2024年4月8日发(作者：阮含灵)
植物超氧阴离子自由基含量的测定
一、实验目的
生物体内的一部分氧分子，在参与酶促或非酶促反应时，若只接受一个电子，
会转变为超氧阴离子自由基（O
2
－
）。O
2
－
既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质
直接作用，又能衍生为H
2
O
2
羟自由基（·OH）、单线态氧（1 O
2
）等。·OH可以引
发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基（·R）、
脂氧自由基（RO·）、脂过氧自由基（ROO·）和脂过氧化物（ROOH），自由基积累
过多时会对细胞膜及许多生物大分子产生破坏作用。
本实验主要掌握植物体内氧自由基的测定原理及方法。
二、实验原理
在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自
由基（O
2
－
）。利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O
2
－
含量。O
2
－
与羟胺反应
生成NO
2
－
，NO
2
－
在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对
－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根
据A530值换算成NO
2
－
的浓度，再根据反应式（如下）：
NH
2
OH + 2O
2
－
＋ H
＋
→ NO
2
－
＋ H
2
O
2
＋ H
2
O
可以直接进行O
2
－
化学计量，从而算出样品中O
2
－
含量。
三、实验材料、仪器设备及试剂
1. 材料：新鲜小麦叶片。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液
管；试管架；移液管架；吸耳球等。
3. 试剂配制：
（1）65 mmol·L
－1
磷酸缓冲液（pH7.8）
（2）10 mmol·L
－1
盐酸羟胺
（3）17 mmol·L
－1
对氨基苯磺酸（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
（4）7 mmol·L
－1
α－萘胺（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
（5）亚硝酸钠标准液：称NaNO
2
（AR级）0.1000g，蒸馏水定容至100mL，
摇匀，取5mL用蒸馏水定容到1000mL，即为每毫升含NO
2
－
5μg的标准液。
四、实验步骤
1. 提取液制备
称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L
－1
磷酸缓冲液（pH7.8）
5ml, 研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，上清液即为样品提取液。
2. 亚硝酸根标准曲线的制作
（1）取7支试管，编1～7号，按照下表的顺序添加试剂，每加一种试剂后都
要摇动使之混匀。
表 NO
2
－
标准曲线测定反应体系
试剂（ml）
1
NO2－5μg的标准液
蒸馏水
对氨基苯磺酸
α－萘胺
每管NO
2
－
μg数
试管编号
2
0.1
1.9
4
0.4
20
3
0.2
1.8
4
0.4
40
4
0.4
1.6
4
0.4
80
5
0.6
1.4
4
0.4
120
6
0.8
1.2
4
0.4
160
7
1.0
1.0
4
0.4
200
0
2
4
0.4
0
试剂加完后将各试管置于30℃恒温水浴中保温30min，显色反应后测定A53
0。
（2）标准曲线绘制
以1～7号管亚硝酸根（NO
2
－
）浓度为横坐标，A530吸光度值作纵坐标，绘
制标准曲线。
3. O
2
－
含量测定
取4支试管，编0～3号，1～号管分别加入样品提取液0.5ml（三个重复）
－
（1）NO
2
的产生
试剂ml/试管编号 1 2 3
O2－提取液
PBS缓冲液
盐酸羟胺
2.0
1.5
0.5
2.0
1.5
0.5
2.0
1.5
0.5
25 ℃，保温20 min
（2）NO
2
－
的显色（同标准曲线）
试剂ml/试管编号 1
上述反应液
对氨基苯磺酸
α－萘胺
2.0
2
2.0
3
2.0
30 ℃，保温30 min
显色反应后，以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。
4. O
2
－
含量计算的方法
根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO
2
－
浓度，并换算成O
2
－
的浓度（X），并按照下式计算O
2
－
的含量：
O
2
－
含量（μg/gFW）= 2X×Vt×n/（FW×Vs）
式中， Vt——为样品提取液的体积（mL）；
n ——为测定时样品提取液的稀释倍数；
FW——样品鲜重（g）；
Vs——显色取样品液的体积（mL）；
X——为从标准曲线上查得样品液NO
2
－
浓度。
五、实验结果
（1）标准曲线的绘制结果：
试管编号
每管NO
2
－
μg数
A530
1
0
2
20
3
40
4
80
5
120
6
160
7
200
0.000 0.106 0.239 0.435 0.619 0.834 1.007
标准曲线绘制结果如下：
（2）O2
－
含量计算
根据公式计算得到以下结果：
O
2
－含量（μg/gFW）= 2X×Vt×n/（FW×Vs）式中，
Vt——为样品提取液的体积（mL）；
n ——为测定时样品提取液的稀释倍数；
FW——样品鲜重（g）；
Vs——显色取样品液的体积（mL）；
X——为从标准曲线上查得样品液NO
2
－浓度。
取样编号
鲜量（g）
A530
标曲上查得样品液
NO
2
－
浓度（X）
O
2
－
含量（μg/gFW）
1
0.998
0.142
27.3
54.7
2
1.025
0.149
27.5
53.75
3
1.018
0.153
29.4
57.7
2024年4月8日发(作者：阮含灵)
植物超氧阴离子自由基含量的测定
一、实验目的
生物体内的一部分氧分子，在参与酶促或非酶促反应时，若只接受一个电子，
会转变为超氧阴离子自由基（O
2
－
）。O
2
－
既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质
直接作用，又能衍生为H
2
O
2
羟自由基（·OH）、单线态氧（1 O
2
）等。·OH可以引
发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基（·R）、
脂氧自由基（RO·）、脂过氧自由基（ROO·）和脂过氧化物（ROOH），自由基积累
过多时会对细胞膜及许多生物大分子产生破坏作用。
本实验主要掌握植物体内氧自由基的测定原理及方法。
二、实验原理
在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自
由基（O
2
－
）。利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O
2
－
含量。O
2
－
与羟胺反应
生成NO
2
－
，NO
2
－
在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对
－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根
据A530值换算成NO
2
－
的浓度，再根据反应式（如下）：
NH
2
OH + 2O
2
－
＋ H
＋
→ NO
2
－
＋ H
2
O
2
＋ H
2
O
可以直接进行O
2
－
化学计量，从而算出样品中O
2
－
含量。
三、实验材料、仪器设备及试剂
1. 材料：新鲜小麦叶片。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液
管；试管架；移液管架；吸耳球等。
3. 试剂配制：
（1）65 mmol·L
－1
磷酸缓冲液（pH7.8）
（2）10 mmol·L
－1
盐酸羟胺
（3）17 mmol·L
－1
对氨基苯磺酸（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
（4）7 mmol·L
－1
α－萘胺（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
（5）亚硝酸钠标准液：称NaNO
2
（AR级）0.1000g，蒸馏水定容至100mL，
摇匀，取5mL用蒸馏水定容到1000mL，即为每毫升含NO
2
－
5μg的标准液。
四、实验步骤
1. 提取液制备
称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L
－1
磷酸缓冲液（pH7.8）
5ml, 研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，上清液即为样品提取液。
2. 亚硝酸根标准曲线的制作
（1）取7支试管，编1～7号，按照下表的顺序添加试剂，每加一种试剂后都
要摇动使之混匀。
表 NO
2
－
标准曲线测定反应体系
试剂（ml）
1
NO2－5μg的标准液
蒸馏水
对氨基苯磺酸
α－萘胺
每管NO
2
－
μg数
试管编号
2
0.1
1.9
4
0.4
20
3
0.2
1.8
4
0.4
40
4
0.4
1.6
4
0.4
80
5
0.6
1.4
4
0.4
120
6
0.8
1.2
4
0.4
160
7
1.0
1.0
4
0.4
200
0
2
4
0.4
0
试剂加完后将各试管置于30℃恒温水浴中保温30min，显色反应后测定A53
0。
（2）标准曲线绘制
以1～7号管亚硝酸根（NO
2
－
）浓度为横坐标，A530吸光度值作纵坐标，绘
制标准曲线。
3. O
2
－
含量测定
取4支试管，编0～3号，1～号管分别加入样品提取液0.5ml（三个重复）
－
（1）NO
2
的产生
试剂ml/试管编号 1 2 3
O2－提取液
PBS缓冲液
盐酸羟胺
2.0
1.5
0.5
2.0
1.5
0.5
2.0
1.5
0.5
25 ℃，保温20 min
（2）NO
2
－
的显色（同标准曲线）
试剂ml/试管编号 1
上述反应液
对氨基苯磺酸
α－萘胺
2.0
2
2.0
3
2.0
30 ℃，保温30 min
显色反应后，以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。
4. O
2
－
含量计算的方法
根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO
2
－
浓度，并换算成O
2
－
的浓度（X），并按照下式计算O
2
－
的含量：
O
2
－
含量（μg/gFW）= 2X×Vt×n/（FW×Vs）
式中， Vt——为样品提取液的体积（mL）；
n ——为测定时样品提取液的稀释倍数；
FW——样品鲜重（g）；
Vs——显色取样品液的体积（mL）；
X——为从标准曲线上查得样品液NO
2
－
浓度。
五、实验结果
（1）标准曲线的绘制结果：
试管编号
每管NO
2
－
μg数
A530
1
0
2
20
3
40
4
80
5
120
6
160
7
200
0.000 0.106 0.239 0.435 0.619 0.834 1.007
标准曲线绘制结果如下：
（2）O2
－
含量计算
根据公式计算得到以下结果：
O
2
－含量（μg/gFW）= 2X×Vt×n/（FW×Vs）式中，
Vt——为样品提取液的体积（mL）；
n ——为测定时样品提取液的稀释倍数；
FW——样品鲜重（g）；
Vs——显色取样品液的体积（mL）；
X——为从标准曲线上查得样品液NO
2
－浓度。
取样编号
鲜量（g）
A530
标曲上查得样品液
NO
2
－
浓度（X）
O
2
－
含量（μg/gFW）
1
0.998
0.142
27.3
54.7
2
1.025
0.149
27.5
53.75
3
1.018
0.153
29.4
57.7