2024年4月28日发(作者：夹谷浩歌)
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
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HuangC,WangY,LiX,alfeaturesofpatients
渊收稿日期院2021-02-19冤
赵
[
锋袁刘
]
翔袁李少民袁刘倩袁刘丽娟袁任晓英袁李建忠
反应中的具体机制遥
染尘巨噬细胞炎症反应是矽肺发病的重要环节袁本研究拟探讨ADSC外泌体中MT1在染尘巨噬细胞抗炎
NIK进行免疫共沉淀袁检测MT1与磷酸化NIK存是否存在相互作用袁并验证MT1蛋白表达对抑制磷酸化NF
-
资Bp52尧磷酸化
NIK和磷酸化IKK琢蛋白表达作用遥
成功获取外泌体曰Label
-
free蛋白质组学和Westernblot结果显示MT1在ADSC外泌体较BMSC外泌体中高表达遥
奠定理论基础遥
[
老年
建立MT1蛋白过表达和功能缺失的ADSC袁利用Westernblot检测是否构建成功遥将MT1与磷酸化
成功获取老年C57B/L6小鼠的ADSC和BMSC袁透射电镜和Westernblot结果显示
C57B/L6小鼠的ADSC较BMSC外泌体含有更多的MT1袁可能为老年供体来源ADSC外泌体应用于抗炎治疗提供实验依据及
]ADSC外泌体曰MT1曰矽肺曰实验
1004
-0188渊2021冤03-
0223
-
06
R135.2
A
doi:
10.3969/.1004
-
0188.2021.03.011
一
[1]
袁中老年患者是最主要的发病群体
[2]
遥染尘巨噬
细胞的炎症反应与矽肺的发生和进展密切相关袁探
索抑制矽肺染尘巨噬细胞炎症反应的方案及其具
体机制具有重要意义遥近年来袁脂肪干细胞(ADSC)外
:国家自然科学青年基金渊81903268冤
院710004西安袁西安交通大学第二附属医院胸外科
渊赵锋袁李少民袁刘倩袁刘丽娟袁任晓英袁李建忠冤曰江西省萍乡
市第二人民医院外科渊刘翔冤
院李建忠袁E-mail院jianzhong-************
矽肺是我国高发病率和高病死率的职业病之泌体抑制巨噬细胞炎症反应的作用及其机制研究已
经成为研究热点
[3-4]
遥ADSC外泌体作为ADSC治疗的
新兴工具袁具有与ADSC相似的生物活性物质
[5]
遥前
MT1)在老年供体来源ADSC外泌体中较骨髓间充
证实MT1属于金属硫蛋白亚型袁在炎症反应中可抑
期实验结果显示金属硫蛋白玉(metallothionein玉,
质干细胞(BMSC)外泌体中高表达遥通过回顾文献袁
制NF
-
资B信号激活
[6-7]
袁进而抑制炎症反应的发生尧
发展遥本课题拟在前期工作基础上袁以MT1调控为
窑224窑
切入点袁探讨老年供体来源ADSC外泌体抑制矽
肺染尘巨噬细胞炎症反应的作用及其具体机制袁为
矽肺治疗提供思路和依据遥
试剂与设备实验中的主要设备有院恒温振荡
器渊上海精密仪器公司冤曰台式离心机渊美国Beckman
公司冤曰超净工作台渊日本Ck
-
2公司冤曰流式细胞仪渊美
国Beckman公司冤;细胞冻存盒渊美国Nalgene公司冤曰
酶标仪渊美国BioTek公司冤等遥
渊99%
纯度高于
颗粒直径
99%
臆5
的
滋m冤曰1640
SiO
2
购买自美国
培养液
Simga
购自美
公司
Gibco
有限公司
公司
曰BCA
曰青霉素和链霉素来自碧云天生物技术
国
蛋白浓度测定试剂盒尧双荧光素酶
报告基因试剂盒尧DAPI尧Cy3及FITC染料均购自碧
云天生物技术有限公司等遥
C57BL/6
实
小鼠
验动
袁
物
12~14
及饲
月龄
养
袁由西安交通大学实验
健康的老年SPF级
动物中心提供遥研究涉及的所有动物实验均获得西
安交通大学动物伦理委员会的审核批准遥
模型制备与分组用含10%新生小牛血清
和青链霉素双抗的RPMI1640培养液调成细胞密
度1伊10
9
接种好的
AM/L
(SiO2
6孔板中分别加入一定量的粉尘溶液
的RAW264.7小鼠巨噬细胞悬液遥将
节为下列浓度
粉尘悬液
:0尧6.25尧12.5尧
),用无血清的
25.0尧50.0尧100.0
RPMI1640培养液调
mg/L袁
将其诱导为染尘巨噬细胞
[8]
C57BL/6
分离和培养ADSC和
遥
BMSC
边脂肪组织
小鼠
袁用眼科剪小心剔除血管及结缔组织
渊21~24月龄冤处死后袁消毒
健
袁
康的老年
取附睾周
袁剪
碎后加入等体积2%玉型胶原酶袁37益孵育袁10min
震荡
5
重悬
min袁
1
袁接种
含
次遥
10%
筛网
遥处死健康的老年
胎牛血清
渊100目冤
渊FBS冤
过滤组织
的
C57BL/6
DMEM/F12
袁1200r/min
小鼠
培养基
离心
渊21~24
月龄
PBS
冤袁取双下肢骨髓袁离心后将10
基重悬细胞后接种于小皿中
重新悬浮制备细胞混匀液
袁置于
遥2ml
ml
37
10%
预先冷却的
益袁5%
FBS
CO
培养
养箱内进行培养遥
2
培
建立MT1功能过表达/缺失ADSC模型为
研究
shRNA
MT1
功能缺失的
载体感染
的功能袁
ADSC袁
ADSC
利用慢病毒介导的基因过表达/
[9]
利用Western
袁建立MT1
blot
蛋白过表达和
检测是否构建
成功遥
将1伊10
SiO
6
RAW264.7
2
粉尘刺激巨噬细胞形成染尘巨噬细胞
小鼠巨噬细胞接种于25cm
2
培养
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
瓶中袁加入SiO
2
悬液袁配置成SiO
2
浓度为100滋g/ml袁
加入到巨噬细胞培养液中培养24h袁将其诱导为染
尘巨噬细胞
[8]
免疫共沉淀检测
遥
MT1蛋白与磷酸化NIK蛋
白存在相互作用
ADSC
取MT1过表达/shRNA载体感染
巨噬细胞总蛋白
和BMSC无血清的细胞培养上清液
袁SDS
-
PAGE上样进行电泳
遥提取染尘
袁用半干
转印仪进行转膜
MT1抗体尧NIK抗体
袁按
袁
1颐1000
4益过夜后加入
的比例稀释
1颐3000
IgG抗体
稀释
尧
的二抗袁室温孵育1h后袁进行显色遥
检测NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢蛋白磷酸化
水平取5伊10
6
个染尘巨噬细胞袁PBS洗3次袁提
取细胞蛋白袁调整浓度后蛋白上样袁检测检测磷酸
化IKK琢尧磷酸化NF
-
kBp50尧磷酸化NF
-
kBp52尧磷
酸化NIK尧磷酸化NF
-
kBp65尧磷酸化NF
-
kBp100尧
和RelB
为内参
的蛋白表达
遥
袁结果扫描并定量分析袁以茁
-
actin
收集染尘巨噬细胞
ELISA检测染尘巨噬细胞炎症因子的分泌
24h上清液袁根据IL
-
TNF
1茁尧IL
-
6及
及标准品稀释至储存浓度
-
琢ELISA试剂盒的要求
遥
袁
依照说明书
将捕获抗体
袁
尧检测抗体
稀释标准
品袁每孔加入100滋l不同浓度的标准品或者待测
培养上清遥PBS冲洗后袁加入辣根过氧化物酶后孵
育
450
20
nm
min袁显色后避光孵育20min袁使用酶标仪在
统计学方法
处读数袁计算出相应细胞因子浓度
应用SPSS21.0统计软件进
遥
行数据分析袁实验结果为计量资料袁用均数依标准
差表示袁同时间点多组别间的测量值比较采用单
因素方差分析渊冤袁当差异有统计学意义袁采
用法进行两两比较袁<0.05为差异有统计
学意义遥
病
ADSC_MT1过表达和ADSC_MT1shRNA慢
ADSC_MT1
毒转染影对
转染48h后
过表达和
响外泌体
袁根据倒置荧光显微镜下观察
ADSC_MT1
中MT1蛋
shRNA
白表达
组
袁ADSC
ADSC
可见明显的绿色荧光袁证明慢病毒转染成功遥为了
研究转染效果
blot
袁以茁
-
actin作为内参袁
ADSC_MT1
实验检测转染后
shRNA组
MT1
的MT1
的蛋白表达水平
通过Western
蛋白表达水
袁
平
发现
ADSC_MT1过表达组降低遥见图1遥
较
磷酸化
ADSC
NIK蛋白存在相互作用
外泌体中MT1蛋白与染尘巨噬细胞中
NIK进行免疫共沉淀袁分析结果显示
将MT1
MT1
与磷酸化
处有明
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
显的差异条带袁说明用免疫共沉淀方法证实MT1
与磷酸化NIK存在相互作用遥通过Westernblot实
验检SiO
2
组NF
-
kBp50和NF
-
kBp52的蛋白表达水
平袁表明ADSC_MT1过表达组的NF
-
kBp50和NF
-
图2遥
水平
kBp52蛋白表达水平较SiO
2
组过表达组降低遥见
MT1抑制NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢蛋白表达
分泌
窑225窑
ELISA检测染尘巨噬细胞培养液中炎症因子
ELISA结果显示MT1过表达显著抑制了染
尘巨噬细胞细IL
-
1茁尧IL
-
6及TNF
-
琢分泌量遥巨噬细胞
经过SiO
2
组激后袁明显增加了TNF
-
琢尧IL
-
1茁和IL
-
6
的分泌量遥同时分别加入ADSC_MT1过表达组较
IL
-
6的分泌量遥见图4遥
ADSC
-
shRNA组相比袁明显降低了TNF
-
琢尧IL
-
1茁和
NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢磷酸化蛋白水平的表达遥
ADSC
-
shRNA组对NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢磷酸化
蛋白水平抑制最弱遥见图3遥
ADSC过表达组较其他组更显著抑制了
矽肺是我国最常见的一种职业病袁严重危害患
者的健康遥研究已经证实袁粉尘致肺泡巨噬细胞炎
淤
淤
A尧B尧C尧D院ADSC_MT1过表达和ADSC_MT1shRNA慢病毒转染情况曰E尧F尧G院ADSC_MT1过表达载体和
ADSC_MT1shRNA载体转染对ADSC外泌体MT1蛋白表达的影响(注院ADSC
-
Ex:脂肪干细胞外泌体袁
BMSC
-
Ex:骨髓间充质干细胞外泌体袁淤<0.05)
淤
淤
A尧B尧C:老年供体来源ADSC外泌体中MT1和染尘巨噬细胞中磷酸化NIK的免疫共沉淀反应袁阴性对照为IgG曰
B尧C:WB结果显示袁与磷酸化NF
-
资Bp50相比袁MTI更显著抑制了磷酸化NF
-
资Bp52的表达水平渊注院ADSC
-
Ex:
脂肪干细胞外泌体袁BMSC
-
Ex:骨髓间充质干细胞外泌体院淤<0.05冤
窑226窑
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
A尧B尧C尧D:MT1过表达抑制了NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢的表达水平渊注院ADSC
-
Ex:脂肪干细胞
外泌体袁BMSC
-
Ex:骨髓间充质干细胞外泌体,淤<0.05冤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
A尧B尧C:MT1过表达显著抑制了染尘巨噬细胞细炎症因子IL
-
1茁尧IL
-
6及TNF
-
琢分泌量渊注院ADSC
-
Ex:
脂肪干细胞外泌体袁BMSC
-
Ex:骨髓间充质干细胞外泌体袁淤<0.05冤
症反应是矽肺形成的一个重要环节
[1-2]
遥当粉尘进
入机体后袁肺泡巨噬细胞聚集到损伤组织周围并
激活NF
-
资B信号通路袁该通路的激活导致巨噬细
胞尧T细胞及相关因子聚集袁加速肺部炎症和纤维
化反应
[3]
遥虽然经过医务工作者和研究人员的不断
努力袁但临床上尚未找到有效的矽肺治疗方法遥自
身来源的间充质干细胞因无伦理限制尧抗炎尧易于
分离和培养等优点
[4]
袁已成为矽肺治疗的研究热点遥
BMSC因无免疫原性和无伦理争议等袁是目前研究
最多的干细胞遥然而袁在临床中发现骨髓含量随着
衰老迅速减少遥但老年患者脂肪来源丰富袁可以从
皮下脂肪组织中大量获取遥流行病学研究发现矽肺
患者群体中袁以中老年患者居多袁因此对于大部分
矽肺患者而言袁ADSC较BMSC来源丰富遥最新文
献和前期研究同样发现袁而且老年患者来源ADSC
具有更显著的抗凋亡能力
[5,10]
遥
既往研究和前期结果发现袁ADSC和BMSC移
植可通过抗炎反应抑制矽肺的发生尧发展袁对矽肺
有着积极的治疗作用
[4,11]
袁而且ADSC较BMSC更显
构信息复合体袁含有各种与来源细胞相似蛋白尧
RNA尧micRNA及siRNA等生物活性物质
[15]
袁现广泛
用于科学研究
[16]
遥研究证实ADSC外泌体可抑制巨噬
细胞炎症反应
[17-18]
遥MT1属于金属硫蛋白亚型袁MT1
著的降低了炎症反应
[6-7,12-14]
遥外泌体是一种亚细胞结
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
可通过抑制
NF
NF
-
资B信号激活
[19-20]
遥然而袁MT1抑制
要通过经典通路和非经典通路激活
-
资B信号的机制存在争议遥既往研究发现
NF
-
资B
[21]
本研究为进一步研究ADSC与BMSC外泌体中
遥
NIK主
MT1
过表达和
对染尘巨噬细胞的作用
MTI敲减的ADSC袁
袁前期成功构建了
通过Westernblot
MTI
证
渊
实转染影响了
图
ADSC外泌体中MTI蛋白表达水平
Western
1冤遥
提示ADSC
blot
将MT1
外泌体中的
结果显示
与磷酸化
MT1
NIK
MT1
与
可能通过
NIK
进行免疫共沉淀
存在相互作用
袁
NIK发挥抗
袁
炎作用
NF
渊图2冤遥为进一步明确MT1通过NIK激活
染尘巨噬细胞行
-
资B的具体机制
Western
袁将添加了
blot检测磷酸化
ADSC外泌体培养的
NF
-
资Bp50
和磷酸化NF
-
资Bp52蛋白水平袁结果显示ADSC外泌
体更显著抑制了
ADSC
NF
-
资Bp52蛋白磷酸化水平袁
抗炎作用
外泌体中MT1可能主要通过非经典通路发挥
提示
资B
非经典信号通路的共同上游激酶
inducing
遥研究证实
kinase,
袁NF
-
NIK)
资B
是
诱导激酶
NF
(nuclearfactor
--
资B
袁
经典信号通路和
对促进NF
-
资B的
激活至
kappa
p65)袁
B
关重要
也可以通过
kinase
袁
琢)/IKK茁
既可以
NIK/IKK琢/P100
经典通路激活
通过NIK/IKK琢
非经典通路激活
NF
(inhibitor
--
资B(p50/
NF
加了
-
资B2(p52/RelB)遥
ADSC外泌体
本研究通过
培养的染尘
Western
巨噬细
blot
胞磷
检测添
NIK尧磷酸化IKK琢和磷酸化NF
酸化
平袁结果显示MT1过表达显著抑制了非经典通路中
-
资Bp52炎症蛋白水
蛋白表达袁表明ADSC外泌体中MT1通过NF
-
资B经
非经典信号通路NIK/IKK琢/P100抑制染尘巨噬细
胞炎性进展
MT1
及TNF
蛋白表达越高
遥此外袁ELISA
-
琢越低袁提示
袁
ADSC
染尘巨噬细胞分泌
检测结果显示袁
外泌体中MT1
IL
外泌体中
抑制了染
-
1茁尧IL
-
6
尘巨噬细胞IL
-
1茁尧IL
-
6及TNF
-
琢分泌遥
综上所述袁本研究提出科学假设院老年供体来
源ADSC外泌体具有抑制矽肺炎症反应的作用袁可
能主要通过
NIK/IKK琢/P100
MT1
介导的
抑制染尘巨噬细胞中非经典通路
抗炎作用遥
NF
-
资B2(p52/RelB)激活发挥
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170(2):352
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-366.
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窑228窑
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2+
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渊收稿日期院2020-12-23冤
本刊法定计量单位具体使用参照1991年中华医学会编辑出版部编辑的叶法定计量单位在医学上的应
用曳一书遥注意单位名称与单位符号不可混合使用袁如ng/渊kg窑天冤袁应改为ng/渊kg窑d冤曰组合单位符号中表示相
除的斜线不应多于1条袁如ng辕kg辕min应写为ng/渊kg窑min冤的形式曰组合单位中斜线和负数幂亦不可混用袁如
前例不宜采用ng辕kg窑min
-1
的形式遥在首次出现不常用的法定计量单位处用括号加注与旧制单位的换算系
用括号加注(1mmHg=0援133kPa)遥正文中时间的表达袁凡前面带有具体数据者应采用d尧h尧min尧s袁而不用天尧
小时尧分钟尧秒遥量的符号一律用斜体字母遥
数袁下文再出现时只列法定计量单位遥人体及动物体内的压力单位使用mmHg或cmH
2
O袁但文中首次出现时
2024年4月28日发(作者：夹谷浩歌)
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
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HuangC,WangY,LiX,alfeaturesofpatients
渊收稿日期院2021-02-19冤
赵
[
锋袁刘
]
翔袁李少民袁刘倩袁刘丽娟袁任晓英袁李建忠
反应中的具体机制遥
染尘巨噬细胞炎症反应是矽肺发病的重要环节袁本研究拟探讨ADSC外泌体中MT1在染尘巨噬细胞抗炎
NIK进行免疫共沉淀袁检测MT1与磷酸化NIK存是否存在相互作用袁并验证MT1蛋白表达对抑制磷酸化NF
-
资Bp52尧磷酸化
NIK和磷酸化IKK琢蛋白表达作用遥
成功获取外泌体曰Label
-
free蛋白质组学和Westernblot结果显示MT1在ADSC外泌体较BMSC外泌体中高表达遥
奠定理论基础遥
[
老年
建立MT1蛋白过表达和功能缺失的ADSC袁利用Westernblot检测是否构建成功遥将MT1与磷酸化
成功获取老年C57B/L6小鼠的ADSC和BMSC袁透射电镜和Westernblot结果显示
C57B/L6小鼠的ADSC较BMSC外泌体含有更多的MT1袁可能为老年供体来源ADSC外泌体应用于抗炎治疗提供实验依据及
]ADSC外泌体曰MT1曰矽肺曰实验
1004
-0188渊2021冤03-
0223
-
06
R135.2
A
doi:
10.3969/.1004
-
0188.2021.03.011
一
[1]
袁中老年患者是最主要的发病群体
[2]
遥染尘巨噬
细胞的炎症反应与矽肺的发生和进展密切相关袁探
索抑制矽肺染尘巨噬细胞炎症反应的方案及其具
体机制具有重要意义遥近年来袁脂肪干细胞(ADSC)外
:国家自然科学青年基金渊81903268冤
院710004西安袁西安交通大学第二附属医院胸外科
渊赵锋袁李少民袁刘倩袁刘丽娟袁任晓英袁李建忠冤曰江西省萍乡
市第二人民医院外科渊刘翔冤
院李建忠袁E-mail院jianzhong-************
矽肺是我国高发病率和高病死率的职业病之泌体抑制巨噬细胞炎症反应的作用及其机制研究已
经成为研究热点
[3-4]
遥ADSC外泌体作为ADSC治疗的
新兴工具袁具有与ADSC相似的生物活性物质
[5]
遥前
MT1)在老年供体来源ADSC外泌体中较骨髓间充
证实MT1属于金属硫蛋白亚型袁在炎症反应中可抑
期实验结果显示金属硫蛋白玉(metallothionein玉,
质干细胞(BMSC)外泌体中高表达遥通过回顾文献袁
制NF
-
资B信号激活
[6-7]
袁进而抑制炎症反应的发生尧
发展遥本课题拟在前期工作基础上袁以MT1调控为
窑224窑
切入点袁探讨老年供体来源ADSC外泌体抑制矽
肺染尘巨噬细胞炎症反应的作用及其具体机制袁为
矽肺治疗提供思路和依据遥
试剂与设备实验中的主要设备有院恒温振荡
器渊上海精密仪器公司冤曰台式离心机渊美国Beckman
公司冤曰超净工作台渊日本Ck
-
2公司冤曰流式细胞仪渊美
国Beckman公司冤;细胞冻存盒渊美国Nalgene公司冤曰
酶标仪渊美国BioTek公司冤等遥
渊99%
纯度高于
颗粒直径
99%
臆5
的
滋m冤曰1640
SiO
2
购买自美国
培养液
Simga
购自美
公司
Gibco
有限公司
公司
曰BCA
曰青霉素和链霉素来自碧云天生物技术
国
蛋白浓度测定试剂盒尧双荧光素酶
报告基因试剂盒尧DAPI尧Cy3及FITC染料均购自碧
云天生物技术有限公司等遥
C57BL/6
实
小鼠
验动
袁
物
12~14
及饲
月龄
养
袁由西安交通大学实验
健康的老年SPF级
动物中心提供遥研究涉及的所有动物实验均获得西
安交通大学动物伦理委员会的审核批准遥
模型制备与分组用含10%新生小牛血清
和青链霉素双抗的RPMI1640培养液调成细胞密
度1伊10
9
接种好的
AM/L
(SiO2
6孔板中分别加入一定量的粉尘溶液
的RAW264.7小鼠巨噬细胞悬液遥将
节为下列浓度
粉尘悬液
:0尧6.25尧12.5尧
),用无血清的
25.0尧50.0尧100.0
RPMI1640培养液调
mg/L袁
将其诱导为染尘巨噬细胞
[8]
C57BL/6
分离和培养ADSC和
遥
BMSC
边脂肪组织
小鼠
袁用眼科剪小心剔除血管及结缔组织
渊21~24月龄冤处死后袁消毒
健
袁
康的老年
取附睾周
袁剪
碎后加入等体积2%玉型胶原酶袁37益孵育袁10min
震荡
5
重悬
min袁
1
袁接种
含
次遥
10%
筛网
遥处死健康的老年
胎牛血清
渊100目冤
渊FBS冤
过滤组织
的
C57BL/6
DMEM/F12
袁1200r/min
小鼠
培养基
离心
渊21~24
月龄
PBS
冤袁取双下肢骨髓袁离心后将10
基重悬细胞后接种于小皿中
重新悬浮制备细胞混匀液
袁置于
遥2ml
ml
37
10%
预先冷却的
益袁5%
FBS
CO
培养
养箱内进行培养遥
2
培
建立MT1功能过表达/缺失ADSC模型为
研究
shRNA
MT1
功能缺失的
载体感染
的功能袁
ADSC袁
ADSC
利用慢病毒介导的基因过表达/
[9]
利用Western
袁建立MT1
blot
蛋白过表达和
检测是否构建
成功遥
将1伊10
SiO
6
RAW264.7
2
粉尘刺激巨噬细胞形成染尘巨噬细胞
小鼠巨噬细胞接种于25cm
2
培养
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
瓶中袁加入SiO
2
悬液袁配置成SiO
2
浓度为100滋g/ml袁
加入到巨噬细胞培养液中培养24h袁将其诱导为染
尘巨噬细胞
[8]
免疫共沉淀检测
遥
MT1蛋白与磷酸化NIK蛋
白存在相互作用
ADSC
取MT1过表达/shRNA载体感染
巨噬细胞总蛋白
和BMSC无血清的细胞培养上清液
袁SDS
-
PAGE上样进行电泳
遥提取染尘
袁用半干
转印仪进行转膜
MT1抗体尧NIK抗体
袁按
袁
1颐1000
4益过夜后加入
的比例稀释
1颐3000
IgG抗体
稀释
尧
的二抗袁室温孵育1h后袁进行显色遥
检测NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢蛋白磷酸化
水平取5伊10
6
个染尘巨噬细胞袁PBS洗3次袁提
取细胞蛋白袁调整浓度后蛋白上样袁检测检测磷酸
化IKK琢尧磷酸化NF
-
kBp50尧磷酸化NF
-
kBp52尧磷
酸化NIK尧磷酸化NF
-
kBp65尧磷酸化NF
-
kBp100尧
和RelB
为内参
的蛋白表达
遥
袁结果扫描并定量分析袁以茁
-
actin
收集染尘巨噬细胞
ELISA检测染尘巨噬细胞炎症因子的分泌
24h上清液袁根据IL
-
TNF
1茁尧IL
-
6及
及标准品稀释至储存浓度
-
琢ELISA试剂盒的要求
遥
袁
依照说明书
将捕获抗体
袁
尧检测抗体
稀释标准
品袁每孔加入100滋l不同浓度的标准品或者待测
培养上清遥PBS冲洗后袁加入辣根过氧化物酶后孵
育
450
20
nm
min袁显色后避光孵育20min袁使用酶标仪在
统计学方法
处读数袁计算出相应细胞因子浓度
应用SPSS21.0统计软件进
遥
行数据分析袁实验结果为计量资料袁用均数依标准
差表示袁同时间点多组别间的测量值比较采用单
因素方差分析渊冤袁当差异有统计学意义袁采
用法进行两两比较袁<0.05为差异有统计
学意义遥
病
ADSC_MT1过表达和ADSC_MT1shRNA慢
ADSC_MT1
毒转染影对
转染48h后
过表达和
响外泌体
袁根据倒置荧光显微镜下观察
ADSC_MT1
中MT1蛋
shRNA
白表达
组
袁ADSC
ADSC
可见明显的绿色荧光袁证明慢病毒转染成功遥为了
研究转染效果
blot
袁以茁
-
actin作为内参袁
ADSC_MT1
实验检测转染后
shRNA组
MT1
的MT1
的蛋白表达水平
通过Western
蛋白表达水
袁
平
发现
ADSC_MT1过表达组降低遥见图1遥
较
磷酸化
ADSC
NIK蛋白存在相互作用
外泌体中MT1蛋白与染尘巨噬细胞中
NIK进行免疫共沉淀袁分析结果显示
将MT1
MT1
与磷酸化
处有明
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
显的差异条带袁说明用免疫共沉淀方法证实MT1
与磷酸化NIK存在相互作用遥通过Westernblot实
验检SiO
2
组NF
-
kBp50和NF
-
kBp52的蛋白表达水
平袁表明ADSC_MT1过表达组的NF
-
kBp50和NF
-
图2遥
水平
kBp52蛋白表达水平较SiO
2
组过表达组降低遥见
MT1抑制NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢蛋白表达
分泌
窑225窑
ELISA检测染尘巨噬细胞培养液中炎症因子
ELISA结果显示MT1过表达显著抑制了染
尘巨噬细胞细IL
-
1茁尧IL
-
6及TNF
-
琢分泌量遥巨噬细胞
经过SiO
2
组激后袁明显增加了TNF
-
琢尧IL
-
1茁和IL
-
6
的分泌量遥同时分别加入ADSC_MT1过表达组较
IL
-
6的分泌量遥见图4遥
ADSC
-
shRNA组相比袁明显降低了TNF
-
琢尧IL
-
1茁和
NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢磷酸化蛋白水平的表达遥
ADSC
-
shRNA组对NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢磷酸化
蛋白水平抑制最弱遥见图3遥
ADSC过表达组较其他组更显著抑制了
矽肺是我国最常见的一种职业病袁严重危害患
者的健康遥研究已经证实袁粉尘致肺泡巨噬细胞炎
淤
淤
A尧B尧C尧D院ADSC_MT1过表达和ADSC_MT1shRNA慢病毒转染情况曰E尧F尧G院ADSC_MT1过表达载体和
ADSC_MT1shRNA载体转染对ADSC外泌体MT1蛋白表达的影响(注院ADSC
-
Ex:脂肪干细胞外泌体袁
BMSC
-
Ex:骨髓间充质干细胞外泌体袁淤<0.05)
淤
淤
A尧B尧C:老年供体来源ADSC外泌体中MT1和染尘巨噬细胞中磷酸化NIK的免疫共沉淀反应袁阴性对照为IgG曰
B尧C:WB结果显示袁与磷酸化NF
-
资Bp50相比袁MTI更显著抑制了磷酸化NF
-
资Bp52的表达水平渊注院ADSC
-
Ex:
脂肪干细胞外泌体袁BMSC
-
Ex:骨髓间充质干细胞外泌体院淤<0.05冤
窑226窑
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
A尧B尧C尧D:MT1过表达抑制了NF
-
资Bp52尧NIK和IKK琢的表达水平渊注院ADSC
-
Ex:脂肪干细胞
外泌体袁BMSC
-
Ex:骨髓间充质干细胞外泌体,淤<0.05冤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
淤
A尧B尧C:MT1过表达显著抑制了染尘巨噬细胞细炎症因子IL
-
1茁尧IL
-
6及TNF
-
琢分泌量渊注院ADSC
-
Ex:
脂肪干细胞外泌体袁BMSC
-
Ex:骨髓间充质干细胞外泌体袁淤<0.05冤
症反应是矽肺形成的一个重要环节
[1-2]
遥当粉尘进
入机体后袁肺泡巨噬细胞聚集到损伤组织周围并
激活NF
-
资B信号通路袁该通路的激活导致巨噬细
胞尧T细胞及相关因子聚集袁加速肺部炎症和纤维
化反应
[3]
遥虽然经过医务工作者和研究人员的不断
努力袁但临床上尚未找到有效的矽肺治疗方法遥自
身来源的间充质干细胞因无伦理限制尧抗炎尧易于
分离和培养等优点
[4]
袁已成为矽肺治疗的研究热点遥
BMSC因无免疫原性和无伦理争议等袁是目前研究
最多的干细胞遥然而袁在临床中发现骨髓含量随着
衰老迅速减少遥但老年患者脂肪来源丰富袁可以从
皮下脂肪组织中大量获取遥流行病学研究发现矽肺
患者群体中袁以中老年患者居多袁因此对于大部分
矽肺患者而言袁ADSC较BMSC来源丰富遥最新文
献和前期研究同样发现袁而且老年患者来源ADSC
具有更显著的抗凋亡能力
[5,10]
遥
既往研究和前期结果发现袁ADSC和BMSC移
植可通过抗炎反应抑制矽肺的发生尧发展袁对矽肺
有着积极的治疗作用
[4,11]
袁而且ADSC较BMSC更显
构信息复合体袁含有各种与来源细胞相似蛋白尧
RNA尧micRNA及siRNA等生物活性物质
[15]
袁现广泛
用于科学研究
[16]
遥研究证实ADSC外泌体可抑制巨噬
细胞炎症反应
[17-18]
遥MT1属于金属硫蛋白亚型袁MT1
著的降低了炎症反应
[6-7,12-14]
遥外泌体是一种亚细胞结
西南国防医药2021年3月第31卷第3期
可通过抑制
NF
NF
-
资B信号激活
[19-20]
遥然而袁MT1抑制
要通过经典通路和非经典通路激活
-
资B信号的机制存在争议遥既往研究发现
NF
-
资B
[21]
本研究为进一步研究ADSC与BMSC外泌体中
遥
NIK主
MT1
过表达和
对染尘巨噬细胞的作用
MTI敲减的ADSC袁
袁前期成功构建了
通过Westernblot
MTI
证
渊
实转染影响了
图
ADSC外泌体中MTI蛋白表达水平
Western
1冤遥
提示ADSC
blot
将MT1
外泌体中的
结果显示
与磷酸化
MT1
NIK
MT1
与
可能通过
NIK
进行免疫共沉淀
存在相互作用
袁
NIK发挥抗
袁
炎作用
NF
渊图2冤遥为进一步明确MT1通过NIK激活
染尘巨噬细胞行
-
资B的具体机制
Western
袁将添加了
blot检测磷酸化
ADSC外泌体培养的
NF
-
资Bp50
和磷酸化NF
-
资Bp52蛋白水平袁结果显示ADSC外泌
体更显著抑制了
ADSC
NF
-
资Bp52蛋白磷酸化水平袁
抗炎作用
外泌体中MT1可能主要通过非经典通路发挥
提示
资B
非经典信号通路的共同上游激酶
inducing
遥研究证实
kinase,
袁NF
-
NIK)
资B
是
诱导激酶
NF
(nuclearfactor
--
资B
袁
经典信号通路和
对促进NF
-
资B的
激活至
kappa
p65)袁
B
关重要
也可以通过
kinase
袁
琢)/IKK茁
既可以
NIK/IKK琢/P100
经典通路激活
通过NIK/IKK琢
非经典通路激活
NF
(inhibitor
--
资B(p50/
NF
加了
-
资B2(p52/RelB)遥
ADSC外泌体
本研究通过
培养的染尘
Western
巨噬细
blot
胞磷
检测添
NIK尧磷酸化IKK琢和磷酸化NF
酸化
平袁结果显示MT1过表达显著抑制了非经典通路中
-
资Bp52炎症蛋白水
蛋白表达袁表明ADSC外泌体中MT1通过NF
-
资B经
非经典信号通路NIK/IKK琢/P100抑制染尘巨噬细
胞炎性进展
MT1
及TNF
蛋白表达越高
遥此外袁ELISA
-
琢越低袁提示
袁
ADSC
染尘巨噬细胞分泌
检测结果显示袁
外泌体中MT1
IL
外泌体中
抑制了染
-
1茁尧IL
-
6
尘巨噬细胞IL
-
1茁尧IL
-
6及TNF
-
琢分泌遥
综上所述袁本研究提出科学假设院老年供体来
源ADSC外泌体具有抑制矽肺炎症反应的作用袁可
能主要通过
NIK/IKK琢/P100
MT1
介导的
抑制染尘巨噬细胞中非经典通路
抗炎作用遥
NF
-
资B2(p52/RelB)激活发挥
[1]
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from
-29b
Toxicol
inducing
inhibits
(Camb),
extracellular
2017,
matrix
6(6):878
synthesis
-888.
inlungRes
[9]Gu
and
W,
adipose
metabolomics
NowakWN,
analyses
XieY,
reveal
etal.
the
Single
contribution
-CellRNA
of
-
perivascular
sequencing
Arteriosclerosis
tissuestemcellstovascularremodeling[J].
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Tong
cells
JB,
from
ativeanalysisofhuman
for
bone
celltherapy
marrowand
[J].Stem
adipose
Cell
tissue
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Ther,
under
2015,
xeno-
6:55.
freeconditionsRes
Chen
mesenchymal
S,CuiG,PengC,lantation
viaanti-inflammatory
stemcellsattenuatespulmonaryfibrosis
ofadipose
of
-
silicosis
derived
Cell
He
ResTher,2018,9(1):110.
andanti-apoptosiseffectsinrats[J].Stem
[12]
contributes
X,Zhang
stemcellsin
to
Y,
a
the
Zhu
murine
immunomodulatory
A,ssion
modelofsystemic
effects
lupus
of
of
erythematosus
adipose
interleukin
-derived
17
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S,
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K,unomodulatory
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ofCellular
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-conditioned
lic
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medium
profiles
233(11):8754
inchronic
ofadipose
-8766.
colitis
[14]-derived
heart
bone
disease
marrow
patients
-derivedstromalcellsfromelderlycoronary
quadrupoletime-of-flight
by
mass
capillary
spectrometry
liquid
[J].
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ofMolecular
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International
JE,
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etal.
41(1):184
Exosome
-194.
couples
RNAunshielding
signaling
stromal
incancer
activation
[J].Cell,2017,
topattern
170(2):352
recognition
-366.
receptor
窑228窑
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2+
-bindingprotein,parathymosin)interactswiththeglucocorticoid
receptorandenhancestranscriptioninvivo[J].TheJournalof
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polarizingM2macrophagesandbeiginginwhiteadiposetissue
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渊收稿日期院2020-12-23冤
本刊法定计量单位具体使用参照1991年中华医学会编辑出版部编辑的叶法定计量单位在医学上的应
用曳一书遥注意单位名称与单位符号不可混合使用袁如ng/渊kg窑天冤袁应改为ng/渊kg窑d冤曰组合单位符号中表示相
除的斜线不应多于1条袁如ng辕kg辕min应写为ng/渊kg窑min冤的形式曰组合单位中斜线和负数幂亦不可混用袁如
前例不宜采用ng辕kg窑min
-1
的形式遥在首次出现不常用的法定计量单位处用括号加注与旧制单位的换算系
用括号加注(1mmHg=0援133kPa)遥正文中时间的表达袁凡前面带有具体数据者应采用d尧h尧min尧s袁而不用天尧
小时尧分钟尧秒遥量的符号一律用斜体字母遥
数袁下文再出现时只列法定计量单位遥人体及动物体内的压力单位使用mmHg或cmH
2
O袁但文中首次出现时