2024年3月18日发(作者：岳香天)
中国细胞生物学学报
Chinese
Journal
of
Cell
Biology
2021,43(2): 378-384
DOI
: 10.11844/
cjcb
.2021.02.0013
技术与方法
EL
转染试剂转染食管鱗癌细胞的条件优化
俞晓炜
1
李停
2
李周儒
1
王炳皓
1
马静媛
1
张浩洋
3
章耀3蔡红星
C
徐州医科大学基础医学院法医学教研室，徐州
221000"
徐州医科大学公共平台实验中心，徐州
221000;
3
徐州医科大学临床学院，徐州
221000)
摘要 该文探讨了关于
EL
转染试剂转染
Hsa
-
miR
-6743质粒至食管鱗癌细胞转染效果的影响
标记的
Hsa
-
miR
-6743为报告 因素。以食管鳞癌细胞株
Eca
-109、
TE
-1和
Eca
-9706为研究对象，
基因，通过倒置荧光显微镜检测荧光信号优化转染试剂和质粒比值。结果表明，食管鳞癌细胞的种
类影响
EL
转染试剂的转染效果，
EL
转染试剂在
Eca
-109细跑株中的转染效果最好，在另外两种细胞
中转染效果不佳。在
Eca
-109细胞株中，转染效果最佳检测时间为转染36
h
时，细胞存活情况不受转
染试剂影响。
EL
转染试剂与
Hsa
-
miR
-6743质粒最佳转染比例范围为1:4〜1:2。
EL
转染试剂的转染
效果受细胞种类、转染试剂与质粒比值以及转染时间的影响。
关键词食管鳞癌细胞；阳离子聚合物转染试剂;基因转染;细胞内吞;细胞种类
Optimization of Transfection Condition of the EL Transfection Reagent in
Esophageal Squamous Cells
YU
Xiaowei
1,
LI
Ting
2,
LI
Zhouru
1,
WANG
Binghao
1,
MA
Jingyuan
1,
ZHANG
Haoyang
3,
ZHANG
Yao
3,
CAI
Hongxing
1*
{^'Department of Forensic Medicine, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, China,2 Public Experimental Research Center,
Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, China;yClinical College, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, China)
Abstract
This
study
aimed
to
explore
the
influencing
factor
on
the
transfection
effects
of
EL
transfection
reagent
,
which
was
used
to
transfect
Hsa
-
miR
-6743
plasmid
into
esophageal
squamous
cells
.
The
esophageal
squa
mous
cells
Eca
-109,
TE
-1
and
Eca
-9706
were
chosen
as
the
research
objects
.
Hsa
-
miR
-6743
marked
by
GFP
(green
fluorescent
protein
)
was
selected
as
a
reporter
gene
.
The
fluorescence
signals
were
detected
by
inverted
fluorescence
microscopy
to
optimize
the
proportion
of
transfection
reagent
and
plasmid
.
The
results
turned
out
that
the
transfec
tion
efficiency
of
EL
transfection
reagent
was
influnced
by
cell
types
of
esophageal
squamous
cells
.
The
transfec
tion
efficiency
of
EL
transfection
reagent
in
Eca
-109
cells
was
better
than
that
in
other
two
cells
.
The
best
detection
time-point
of
the
optimal
transfection
efficiency
was
at
36
h
in
Eca
-109
cells
,
and
cell
viability
was
not
affected
by
EL
transfection
reagent
.
The
optimal
transfection
ratio
of
EL
transfection
reagent
to
Hsa
-
miR
-6743
plasmid
ranged
from
1：4
to
1：2.
The
transfection
efficiency
of
EL
transfection
reagent
was
affected
by
cell
types
,
the
ratio
of
trans
-
收稿日期
:2020-06-03
接受日期
:2020-
丨
1-23
上海市法医学重点实验室暨司法部司法鉴定重点实验室幵放课题
(
批准号
:KF202004)
资助的课题
*
通讯作者。
Tel*************,E-mail:*******************
Received: June 3, 2020 Accepted: November 23, 2020
This work was supported by the Fund of Shanghai Key Laboratory of Forensic Science and Key Laboratory of Academy of Forensic Science (Grant N
〇
.KF202004)
* :+86-516-5580717,E-mail:*******************
URL: /?id=5463
俞晓炜等:
EL
转染试剂转染食管鳞癌细胞的条件优化
379
fection
reagent
to
plasmid
,
and
transfection
time
.
Keywords
esophageal
squamous
cells
;
cationic
polymer
transfection
reagent
;
gene
transfection
;
endocy
-
tosis
;
cell
type
细胞转染技术是将外源性的遗传物质导入至真
核细胞内并进行基因表达的一项技术。根据对转染
载体的区分，现有的细胞转染技术可分为非病毒载体
转染和病毒载体转染。其中病毒载体转染是通过病
毒载体，例如逆转录病毒或腺病毒，将核酸分子递送
至细胞中。病毒载体转染因其具有转染效率高、稳
定性高、细胞毒性低的特点而被认为是最先进的转
染技术，但是病毒载体转染操作复杂，有致癌和感染
的可能性等生物安全因素而限制了其应用[11。为了解
决这一问题，非病毒载体被用作替代的转染方法，非
病毒载体主要包括阳离子脂质体、阳离子聚合物和
阳离子肽，虽转染效率相对较低,但其安全性高，操作
简便，因而被广泛运用于
DNA
以及
RNA
的转染中
阳离子聚合物由于缺乏免疫原性，在包装不同
种类和大小的核酸方面具有灵活性，因其具有易于
大规模合成、便于降解等优点而被广泛用作非病
毒基因载体[51。阳离子聚合物被运用到多种细胞的
转染之中，携带正电荷的载体通过压缩带负电荷的
核酸分子，在大多数情况下形成体积相对小且稳定
的纳米复合物(
polyplexes
),使核酸免受核酸酶的降
解，并且可与细胞表面蛋白多糖相互作用从而进入
细胞16_81。转染效率受诸多因素影响，其中包括细胞
所处周期、生长状态、铺板密度、载体的化学性质、
摄取机制和细胞内递送途径、载体与质粒的配比
以及质粒的纯度和浓度等
在本研宂中，我们着眼于非病毒转染载体，选
择了细胞毒性低、操作灵活、易于合成的
EL
转染
试剂，通过探索阳离子聚合物转染试剂
EL
在食管鱗
癌三种细胞
Eca
-109、
Eca
-9706、
TE
-丨中的转染效果，
检测转染效果显示的最佳时间，优化该种试剂的使
用条件。本项研宂可以为肿瘤细胞选择转染试剂提
供更丰富的理论依据，以期在保证转染效率的情况
下获得最优的转染效果，为之后进行细胞系的稳定
转染奠定基础。
1材料方法
1.1细胞株与主要试剂
人食管鳞癌细胞株
Eca
-109、
TE
-丨购自武汉
Procell
公司。
Eca
-9706细胞株由徐州医科大学形
态学实验室保存。
Translntro
™
EL
Transfection
Re
agent
购自北京全式金生物技术有限公司 。质粒中提
试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。标记有
绿色焚光蛋白
(green
fluorescent
protein
,
GFP
)
Hsa
-
miR
-6743质粒购自
GenePharma
公司。
Opti-DMEM
培养基购自美国
Gibco
公司。
RPMI
1640完全培养基
和
DMEM
高糖培养基购自南京凯基科技有限公司。
胎牛血清
(fatal
bovine
serun
,
FBS
)购自美国
CLARK
公司。
CCK
-8试剂购自大连美仑生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1
质粒栽体的扩增
用
LB
培养基扩大培养含
有
Hsa
-
miR
-6743质粒的菌液。按照质粒中提试剂盒
说明书提取并纯化质粒，通过紫外分光光度计测定
质粒的浓度和纯度。用滤膜(0.22 (
im
微孔)过滤除菌。
1.2.2
细胞培养
Eca
-109、
TE
-1、
Eca
-9706细胞培
养液成分均为
RPMI
1640完全培养基(含10%
FBS
、
1%双抗)，于37 °
C
、5%
C
02培养箱中培养，每隔1〜2
天用0.25%胰酶消化传代。
1.2.3
细胞转染
取处于对数生长期的
Eca
-109、
TE
-1、
Eca
-9706细胞，经0.25%胰酶消化，当细胞浓度
为
lxlO
5个/
mL
时,接种于96孔板中(100
nLV
孔)。当每孔
细胞密度达到70%左右时进行转染。
转染时移去生长培养基，用
PBS
清洗之后加入
等量
DMEM
空培养基(无血清、无双抗)。
以％孔板中1孔为例：
(1) 将0.2
pg
Hsa
-
miR
4743质粒稀释于 10
pLOpti
-
MEM
培养基中；
(2) 选取
EL
转染试剂（
nL
)与质粒
Hsa
-
m
6743((
ig
)比例分别为1:丨、1:2、1:3和1:4,即将0.2、
0.4、0.6、0.8
(xg
Hsa
-
miR
-6743质粒稀释于200
pL
Opti
-
MEM
培养基(该步骤用于观察不同质粒比例对
Eca
-109细胞转染效率的影响实验，其余实验略过该
步骤)；
(3) 取0.2吣
EL
转染试剂加入到稀释好的质粒
中，轻柔摇匀，于室温静置15~20
min
,将质粒转染试
剂复合物加入到细胞中。
于37 °
C
、5%
C
02培养箱中培养4〜5
h
,更换新
iR
-
380•技术与方法•
鲜培养基(含10%
FBS
和1%双抗)，继续培育。
1.2.4
转染效率测定
细胞转染后，采用倒置荧光
显微镜进行拍摄，每个视野分别在可见光和488
nm
激发光激发下拍照，图像处理工具为
Image
对绿色
荧光强度进行统计，每次实验随机选取3个具有代表
性的视野进行观察计算(实验独立重复3次)。使用荧
光积分光密度
(integral
optical
density
,
IOD
)量化转染
效果。荧光积分光密度可反映转染成功的细胞表达
的
GFP
总强度，反映细胞转染总程度。
GFP
表达阳
性细胞越多，荧光强度越强，表明转染成功的程度越
高。
计学意义。
2 结果
2.1不同食管鳞癌细胞株中的转染差异
为了观察转染细胞的种类是否会影响
EL
转染
试剂的转染效果，将含告基因的
Hsa
-
miR
-6743
质粒以
EL
/
DNA
复合体形式分别递送至
Eca
-109、
Eca
-9706和
TE
-1三种细胞系，阳性细胞发出明亮
的绿色荧光信号。按照
EL
转染试剂说明书的推
荐，转染24
h
后，在倒置荧光显微镜下观察到的
Eca
-109、
Eca
-9706和
TE
-1三种细胞的细胞状态以
1.2.5
细胞存活率测定
细胞转染后于96孔板加
及
GFP
表达情况如图1所示。三种细胞转染后的生
长存活状态均未发生明显改变，
Eca
-9706、
TE
-1
和
Eca
-109三种细胞转染后荧光积分光密度分别为
900.9、682.8、16 816.3,
Eca
-109细胞转染程度远
高于
TE
-1和
Eca
-9706细胞。
2.2转染效果最佳观测时间
为了观察
Eca
-109细胞进行转染之后转染效果
随时间变化的情况，本实验选取转染18、24、30、
36、48、60、72、96
h
时对
Eca
-109的转染效果进
行检测，图2所示为转染后不同时间点倒置荧光显微
镜下观察到的
GFP
表达及细胞状态照片。然后对荧
光强度进行分析，焚光平均光密度
(mean
optical
den
-
入
CCK
-8试剂(10
pL
/孔)，于37
°C
细胞培养箱中孵育
1
h
后，使用酶标仪检测450
nm
波长处吸光度值。细
胞存活率=(转染孔吸光度-对照孔吸光度)/(对照孔
吸光度-空白孔吸光度)
xl
00%。其中实验孔含细胞、
培养基、
CCK
-8溶液和转染试剂；对照孔含细胞、
培养基、
CCK
-8溶液，不含转染试剂；空白孔含培养
基、
CCK
-8溶液，不含细胞和转染试剂。
1.2.6
统计学处理
数据分析使用
SPSS
22统计软
件，计量数据以均数±标准差(3^)表示，两组独立样本
采用(检验，两组以上比较采用单因素方差分析(
One
-
Way
ANOVA
),统计差异设定为
P
<0.05为差异具有统
A: Eca-9706
细胞
GFP
表达图；
B: TE-
丨细胞
GFP
表达图；
C: Eca-109
细胞
GFP
表达图；
D: Eca-9706
细胞状态图；
E: TE-1
细胞状态图；
F: Eca-109
细
胞状态图
;G:
转染后
Eca-9706
、
Eca-109
以及
TE-1
荧光积分光密度，
****P<0.000 1
。
A: fluorescence microscopic image of GFP expression in Eca-9706 cells; B: fluorescence microscopic image of GFP expression in TE-1 cells; C:
fluorescence microscopic image of GFP expression in Eca-109 cells; D: cell morphology of Eca-9706 cells; H: cell morphology of TE-1 cells; F: cell
morphology ofTE-1 cells; G: the integral optical densities of Eca-9706, Eca-109 and TE-1 cells after transfection. ****/><0.000 1.
图
1
细胞种类对
EL
转染试剂转染效率的影响
Fig.l Effects of cell types on transfection efficiency of EL transfection reagent
俞晓炜等:
EL
转染试剂转染食管鱗癌细胞的条件优化
381
(
B
)
A: EL
转染试剂转染
miR-6743-5p
后不同时间点
Eca-109
细胞
GFP
表达图；
B: EL
转染试剂转染
miR-6743-5p
后不同时间点荧光平均光密度。
M^,
与其他时间点相比，
A: fluorescence microscopic images of GFP expression of miR-6743-5p transfected by EL transfection reagent at different time points in Eca-109 cells;
B: fluorescence mean optical density of miR-6743-5p transfected by EL transfection reagent at different time points in Eca-109 cells. ♦^^^ com
pare with other time points.
图
2 EL
转染试剂转染
miR-6743-5p
后不同时间点转染效果
Fig.2 Transfection efficiency of miR-6743-5p transfected by EL transfection reagent at different time points
150]
U
Control miR-6743-5pEL
EL:
添加
EL
转染试剂组；
miR-6743-5p:
添加
Hsa-miR-6743-5p
质粒组
;contro
丨：对照组。
EL: the group with EL transfection reagent; miR-6743-5p: the group with Hsa-miR-6743-5p plasmid; control: control group without EL transfcciton
reagent and Hsa-miR-6743-5p plasmid.
图
3 EL
转染试剂对细胞存活率影响
Fig.3 Effects of EL transfection reagent on cell viability
sity
，
MOD
)是每个细胞的
GFP
表达强度的指标，对
空白对照组相比存活率超过100%，结果无统计学差
异。这证明了
EL
转染试剂对细胞存活率无影响。
2.4
EL
转染试剂与
Hsa
-
miR
>6743质粒比例对
Eca
-
109 细胞转染效率的影响
为选择合适的转染试剂与质粒的比例，选取
EL
转染试剂(
HL
)与
Hsa
-
miR
-6743质粒(
ng
)比例分别为
1:1、1:2、1:3和 1:4,转染入
Eca
-109细胞，转染36
h
后检测绿色荧光蛋白(图4
A
)。结果(图4
B
)显示，通
过荧光积分光密度定量分析，得出当其比例为1:1、
应于每个细胞转染的程度。
EL
转染试剂在转染18、
24、30、36、48、60、72、96
h
时荧光平均光密度
分别为0.073、0.096、0.104、0.178、0.109、0.112、
0.084、0.078,由结果可知，
EL
转染试剂对
Eca
-109细
胞转染的最佳观测时间为转染36
h
时。
2.3
EL
转染试剂对细胞存活率的影响
如图3所示，在转染36
h
时通过
CCK
-8检测
Eca
-
109 细胞存活率表明， 只添加
EL
转染试剂组细胞与
382
•技术与方法•
Ratio of transfection reagent and plasmid
A: EL
转染试剂转染
Eca-109
细胞
GFP
表达图；
B:
转染试剂与质粒不同比例转染后荧光积分光密度。
1/1
〜
1/4
分别为
1:
丨〜丨
:4
组。
A: fluorescence microscopic images of GFP expression in Eca-109 cells transfected by EL transfection regent; B: integral optical density transfected by
different ratios of transfection reagent to plasmid, l/l-1/4 correspond to the groups of 1:1-1:4.
图
4 EL
转染试剂与质粒的比例对转染效果的影响
Fig.4 Effects of the ratio of EL transfection reagent to plasmid on transfection efficiency
1:2、1:3和1:4时，荧光积分光密度分别为1.237
X
107、
2.403
X
107、3.084><1〇7和
4.777xl
〇
7,
由上数据可知，
EL
转染试剂转染效果随质粒比例的增加而增强。
但其具体原因尚不清楚[61。考虑阳离子转染色试剂
原理是带正电的阳离子聚合物通过静电相互作用与
带负电的基因(
DNA
以及
RNA
)形成载体/核酸复合
物，如图5所示，这些纳米级别的复合物颗粒主要是
通过胞吞作用形成内涵体(
endosome
)进入细胞，核
酸从内涵体释放至细胞质中，通过膜受体进入细胞
核内进行转录、翻译。我们从三个方面分析其
可能原因，在
Eca
-9706、
TE
-
I
细胞中，⑴
EL
/
DNA
复
合物难以逃脱溶酶体的降解；（2)
EL
/
DNA
复合物难
以在细胞质中运输；（3)
EL
/
DNA
复合物难以进入细
胞核。
在
Eca
-9706、
TE
-1细胞中观察到较慢内化的一
个可能原因可能是由于它们过量产生黏蛋白[131。之
前相关转染研究表明，黏蛋白可能成为基因传递和
复合物颗粒摄取的物理屏障，因为它们倾向于与局
部培养基中的阳离子聚合物/
DNA
复合物结合并诱
导聚集体形成。黏蛋白通常可以通过破坏聚阳离
子聚合物和聚阴离子
DNA
之间的静电相互作用来
诱导聚合复合物的增加聚集[
M
1。因此，黏蛋白与
EL
/
DNA
为保证转染效果和降低成本，我们后期实验将选择
EL
转染试剂(
h
L
)与质粒
Hsa
-
miR
-6743(
ng
)比例为1:2
进行。
3讨论
为了确定
Eca
-109、
Eca
-9706和
TE
-1三种食管
鱗癌细胞株中的转染差异，通过将含
GFP
报告基因
的
Hsa
-
miR
-6743质粒以
EL/DN
A
复合物形式递送至
三种细胞系中，比较转染后细胞表达的荧光积分光
密度，可知与
Eca
-9706、
TE
-1细胞相比，
Eca
-109细
胞更容易被转染。如前所述，
IOD
其定义为测量标
本结构范围内各个像素点光密度之和，在本文中荧
光积分光密度是指己转染和转录成功的细胞发出的
绿色荧光总强度。因此，
Eca
-109细胞转染效果比另
外两种细胞更高的这一事实，表明
Eca
-109细胞可能
在吸收
EL
/
DNA
复合体以及运输这些复合物和/或转
录
DNA
的效率比另外两种细胞更高。有研究表明，
转染细胞的种类会影响转染试剂介导的转染效率，
复合物在
Eca
-9706、
TE
-1细胞中的相互作用可
能导致这些复合物聚集到足以产生足够的溶酶体膜
俞晓炜等:
EL
转染试剂转染食管鳞癌细胞的条件优化
383
Polyplcxes
图
5
阳离子聚合物
/DNA
的内吞作用和细胞内运输步骤示意图
Fig.5 Endocytosis and intracellular trafficking steps of cationic polymer-DNA
透化作用的点，使己经递送到
Eca
-9706、
TE
-丨细胞 参考文献(
References
)
中的
EL
/
DNA
复合物颗粒在内涵体逃逸后于细胞质
[1] WANG J, YE X, NI H, et al. Transfectionefficiency evaluation
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DNA
复合
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(
梭华
-Sofast)
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厦门大学学报
(
自然科学版）
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EL
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h
时，由于相关实验项目此时
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间点检测效果不佳，于是我们通过量化荧光强度，得
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到经过
EL
转染试剂转染
Hsa
-
miR
-6743质粒的
Eca
-
delivery with synthetic (non viral) carriers [J]. Pharm, 2001,
229(1/2): 1-21.
10 9细胞转染效果检测最佳的时间点为转染3 6
h
时,
[7]
张颖，周志平
.
阳离子聚合物基因载体：进展与展望
[J
].应用
并且在此时间点，
EL
转染试剂对
Eca
-109细胞生存率
化工
（ZHANG Y，ZHOU Z P. Polycations for gene delivery:
未产生影响，因而，我们后续相关实验将会选择此时
progress and perspective [J]. Appl Chem Ind), 2018, 47(1): 145-
9,54.
间点进行。本研究表明，
EL
转染试剂与转染质粒的
[8] KUMAR P, NAGARAJAN A, UCHIL P D. DNA transfection
比例为1:4〜丨:2时形成的纳米颗粒，转染效果较好，与
mediated by cationic lipid reagents [J]. Cold Spring Harb Pro-
试剂说明书所推荐使用量相符。
toc, 2019, doi: 10.1101/095414.
[9]
赵轶男，张树彪，崔韶晖，等.阳离子脂质体介导基因转染肿
我们目前的工作优化了
EL
转染试剂转染
Hsa
-
瘤细胞
[J].
中国细胞生物学学报
(ZHAO YN，ZHANG S B
，
miR
-6743 质粒的条件， 可为转染食管鱗癌肿瘤细胞
CUI S H, et al. Cationic liposome mediated gene transfection
of tumor cells [J]. Chinese Journal Cell Biology), 2013, 35(10):
载体的选择提供依据。
1459-64.
384
[10] LIU H, YANG Z, XUN Z, et al. Nuclear delivery of plasmid
DNA determines the efficiency of gene expression [J]. Cell Biol
Int, 2019, 43(7): 789-98.
[11] MCLENDON P M, FICHTHR K M, REINEKE T M. Poly (gly-
coamidoamine) vehicles promote pDNA uptake through mul
tiple routes and efficient gene expression via caveolae-mediated
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ic nucleic acid vehicles exploit active interorganelle trafficking
mechanisms [J]. ACS Nano, 2013, 7(1): 347-64.
[13]
金文波，周乃康，郑梦利，等
.
黏蛋白
-1
和细胞角蛋白
-20
在食
•技术与方法•
cer Res Clin), 2011, 25(4): 237-9.
[14] FLOREA B I, MEANEY C, JUNGINGER H E, et al. Transfec
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Lett, 2005, 579(12): 2635-42.
2024年3月18日发(作者：岳香天)
中国细胞生物学学报
Chinese
Journal
of
Cell
Biology
2021,43(2): 378-384
DOI
: 10.11844/
cjcb
.2021.02.0013
技术与方法
EL
转染试剂转染食管鱗癌细胞的条件优化
俞晓炜
1
李停
2
李周儒
1
王炳皓
1
马静媛
1
张浩洋
3
章耀3蔡红星
C
徐州医科大学基础医学院法医学教研室，徐州
221000"
徐州医科大学公共平台实验中心，徐州
221000;
3
徐州医科大学临床学院，徐州
221000)
摘要 该文探讨了关于
EL
转染试剂转染
Hsa
-
miR
-6743质粒至食管鱗癌细胞转染效果的影响
标记的
Hsa
-
miR
-6743为报告 因素。以食管鳞癌细胞株
Eca
-109、
TE
-1和
Eca
-9706为研究对象，
基因，通过倒置荧光显微镜检测荧光信号优化转染试剂和质粒比值。结果表明，食管鳞癌细胞的种
类影响
EL
转染试剂的转染效果，
EL
转染试剂在
Eca
-109细跑株中的转染效果最好，在另外两种细胞
中转染效果不佳。在
Eca
-109细胞株中，转染效果最佳检测时间为转染36
h
时，细胞存活情况不受转
染试剂影响。
EL
转染试剂与
Hsa
-
miR
-6743质粒最佳转染比例范围为1:4〜1:2。
EL
转染试剂的转染
效果受细胞种类、转染试剂与质粒比值以及转染时间的影响。
关键词食管鳞癌细胞；阳离子聚合物转染试剂;基因转染;细胞内吞;细胞种类
Optimization of Transfection Condition of the EL Transfection Reagent in
Esophageal Squamous Cells
YU
Xiaowei
1,
LI
Ting
2,
LI
Zhouru
1,
WANG
Binghao
1,
MA
Jingyuan
1,
ZHANG
Haoyang
3,
ZHANG
Yao
3,
CAI
Hongxing
1*
{^'Department of Forensic Medicine, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, China,2 Public Experimental Research Center,
Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, China;yClinical College, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, China)
Abstract
This
study
aimed
to
explore
the
influencing
factor
on
the
transfection
effects
of
EL
transfection
reagent
,
which
was
used
to
transfect
Hsa
-
miR
-6743
plasmid
into
esophageal
squamous
cells
.
The
esophageal
squa
mous
cells
Eca
-109,
TE
-1
and
Eca
-9706
were
chosen
as
the
research
objects
.
Hsa
-
miR
-6743
marked
by
GFP
(green
fluorescent
protein
)
was
selected
as
a
reporter
gene
.
The
fluorescence
signals
were
detected
by
inverted
fluorescence
microscopy
to
optimize
the
proportion
of
transfection
reagent
and
plasmid
.
The
results
turned
out
that
the
transfec
tion
efficiency
of
EL
transfection
reagent
was
influnced
by
cell
types
of
esophageal
squamous
cells
.
The
transfec
tion
efficiency
of
EL
transfection
reagent
in
Eca
-109
cells
was
better
than
that
in
other
two
cells
.
The
best
detection
time-point
of
the
optimal
transfection
efficiency
was
at
36
h
in
Eca
-109
cells
,
and
cell
viability
was
not
affected
by
EL
transfection
reagent
.
The
optimal
transfection
ratio
of
EL
transfection
reagent
to
Hsa
-
miR
-6743
plasmid
ranged
from
1：4
to
1：2.
The
transfection
efficiency
of
EL
transfection
reagent
was
affected
by
cell
types
,
the
ratio
of
trans
-
收稿日期
:2020-06-03
接受日期
:2020-
丨
1-23
上海市法医学重点实验室暨司法部司法鉴定重点实验室幵放课题
(
批准号
:KF202004)
资助的课题
*
通讯作者。
Tel*************,E-mail:*******************
Received: June 3, 2020 Accepted: November 23, 2020
This work was supported by the Fund of Shanghai Key Laboratory of Forensic Science and Key Laboratory of Academy of Forensic Science (Grant N
〇
.KF202004)
* :+86-516-5580717,E-mail:*******************
URL: /?id=5463
俞晓炜等:
EL
转染试剂转染食管鳞癌细胞的条件优化
379
fection
reagent
to
plasmid
,
and
transfection
time
.
Keywords
esophageal
squamous
cells
;
cationic
polymer
transfection
reagent
;
gene
transfection
;
endocy
-
tosis
;
cell
type
细胞转染技术是将外源性的遗传物质导入至真
核细胞内并进行基因表达的一项技术。根据对转染
载体的区分，现有的细胞转染技术可分为非病毒载体
转染和病毒载体转染。其中病毒载体转染是通过病
毒载体，例如逆转录病毒或腺病毒，将核酸分子递送
至细胞中。病毒载体转染因其具有转染效率高、稳
定性高、细胞毒性低的特点而被认为是最先进的转
染技术，但是病毒载体转染操作复杂，有致癌和感染
的可能性等生物安全因素而限制了其应用[11。为了解
决这一问题，非病毒载体被用作替代的转染方法，非
病毒载体主要包括阳离子脂质体、阳离子聚合物和
阳离子肽，虽转染效率相对较低,但其安全性高，操作
简便，因而被广泛运用于
DNA
以及
RNA
的转染中
阳离子聚合物由于缺乏免疫原性，在包装不同
种类和大小的核酸方面具有灵活性，因其具有易于
大规模合成、便于降解等优点而被广泛用作非病
毒基因载体[51。阳离子聚合物被运用到多种细胞的
转染之中，携带正电荷的载体通过压缩带负电荷的
核酸分子，在大多数情况下形成体积相对小且稳定
的纳米复合物(
polyplexes
),使核酸免受核酸酶的降
解，并且可与细胞表面蛋白多糖相互作用从而进入
细胞16_81。转染效率受诸多因素影响，其中包括细胞
所处周期、生长状态、铺板密度、载体的化学性质、
摄取机制和细胞内递送途径、载体与质粒的配比
以及质粒的纯度和浓度等
在本研宂中，我们着眼于非病毒转染载体，选
择了细胞毒性低、操作灵活、易于合成的
EL
转染
试剂，通过探索阳离子聚合物转染试剂
EL
在食管鱗
癌三种细胞
Eca
-109、
Eca
-9706、
TE
-丨中的转染效果，
检测转染效果显示的最佳时间，优化该种试剂的使
用条件。本项研宂可以为肿瘤细胞选择转染试剂提
供更丰富的理论依据，以期在保证转染效率的情况
下获得最优的转染效果，为之后进行细胞系的稳定
转染奠定基础。
1材料方法
1.1细胞株与主要试剂
人食管鳞癌细胞株
Eca
-109、
TE
-丨购自武汉
Procell
公司。
Eca
-9706细胞株由徐州医科大学形
态学实验室保存。
Translntro
™
EL
Transfection
Re
agent
购自北京全式金生物技术有限公司 。质粒中提
试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。标记有
绿色焚光蛋白
(green
fluorescent
protein
,
GFP
)
Hsa
-
miR
-6743质粒购自
GenePharma
公司。
Opti-DMEM
培养基购自美国
Gibco
公司。
RPMI
1640完全培养基
和
DMEM
高糖培养基购自南京凯基科技有限公司。
胎牛血清
(fatal
bovine
serun
,
FBS
)购自美国
CLARK
公司。
CCK
-8试剂购自大连美仑生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1
质粒栽体的扩增
用
LB
培养基扩大培养含
有
Hsa
-
miR
-6743质粒的菌液。按照质粒中提试剂盒
说明书提取并纯化质粒，通过紫外分光光度计测定
质粒的浓度和纯度。用滤膜(0.22 (
im
微孔)过滤除菌。
1.2.2
细胞培养
Eca
-109、
TE
-1、
Eca
-9706细胞培
养液成分均为
RPMI
1640完全培养基(含10%
FBS
、
1%双抗)，于37 °
C
、5%
C
02培养箱中培养，每隔1〜2
天用0.25%胰酶消化传代。
1.2.3
细胞转染
取处于对数生长期的
Eca
-109、
TE
-1、
Eca
-9706细胞，经0.25%胰酶消化，当细胞浓度
为
lxlO
5个/
mL
时,接种于96孔板中(100
nLV
孔)。当每孔
细胞密度达到70%左右时进行转染。
转染时移去生长培养基，用
PBS
清洗之后加入
等量
DMEM
空培养基(无血清、无双抗)。
以％孔板中1孔为例：
(1) 将0.2
pg
Hsa
-
miR
4743质粒稀释于 10
pLOpti
-
MEM
培养基中；
(2) 选取
EL
转染试剂（
nL
)与质粒
Hsa
-
m
6743((
ig
)比例分别为1:丨、1:2、1:3和1:4,即将0.2、
0.4、0.6、0.8
(xg
Hsa
-
miR
-6743质粒稀释于200
pL
Opti
-
MEM
培养基(该步骤用于观察不同质粒比例对
Eca
-109细胞转染效率的影响实验，其余实验略过该
步骤)；
(3) 取0.2吣
EL
转染试剂加入到稀释好的质粒
中，轻柔摇匀，于室温静置15~20
min
,将质粒转染试
剂复合物加入到细胞中。
于37 °
C
、5%
C
02培养箱中培养4〜5
h
,更换新
iR
-
380•技术与方法•
鲜培养基(含10%
FBS
和1%双抗)，继续培育。
1.2.4
转染效率测定
细胞转染后，采用倒置荧光
显微镜进行拍摄，每个视野分别在可见光和488
nm
激发光激发下拍照，图像处理工具为
Image
对绿色
荧光强度进行统计，每次实验随机选取3个具有代表
性的视野进行观察计算(实验独立重复3次)。使用荧
光积分光密度
(integral
optical
density
,
IOD
)量化转染
效果。荧光积分光密度可反映转染成功的细胞表达
的
GFP
总强度，反映细胞转染总程度。
GFP
表达阳
性细胞越多，荧光强度越强，表明转染成功的程度越
高。
计学意义。
2 结果
2.1不同食管鳞癌细胞株中的转染差异
为了观察转染细胞的种类是否会影响
EL
转染
试剂的转染效果，将含告基因的
Hsa
-
miR
-6743
质粒以
EL
/
DNA
复合体形式分别递送至
Eca
-109、
Eca
-9706和
TE
-1三种细胞系，阳性细胞发出明亮
的绿色荧光信号。按照
EL
转染试剂说明书的推
荐，转染24
h
后，在倒置荧光显微镜下观察到的
Eca
-109、
Eca
-9706和
TE
-1三种细胞的细胞状态以
1.2.5
细胞存活率测定
细胞转染后于96孔板加
及
GFP
表达情况如图1所示。三种细胞转染后的生
长存活状态均未发生明显改变，
Eca
-9706、
TE
-1
和
Eca
-109三种细胞转染后荧光积分光密度分别为
900.9、682.8、16 816.3,
Eca
-109细胞转染程度远
高于
TE
-1和
Eca
-9706细胞。
2.2转染效果最佳观测时间
为了观察
Eca
-109细胞进行转染之后转染效果
随时间变化的情况，本实验选取转染18、24、30、
36、48、60、72、96
h
时对
Eca
-109的转染效果进
行检测，图2所示为转染后不同时间点倒置荧光显微
镜下观察到的
GFP
表达及细胞状态照片。然后对荧
光强度进行分析，焚光平均光密度
(mean
optical
den
-
入
CCK
-8试剂(10
pL
/孔)，于37
°C
细胞培养箱中孵育
1
h
后，使用酶标仪检测450
nm
波长处吸光度值。细
胞存活率=(转染孔吸光度-对照孔吸光度)/(对照孔
吸光度-空白孔吸光度)
xl
00%。其中实验孔含细胞、
培养基、
CCK
-8溶液和转染试剂；对照孔含细胞、
培养基、
CCK
-8溶液，不含转染试剂；空白孔含培养
基、
CCK
-8溶液，不含细胞和转染试剂。
1.2.6
统计学处理
数据分析使用
SPSS
22统计软
件，计量数据以均数±标准差(3^)表示，两组独立样本
采用(检验，两组以上比较采用单因素方差分析(
One
-
Way
ANOVA
),统计差异设定为
P
<0.05为差异具有统
A: Eca-9706
细胞
GFP
表达图；
B: TE-
丨细胞
GFP
表达图；
C: Eca-109
细胞
GFP
表达图；
D: Eca-9706
细胞状态图；
E: TE-1
细胞状态图；
F: Eca-109
细
胞状态图
;G:
转染后
Eca-9706
、
Eca-109
以及
TE-1
荧光积分光密度，
****P<0.000 1
。
A: fluorescence microscopic image of GFP expression in Eca-9706 cells; B: fluorescence microscopic image of GFP expression in TE-1 cells; C:
fluorescence microscopic image of GFP expression in Eca-109 cells; D: cell morphology of Eca-9706 cells; H: cell morphology of TE-1 cells; F: cell
morphology ofTE-1 cells; G: the integral optical densities of Eca-9706, Eca-109 and TE-1 cells after transfection. ****/><0.000 1.
图
1
细胞种类对
EL
转染试剂转染效率的影响
Fig.l Effects of cell types on transfection efficiency of EL transfection reagent
俞晓炜等:
EL
转染试剂转染食管鱗癌细胞的条件优化
381
(
B
)
A: EL
转染试剂转染
miR-6743-5p
后不同时间点
Eca-109
细胞
GFP
表达图；
B: EL
转染试剂转染
miR-6743-5p
后不同时间点荧光平均光密度。
M^,
与其他时间点相比，
A: fluorescence microscopic images of GFP expression of miR-6743-5p transfected by EL transfection reagent at different time points in Eca-109 cells;
B: fluorescence mean optical density of miR-6743-5p transfected by EL transfection reagent at different time points in Eca-109 cells. ♦^^^ com
pare with other time points.
图
2 EL
转染试剂转染
miR-6743-5p
后不同时间点转染效果
Fig.2 Transfection efficiency of miR-6743-5p transfected by EL transfection reagent at different time points
150]
U
Control miR-6743-5pEL
EL:
添加
EL
转染试剂组；
miR-6743-5p:
添加
Hsa-miR-6743-5p
质粒组
;contro
丨：对照组。
EL: the group with EL transfection reagent; miR-6743-5p: the group with Hsa-miR-6743-5p plasmid; control: control group without EL transfcciton
reagent and Hsa-miR-6743-5p plasmid.
图
3 EL
转染试剂对细胞存活率影响
Fig.3 Effects of EL transfection reagent on cell viability
sity
，
MOD
)是每个细胞的
GFP
表达强度的指标，对
空白对照组相比存活率超过100%，结果无统计学差
异。这证明了
EL
转染试剂对细胞存活率无影响。
2.4
EL
转染试剂与
Hsa
-
miR
>6743质粒比例对
Eca
-
109 细胞转染效率的影响
为选择合适的转染试剂与质粒的比例，选取
EL
转染试剂(
HL
)与
Hsa
-
miR
-6743质粒(
ng
)比例分别为
1:1、1:2、1:3和 1:4,转染入
Eca
-109细胞，转染36
h
后检测绿色荧光蛋白(图4
A
)。结果(图4
B
)显示，通
过荧光积分光密度定量分析，得出当其比例为1:1、
应于每个细胞转染的程度。
EL
转染试剂在转染18、
24、30、36、48、60、72、96
h
时荧光平均光密度
分别为0.073、0.096、0.104、0.178、0.109、0.112、
0.084、0.078,由结果可知，
EL
转染试剂对
Eca
-109细
胞转染的最佳观测时间为转染36
h
时。
2.3
EL
转染试剂对细胞存活率的影响
如图3所示，在转染36
h
时通过
CCK
-8检测
Eca
-
109 细胞存活率表明， 只添加
EL
转染试剂组细胞与
382
•技术与方法•
Ratio of transfection reagent and plasmid
A: EL
转染试剂转染
Eca-109
细胞
GFP
表达图；
B:
转染试剂与质粒不同比例转染后荧光积分光密度。
1/1
〜
1/4
分别为
1:
丨〜丨
:4
组。
A: fluorescence microscopic images of GFP expression in Eca-109 cells transfected by EL transfection regent; B: integral optical density transfected by
different ratios of transfection reagent to plasmid, l/l-1/4 correspond to the groups of 1:1-1:4.
图
4 EL
转染试剂与质粒的比例对转染效果的影响
Fig.4 Effects of the ratio of EL transfection reagent to plasmid on transfection efficiency
1:2、1:3和1:4时，荧光积分光密度分别为1.237
X
107、
2.403
X
107、3.084><1〇7和
4.777xl
〇
7,
由上数据可知，
EL
转染试剂转染效果随质粒比例的增加而增强。
但其具体原因尚不清楚[61。考虑阳离子转染色试剂
原理是带正电的阳离子聚合物通过静电相互作用与
带负电的基因(
DNA
以及
RNA
)形成载体/核酸复合
物，如图5所示，这些纳米级别的复合物颗粒主要是
通过胞吞作用形成内涵体(
endosome
)进入细胞，核
酸从内涵体释放至细胞质中，通过膜受体进入细胞
核内进行转录、翻译。我们从三个方面分析其
可能原因，在
Eca
-9706、
TE
-
I
细胞中，⑴
EL
/
DNA
复
合物难以逃脱溶酶体的降解；（2)
EL
/
DNA
复合物难
以在细胞质中运输；（3)
EL
/
DNA
复合物难以进入细
胞核。
在
Eca
-9706、
TE
-1细胞中观察到较慢内化的一
个可能原因可能是由于它们过量产生黏蛋白[131。之
前相关转染研究表明，黏蛋白可能成为基因传递和
复合物颗粒摄取的物理屏障，因为它们倾向于与局
部培养基中的阳离子聚合物/
DNA
复合物结合并诱
导聚集体形成。黏蛋白通常可以通过破坏聚阳离
子聚合物和聚阴离子
DNA
之间的静电相互作用来
诱导聚合复合物的增加聚集[
M
1。因此，黏蛋白与
EL
/
DNA
为保证转染效果和降低成本，我们后期实验将选择
EL
转染试剂(
h
L
)与质粒
Hsa
-
miR
-6743(
ng
)比例为1:2
进行。
3讨论
为了确定
Eca
-109、
Eca
-9706和
TE
-1三种食管
鱗癌细胞株中的转染差异，通过将含
GFP
报告基因
的
Hsa
-
miR
-6743质粒以
EL/DN
A
复合物形式递送至
三种细胞系中，比较转染后细胞表达的荧光积分光
密度，可知与
Eca
-9706、
TE
-1细胞相比，
Eca
-109细
胞更容易被转染。如前所述，
IOD
其定义为测量标
本结构范围内各个像素点光密度之和，在本文中荧
光积分光密度是指己转染和转录成功的细胞发出的
绿色荧光总强度。因此，
Eca
-109细胞转染效果比另
外两种细胞更高的这一事实，表明
Eca
-109细胞可能
在吸收
EL
/
DNA
复合体以及运输这些复合物和/或转
录
DNA
的效率比另外两种细胞更高。有研究表明，
转染细胞的种类会影响转染试剂介导的转染效率，
复合物在
Eca
-9706、
TE
-1细胞中的相互作用可
能导致这些复合物聚集到足以产生足够的溶酶体膜
俞晓炜等:
EL
转染试剂转染食管鳞癌细胞的条件优化
383
Polyplcxes
图
5
阳离子聚合物
/DNA
的内吞作用和细胞内运输步骤示意图
Fig.5 Endocytosis and intracellular trafficking steps of cationic polymer-DNA
透化作用的点，使己经递送到
Eca
-9706、
TE
-丨细胞 参考文献(
References
)
中的
EL
/
DNA
复合物颗粒在内涵体逃逸后于细胞质
[1] WANG J, YE X, NI H, et al. Transfectionefficiency evaluation
中被捕获，无法进入细胞核的复合物而后被降解。
and endocytosis exploration of different polymer condensed
agents [J]. DNA Cell Biol, 2019, 38(10): 1048-55.
成功内化到细胞后，阳离子聚合物/
DNA
复合
[2]
杨天賜，陈明桥，黄革玲.新一代阳离子聚合物转染试剂
物必须通过胞吞途径才能进入细胞质，然后被转运
(
梭华
-Sofast)
转染效果研究
[J].
厦门大学学报
(
自然科学版）
至细胞核。复合物的内化通常由网格蛋白和小窝蛋
(YANG T C, CHEN M Q, HUANG G L. Study on the transfec
tion efficiency of the new cationic polymer transfection reagent:
白介导的胞吞作用产生。胞吞作用越强，细胞的转
Sofast [J]. Journal of Xiamen University, Nature Science), 2004,
染效率越高[3‘91。有研宄通过使用药物内吞抑制剂
21(4): 572-7.
和共聚焦显微镜分析，发现小窝蛋白/筏介导的内吞
[3] DAS J, HAN J W, CHOI Y J, et al. Cationic lipid-nanoceria hy
brids, a novel nonviral vector-mediated gene delivery into mam
作用是导致阳离子聚合物核转运和有效表达的主要
malian cells: investigation of the cellular uptake mechanism [J].
途径
I
"#15】。细胞在有丝分裂间期摄入阳离子聚合
Sci Rep, 2016, 6: 29197.
[4] LUO H C, LI N, YAN L, et al. Comparison of the cellular trans
物转染试剂的量高于有丝分裂期。细胞所处分裂间
port mechanism of cationic, star-shaped polymers and liposomes
期不同，胞吞作用不同，导致转染效率也不同〜6“'
in HaCat cells [J]. Nanomedicine, 2017, 12: 1085-96.
另外，
EL
转染试剂说明书中对于转染的最佳观
[5] HE B, WANG Y, SHAO N, et al. Polymers modified with
double-tailed fluorous compounds for efficient DNA and siRNA
测时间建议为转染24
h
时，由于相关实验项目此时
delivery [J]. Acta Biomater, 2015, 22: 111-9.
间点检测效果不佳，于是我们通过量化荧光强度，得
[6] BROWN M D, SCHATZLEIN A G, UCHEGBU I F. Gene
到经过
EL
转染试剂转染
Hsa
-
miR
-6743质粒的
Eca
-
delivery with synthetic (non viral) carriers [J]. Pharm, 2001,
229(1/2): 1-21.
10 9细胞转染效果检测最佳的时间点为转染3 6
h
时,
[7]
张颖，周志平
.
阳离子聚合物基因载体：进展与展望
[J
].应用
并且在此时间点，
EL
转染试剂对
Eca
-109细胞生存率
化工
（ZHANG Y，ZHOU Z P. Polycations for gene delivery:
未产生影响，因而，我们后续相关实验将会选择此时
progress and perspective [J]. Appl Chem Ind), 2018, 47(1): 145-
9,54.
间点进行。本研究表明，
EL
转染试剂与转染质粒的
[8] KUMAR P, NAGARAJAN A, UCHIL P D. DNA transfection
比例为1:4〜丨:2时形成的纳米颗粒，转染效果较好，与
mediated by cationic lipid reagents [J]. Cold Spring Harb Pro-
试剂说明书所推荐使用量相符。
toc, 2019, doi: 10.1101/095414.
[9]
赵轶男，张树彪，崔韶晖，等.阳离子脂质体介导基因转染肿
我们目前的工作优化了
EL
转染试剂转染
Hsa
-
瘤细胞
[J].
中国细胞生物学学报
(ZHAO YN，ZHANG S B
，
miR
-6743 质粒的条件， 可为转染食管鱗癌肿瘤细胞
CUI S H, et al. Cationic liposome mediated gene transfection
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384
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-1
和细胞角蛋白
-20
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