内源性配体 SLURP1经α7亚型烟碱型乙酰胆碱受体介导调控乳牙牙髓干细胞-USB迷|专注于互联网分享

2024年4月26日发(作者：祭碧琳)

内源性配体 SLURP1经α7亚型烟碱型乙酰胆碱受体介导调

控乳牙牙髓干细胞破骨能力的研究

蒋旸;汪璐璐;周志斐;张百泽;王军辉;王小竞

【摘要】AIM:To investigate the role of α7 nAChR and SLURP1 in

differentiation and maturation of oste-oclasts in the process of deciduous

teeth physiological root S:SHEDs from different stages

of de-ciduous teeth physiological root resorption and DPSCs from

permanant teeth were isolated,cultivated and purified by en-zyme

digestion method and limiting dilution cells were identified by

cellular morphology,growth pattern,os-teogenic induction,adipogenic

differentiation and flow cytometry and protein expression of

α7 nAChR was detected by quantitative real-time

PCR,immunofluorescence and semiquantitative optical density

1 and RANKL/OPG gene expression was detected by

quantitative real-time S:Gene and protein expres-sion of α7

nAChR in SHEDs from the middle and the final stage of physiological root

resorption was higher than those from the stable stage and higher than

DPSCs(P <0.05).SLURP1 expression was the highest in the middle stage,fol-

lowed by the final stage,permanent teeth and the stable stage of

deciduous teeth.(P <0.05).RANKL/OPG ratio showed the similar expression

tendency to SLURP1 SION:SLURP1 may regulate the

osteoclas-togenic differentiation of stem cells from human exfoliated

deciduous teeth by binding to α7 nAChR.%目的：初步探讨α7亚型烟碱型乙

酰胆碱受体（α7 nAChR）及其内源性配体 SLURP1在乳牙生理性根吸收过程中

调控破骨细胞分化成熟的可能作用。方法：分离培养并优选乳牙生理性根吸收不同

时期乳牙牙髓干细胞（SHEDs）及恒牙牙髓干细胞（DPSCs），经检测鉴定后，

分别采用实时定量 PCR、免疫荧光染色及半定量光密度分析技术检测各组细胞中

α7 nAChR 基因及蛋白的表达差异；实时定量 PCR 检测各组细胞中SLURP1、经

典成骨／破骨相关因子 RANKL、OPG 基因的表达差异，并进行统计学分析。结

果：乳牙牙根吸收中期及晚期的 SHEDs 中α7 nAChR 基因和蛋白的表达水平显

著高于乳牙牙根稳定期 SHEDs 与恒牙 DPSCs （P ＜0．05）；SLURP1基因表达

水平以乳牙牙根吸收中期最高，晚期次之，恒牙再次之，乳牙牙根稳定期最低，各

组间 P ＜0．05。RANKL／OPG 比值与 SLURP1基因表达趋势一致（P ＜

0．05）。结论：SLURP1与乳牙牙髓干细胞膜上的α7 nAChR 结合后，可通过

调节 RANKL／OPG 的表达比例而影响乳牙牙髓干细胞的破骨能力。

【期刊名称】《牙体牙髓牙周病学杂志》

【年(卷),期】2016(026)009

【总页数】9页(P517-524,541)

【关键词】生理性根吸收;脱落乳牙干细胞;烟碱型乙酰胆碱受体 α7 亚型;SLURP1

【作者】蒋旸;汪璐璐;周志斐;张百泽;王军辉;王小竞

【作者单位】军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军

医大学口腔医院儿童口腔科，陕西西安 710032;军事口腔医学国家重点实验室，

陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院儿童口腔科，陕西西安

710032;军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大

学口腔医院儿童口腔科，陕西西安 710032;军事口腔医学国家重点实验室，陕西

省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院儿童口腔科，陕西西安 710032;

军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医

院儿童口腔科，陕西西安 710032;军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医

学重点实验室，第四军医大学口腔医院儿童口腔科，陕西西安 710032

【正文语种】中文

【中图分类】R780.2

[DOI] 10.15956/.2016.09.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2016,26(9):517]

器官脱落是机体正常生长发育过程中一种生理性的生物学过程，对于机体生理功能

的发挥、内环境稳态的维持具有重要意义。人体内的器官脱落——乳牙脱落对于

乳恒牙顺利替换、口腔环境甚至整个机体的正常生长发育必不可少，而乳牙的脱落

则依赖于乳牙生理性牙根吸收过程的正常进行。但乳牙生理性根吸收机制目前尚未

被阐明[1]，学者们对其的认识主要集中于破骨这一硬组织吸收过程[2]。破骨细胞

的分化成熟过程主要受RANKL和OPG这两种细胞因子的调控，RANKL可通过

与破骨前体细胞表面的RANK受体结合而促使破骨前体细胞向破骨细胞分化，

OPG可与RANK竞争结合RANKL，从而抑制破骨细胞的分化和成熟[3]。

Miura等[4]从脱落的乳牙牙髓中分离培养出了具有自我更新和多向分化潜能的干

细胞，并将其命名为脱落乳牙干细胞(Stem Cells from Human Exfoliated

Deciduous Teeth,SHEDs)，由于这类干细胞来源于乳牙牙髓组织，故有些学者又

称之为乳牙牙髓干细胞，两者并无本质差别。体外实验表明，乳牙牙髓在根吸收期

的RANKL表达水平显著高于恒牙牙髓，牙髓细胞可通过表达RANKL和OPG参

与调节乳牙根吸收；同时还发现，在根吸收活跃期时其SHEDs中RANKL和OPG

的表达水平与其他各时期相比均具有显著性差异[5]。但SHEDs通过何种途径和机

制调控自身RNAKL/OPG的表达尚不清楚。

前期研究报道，α7亚型乙酰胆碱受体(Alpha7 Nicotinic Acetylcholine

Receptors,α7 nAChR)存在于牙源性细胞中，并可通过一系列作用介导骨组织破

坏[6]。另有研究也表明，人体内α7及β2亚型nAChR可介导并调控破骨细胞的

生成[7]。分泌型哺乳动物Ly-6尿激酶型纤溶酶原激活物受体相关蛋白

1(Secreted mammalian leukocyte antigen 6/urokinase-type plasminogen

activator receptor-related protein-1，SLURP1)是Ly-6蛋白超家族分子，其可

作为内源性配体特异性激活α7 nAChR，并进而参与穿膜信号转导、细胞活化及

细胞粘附等过程[8]。有学者报道，SLURP1可通过α7 nAChR的介导调节Ca2+

内流，激活下游多种信号通路[9]。本实验旨在观察SLURP1与乳牙牙髓干细胞膜

上的α7 nAChR结合后，是否可通过调节成骨/破骨相关因子RANKL/OPG的表

达比例而调控SHEDs的破骨能力，初步探讨α7 nAChR与SLURP1在乳牙生理

性根吸收过程中调控破骨细胞分化成熟的可能作用。

α-MEM培养液(Gibco BRL，美国)；胎牛血清(杭州四季青)；PBS缓冲液(Boster，

武汉)；Ⅰ型胶原酶、2.5 g/L胰蛋白酶(Sigma，美国)；Total RNA Extractor

(Trizol)、M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、Green-2-go MasterMix PCR试

剂盒、脱脂奶粉(上海生工)；异丙醇、多聚甲醛(天津富宇)；Triton X-100(MP，

法国)；兔抗人α7 nAChR抗体(Santa Cruz，美国)；Cy3 AffiniPure山羊抗兔

IgG红色IF二抗(Jackson，美国)；Hoechst 33342(Invitrogen，美国)；超净细

胞实验台(SPEG，苏州)；台式离心机(XiangYi，长沙)；CO2恒温细胞培养箱

(Thermo，美国)；流式细胞技术检测仪(Beckman-Coulter，美国)；细胞培养板

(Falcon，美国)；高速离心机(Eppendorf，德国)；紫外分光光度计(BioTek，美

国)；实时定量PCR系统(ABS7500，美国)；CFX-96 实时定量PCR仪(BIO-RAD，

美国)；倒置相差显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、FLUOVIEW Viewer图像处理

软件(Olympus，日本)；Image-Pro Plus 6.0图像处理软件(Media Cybernetics，

美国)。

采集我院儿童口腔科门诊因乳牙滞留而拔除的健康乳切牙，以及颌面外科门诊因正

畸需要拔除的健康第一前磨牙(患者及监护人均知情同意)。牙齿拔出后立即置于装

有4 ℃预冷且含胎牛血清的α-MEM的离心管中(来自不同个体的牙不混装)，并按

前期研究中所采用的分期方法对样本进行分组[10-11]：牙根未见明显吸收的乳牙

记为稳定期组(SHED S)，吸收占牙根长度约1/2但≤2/3的为吸收中期组(SHED

M)，>2/3的为吸收晚期组(SHED F)，恒牙记为恒牙组(DPSC)。判断牙根吸收程

度时，按牙根唇、舌侧吸收程度较高者判定。

细胞培养方法参考前期实验[4,10]。首先取各组离体牙样本，用无菌蒸馏水冲洗后

分别按以下方法取其牙髓组织：根管暴露的SHED M/F 组用无菌拔髓针拔出牙髓，

牙根完整的SHED S/DPSCs 组劈开牙根后取出牙髓。各组牙髓经PBS浸泡洗涤后

剪去其冠方及根尖1～2 mm；所余牙髓组织剪成1～2 mm的组织块，用Ⅰ型胶

原酶37 ℃条件下进行消化后，离心弃上清，沉淀部分用α-MEM重悬并吹打均匀

后，接种于6孔培养板，置37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培养。每3～4 d换液1

次。待细胞生长至80%～90%融合时，常规传代培养，并将其标记为第1代人乳

(恒)牙牙髓细胞。

上述培养结束后，采用有限稀释法克隆优选SHEDs和DPSCs：取各组第1代细

胞，用α-MEM重悬并调整细胞密度为10/mL后，用移液枪各取0.1 mL接种于

平底96孔培养板(每孔1个细胞)，置37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中进行培养。待

细胞克隆生长至占孔底面积约50%时，2.5 g/L胰蛋白酶消化，并将多个孔的细胞

悬液混合；然后再接种于6孔板进行扩增培养。

取第3代SHEDs和DPSCs，分别经消化、离心、重悬后，以1×105/孔的密度接

种于6孔板，常规培养至细胞融合超过80%时，换用成骨诱导液(10 mmol/L β-

甘油磷酸钠、50 μg/mL维生素C、10 nmol/L地塞米松及100 mL/L 胎牛血清的

α-MEM)避光条件下继续培养，每3 d避光换液1次。约4周后PBS洗涤，并加

入40 g/L多聚甲醛液固定30 min；再次PBS洗涤后加入茜素红染色剂(0.1 g/L

茜素红、1 g /L Tris-HCl溶于100 mL ddH2O，pH为8.3)，并置于37 ℃下孵

育30 min；PBS彻底洗去剩余染色剂后，显微镜下观察并照相。

取第3代SHEDs和DPSCs，分别经消化、离心重悬后，以1×105/孔的密度接种

于6孔板，常规培养至细胞融合超过80%时，换用成脂诱导液(含100 mmol/L

吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、2.5 μmol/L地塞米松及100 mL/L 胎牛血清的α-

MEM)避光条件下继续培养，每3 d避光换液1次。约4周后PBS洗涤，并加入

40 g/L 多聚甲醛液固定30 min；再次PBS洗涤后加入油红O染色剂(0.5 g 油红

O溶于100 mL异丙醇作为原液，按3 ∶2 的比例将原液与ddH2O混匀，并置于

室温下孵育10～20 min；PBS彻底洗去剩余染色剂后，显微镜下观察并照相。

取第3代SHEDs和DPSCs，分别经胰酶消化、PBS重复离心洗涤3次后，用含

30 mL/L 胎牛血清的PBS制成密度为1×106的单细胞悬液，并将其分装于1.5

mL EP管中(每管100 mL)。然后按照产品说明书要求的稀释倍数及作用浓度分别

向各管中加入STRO-1-FITC、CD29-FITC、CD105-FITC、CD34-PE及CD45-

PE抗体，并置于室温下避光孵育1 h。PBS离心洗涤后将各管样本转移至流式细

胞管内，并用流式细胞仪检测其细胞表面分子标记物。

取各组优选后的第5代细胞，采用酚-氯仿法提取细胞总RNA，并用紫外分光光度

计测定其纯度。选取260/280值为1.8～2.0的总RNA，使用M-MuLV第一链

cDNA合成试剂盒将其反转录为cDNA后，以cDNA为模板，以β-actin为内参，

使用Green-2-go MasterMix PCR试剂盒进行实时定量PCR反应。所用引物参

照GenBank数据库及相关文献进行设计，并交由上海生工进行合成及检验(表1)。

反应体系为20 μL，分别为：Green-2-go MasterMix 10 μL、上下游引物各

0.2～0.4 μL(100～200 nmol/L)、模板cDNA≤500 ng，其余由RNase-Free

H2O补足；反应条件按产品说明书设定。此外，由于RANKL、OPG基因的表达

趋势较为复杂，无法进行简单判断，故本实验通过计算RANKL/OPG比值以显示

细胞破骨能力的差异，该比值的平均值为两者平均值的商，同时该比值拥有一个名

义标准差，计算公式如下。

取各组优选后的第5代细胞，并以1×105密度接种于孔内放有无菌方玻璃片的

24孔板。常规培养至细胞融合达60%时，PBS洗片，并用40 g/L多聚甲醛液室

温下固定细胞20 min，PBS洗片；滴加PBS稀释的5～10 g/L Triton 37 ℃下通

透15 min；PBS洗片，滴加50 g/L脱脂奶粉37 ℃下封闭30 min，PBS洗片，

滴加TBST稀释的一抗(1 ∶300)，37 ℃下孵育不少于10 h；PBS洗片，滴加PBS

稀释的二抗(1 ∶300)，室温下孵育2 h；PBS洗片，滴加5 mL PBS稀释的小管

Hoechst 33342，衬染细胞核15 min。染色结束后取出各组玻璃片，分别经PBS

洗涤、甘油封片后，用激光共聚焦扫描显微镜在同一曝光条件下对各组细胞样本进

行观察，并采集和处理荧光照片。

从每组中各选取3张拍摄质量较好的荧光照片，使用Image-Pro Plus 6软件计算

平均光密度(IOD)。

用SPSS 16.0软件对数据±s)进行单因素方差分析，两两比较用t检验，检验水准

α=0.05。

SHEDs和DPSCs原代培养2～4 h后，其组织块即能完成贴壁。SHEDs在根吸收

各时期组一般于5～7 d即可观察到细胞从组织块边缘爬出(图1)，DPSCs较

SHEDs时间稍长，约7～10 d(各组细胞从组织块边缘爬出的时间最快为2～3 d，

最慢为10～14 d)。镜下观察显示，根吸收各时期的SHEDs与DPSCs的形态类

似，均呈长梭形、三角形或多角形；细胞核呈圆形，占胞体大部分面积；细胞质透

明(少数细胞的细胞质中含少许不透明颗粒物)，并存在两个或多个长而细的细胞突，

DPSCs胞体较SHEDs稍大；两者均呈放散状或漩涡状分布(图2～3)。各组细胞

经有限稀释法克隆培养7 d左右，可见细胞开始克隆增殖(图4)，2周后克隆长至

约孔底2/3。

乳牙生理性根吸收各时期的SHEDs和恒牙DPSCs经成骨诱导3周后，茜素红染

色可见矿化结节形成(图5A)；成脂诱导3周后，油红O染色可见串珠样脂滴形成

(图5B)。

流式细胞仪检测结果显示，乳牙生理性根吸收各时期SHEDs和恒牙DPSCs均表

达间充质来源细胞的表面分子标记物，即阳性表达STRO-1、CD29、

实时定量PCR结果显示，SHED M/F中的α7 nAChR基因表达水平均显著高于

SHED S和DPSCs，差异均有统计学意义(P<0.05)，而SHED M与SHED F、

SHED S与DPSCs相比，差异均无统计学意义(P>0.05)(图7)。

各组细胞免疫荧光染色后，激光共聚焦显微镜观察结果，蓝色荧光为细胞核，红色

荧光为阳性表达的α7 nAChR蛋白(图8)。半定量光密度分析结果显示，各组细胞

中α7 nAChR蛋白的表达水平以SHED M最高，依次为SHED M>SHED

F>DPSCs>SHED S; 各组间两两相比，除SHED M与SHED F组间无统计学差异

(P>0.05)外，其他各组间差异均有统计学意义(P<0.05)(图9)。

实时定量PCR结果显示：各组细胞中 SLURP1基因的表达水平以SHED M最高，

依次为SHED M>SHED F>DPSCs>SHED S，各组间两两相比差异均有统计学意

义(P<0.05)(图10)。

实时定量PCR结果显示：各组细胞中RANKL基因的表达水平以SHED M最高，

依次为SHED M>SHED S>SHED F>DPSCs，各组间两两相比除SHED F与

DPSCs组间无统计学差异(P>0.05)外，其他各组间两两相比差异均有统计学意义

(P<0.05)；各组细胞中OPG基因的表达水平以SHED S最高，依次为SHED

S>SHED M>SHED F>DPSCs，各组间两两相比除SHED M与SHED F组间无统

计学差异(P>0.05)外，其他各组间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)(图11)。

RANKL/OPG比值计算结果显示以SHED M最高，依次为SHED

M>DPSCs>SHED S>SHED F；各组间两两相比除SHED S与DPSCs组间无统计

学差异(P>0.05)外，其他各组间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)(图12)。

有学者报道，通过两种不同实验方法处理获

目前研究认为，α7亚型nAChR是机体内的一种具有介导、调控免疫机能以及炎

症反应的受体。本课题组前期实验证实，α7 nAChR在其特异性配体尼古丁的激

活下，可负性调控hPDLSCs的成骨能力，并进而影响炎症反应的进程[15]。本实

验结果表明，α7 nAChR的基因表达水平在乳牙生理性根吸收的不同阶段有所差

异，在乳牙牙根吸收期(中、晚期)，α7 nAChR基因的表达水平显著高于乳牙牙根

稳定期以及恒牙。以上结果提示，在乳牙生理性根吸收过程中，可通过上调α7

nAChR基因的表达水平，而参与某些信号通路的激活，并调节其下游分子表达，

进而影响SHEDs破骨能力的发挥。

本实验在免疫荧光染色实验中还发现，α7 nAChR蛋白的表达水平在乳牙生理性

根吸收的不同阶段有所差异,且与实时定量PCR结果相符。主要表现为，在乳牙生

理性根吸收相对活跃的中、晚期，其牙髓干细胞在基因和蛋白水平上高表达α7

nAChR，而在牙根尚未开始吸收(牙根稳定期)的SHEDs和对照组DPSCs中，α7

nAChR基因和蛋白的表达水平低下。提示，α7 nAChR在乳牙生理性牙根吸收过

程中可能扮演着重要的角色。除此之外，DPSCs中的 α7 nAChR基因和蛋白的表

达水平高于SHED S，说明α7 nAChR可能还具有介导并调控根吸收过程之外的

作用。

SLURP1蛋白是由Adermann等[16](1999)首次从人的血液或尿液肽库中纯化获

得，并对其具体结构进行了研究。法国学者Fischer等[17](2001)首次报道了人类

SLURP1基因突变可引发一种罕见的先天遗传病——先天性掌跖角化症。近年来，

SLURP1逐渐成为学者们研究的热点。最近的研究证实，SLURP1是α7 nAChR

的特异性变构配体，可在环境中特异性与α7 nAChR结合而使其变构并增强

Ca2+的内流[18]。本实验中实时定量PCR检测结果显示，SLURP1基因的表达水

平在乳牙牙根稳定的SHEDs中表达最低，DPSCs中次之; 在乳牙根吸收晚期的

SHED F中较高，吸收中期的SHED M中(最活跃期)最高。提示，在人牙髓组织中，

SLURP1可能通过自分泌或旁分泌的形式影响SHEDs、DPSCs硬组织吸收能力的

发挥；在乳牙牙根稳定期时，SLURP1的表达水平虽较低下，但仍有表达，提示

SLURP1作为一个细胞的常规表达分子，可能在细胞正常生活中扮演一定角色。在

乳牙生理性根吸收中期，硬组织吸收快速进行，SHEDs可通过上调自身SLURP1

表达，并通过α7 nAChR介导，而上调自身的破骨分化及诱导破骨的能力。在乳

牙根吸收晚期时，SHEDs可通过下调自身SLURP1表达，而降低硬组织吸收速度，

并直至趋于抑制。DPSCs中SLURP1的表达水平虽进一步降低，但仍高于乳牙牙

根稳定期的SHEDs，其原因可能是由于乳牙牙根未吸收时的机体年龄尚幼，口腔

骨骼发育迅速(即成骨能力高涨)，因此与破骨能力相关的SLURP1表达水平较低。

RANKL和OPG是公认的成骨/破骨的相关重要因子。学者们认为，由于

RANKL/OPG的表达趋势较为复杂，应通过计算RANKL/OPG的比值来具体呈现

细胞破骨能力的高低。当该比值大于1时，表明破骨细胞的分化成熟过程处于激

活状态，且比值越高，表明破骨能力越强；当该比值小于1时，表明破骨细胞的

分化成熟过程处于抑制状态，且比值越低，破骨能力越弱，相对成骨能力越强。本

结果显示，在乳牙根吸收中期的SHEDs中 RANKL/OPG比值显著增高，说明乳

牙生理性根吸收最活跃时期的SHEDs可显著促进破骨前体细胞向破骨细胞分化成

熟；而乳牙根吸收晚期的SHEDs中RANKL/OPG比值最低，说明其破骨能力明

显受到抑制，可能是因为乳牙牙根吸收基本完成，硬组织吸收逐渐停滞，故

SHEDs自身通过调节分子的表达而降低了其促进破骨细胞成熟的能力；乳牙牙根

稳定期SHEDs及恒牙DPSCs的破骨能力中等，其原因可能是由于其作为干细胞，

一直拥有在一定条件或刺激下进行组织修复的能力，并在机体稳态下保持成骨/破

骨能力的相对平衡。

根据本结果和相关研究报道，我们推测SLURP1可能通过自分泌或旁分泌的方式，

与其乳牙牙髓干细胞膜上的特异性变构受体α7 nAChR结合，并通过一定细胞内

分子途径调节RANKL/OPG的表达比例，进而影响乳牙牙髓干细胞的破骨分化调

控能力。但是，有关该通路的上游SLURP1是如何被激活表达的，通路中的网状

调控分子机制以及反馈机制等，还需进一步的研究探索。