mmol·L-
1时,衍生化产率最高。
2.6.2 衍生溶液pH值对反应的影响 氨基酸与NBD-Cl的反应需要在碱性的条件下
进行。笔者考察了在pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0的条件下进行反应时氨基酸
衍生物峰面积的变化。结果表明,随着pH增加,峰面积显著增加,但在pH8.5以上,
衍生化副产物(NBD-OH)峰面积明显增加,因此最终选择在pH8.5条件下进行衍生
化反应,既能得到较高的反应产物收率,又能避免衍生剂副产物的过量生成。
2.6.3 衍生化温度、时间对反应的影响 在40～70℃之间,分别考察了相同时长衍生
化反应的效率。而后在同一温度下分别避光反应40,50,60,70和80 min。结果显
示,随着反应温度与时间的增加,峰面积明显增大。但在70℃时有副产物出现,而且
在60℃以上,色谱峰面积呈现缓和变化趋势,为了避免因温度过高和反应时间过长产
生衍生化副产物,最终选择60℃避光反应1 h。
3 讨论
本文优化了 NBD-Cl与 Asn、Met、Trp三种氨基酸衍生反应的条件,并考察了各
氨基酸衍生物在(S)-萘基甘氨酸手性固定相上的拆分条件。结果表明,3种氨基酸对
映体均能在Sumichiral OA-2500S手性柱上达到完全分离。本法简单,灵敏,适合
于氨基酸的对映体分离研究。
参考文献:
【相关文献】
[1] 张莹,张阳阳,杨奇,等.氨基酸对映体拆分的研究进展[J].辽宁大学学报,2002,29(3):193-197.
[2] 傅强,贺浪冲,常春.人血清蛋白键合固定相的合成及DL(±)氨基酸的手性HPLC分离[J].西北药学
杂志,1997,12(3):99-101.
[3] A Morikawa1,K Hamase1,T Inoue,et tions in D-amino acid levels in the brains
of mice and rats after the administration of D-amino acids[J].Amino Acids,2007,32:13-20.
[4] 杨彩玲,张海霞,刘满仓.样品前处理技术在色谱分析中的应用[D].兰州大学,2008.