玉米籽粒缺陷突变基因dek54的精细定位及候选基因分析-USB迷|专注于互联网分享

2024年4月14日发(作者：昝锐思)

作物学报

ACTA

AGRONOMICA

SINICA 2021, 47(10): 19031912 /

ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@

DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.03060

玉米籽粒缺陷突变基因dek54的精细定位及候选基因分析

周练刘朝显陈秋栏王文琴姚顺赵子

堃

朱思颖

洪祥德熊雨涵蔡一林

西南大学玉米研究所 / 农业科学研究院 / 南方山地作物逆境生物学国家级培育基地, 重庆400715

摘要: 玉米籽粒与产量和营养品质密切相关, 控制籽粒发育基因的功能研究对解析籽粒发育分子机制, 提高玉米

产量, 改善籽粒营养品质提供重要依据。利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)处理B73花粉, 筛选到一个

玉米籽粒缺陷突变体defective kernel 54 (dek54)。dek54表现出成熟籽粒变小、皱缩、颜色发白等特征; 遗传分析表

明dek54是一个单基因控制的隐性突变体。石蜡切片显示dek54淀粉胚乳细胞形状不规则且排列致密, 扫描电镜观察

成熟籽粒胚乳中心区域发现dek54淀粉粒周围蛋白体比野生型少且排列疏松。dek54成熟籽粒的总蛋白、醇溶蛋白、

各氨基酸组分和全氮含量相比野生型都显著降低。利用F

分离群体中的1566个dek54单株, 把dek54定位在7号染

色体标记SSR6和SSR7之间, 物理位置约为290 kb。该区间有3个基因, 基因测序发现Zm00001d019294基因第2

个外显子上第351个碱基由G突变为A, 从而导致蛋白翻译的提前终止。该基因在玉米籽粒中特异性表达, 且在12

DAP (days after pollination)籽粒中表达量最高。通过CRISPR/Cas9系统进行靶向突变确定候选基因Zm00001d019294

导致该突变表型。Dek54编码一个与ZmNRT1.5 (nitrate transporter)具有较高同源性的MFS (major facilitator super-

family)家族蛋白并定位在玉米原生质体的细胞质膜。该研究为揭示dek54在玉米籽粒发育的分子机制奠定了重要基础。

关键词: 玉米; defective kernel 54; 籽粒发育; 精细定位

Fine mapping and candidate gene analysis of maize defective kernel mutant dek54

ZHOU Lian, LIU Chao-Xian, CHEN Qiu-Lan, WANG Wen-Qin, YAO Shun, ZHAO Zi-Kun, ZHU Si-Ying,

HONG Xiang-De, XIONG Yu-Han, and CAI Yi-Lin

Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100087, China;

Beijing Engineering and Technique Research Center

for Hybrid Wheat, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Municipal Key Laboratory of the Molecular Genetics of Hybrid Wheat,

Beijing 100097, China

Abstract: Maize kernel is closely related to yield and nutritive quality. Study on the function of maize kernel development rela-

tive genes provides important basis for the molecular mechanism analysis, yield increasing and nutritive quality improving. B73

pollen was treated with ethyl methylmethanesulfonate (EMS) and a defective maize kernel defective kernel 54 (dek54) was

screened. dek54 had small mature kernel, wrinkled and whitened seed coat phenotype. Genetic analysis indicated that dek54 is a

recessive mutant controlled by a single gene. Paraffin sections showed starchy endosperm cells of dek54 had irregular shape and

dense arrangement at developmental stage. Scanning electron microscopy observation indicated that protein bodies around starch

granules in the central region of the dek54 mature kernel endosperm were fewer and arranged more loosely compare to wild type.

Total protein, zein, amino acids components contents and total nitrogen content of dek54 mature kernel were significantly lowered

compared with the wild type. dek54 was located on chromosome 7 within the interval of the physical distance of about 290 kb

between markers SSR6 and SSR7. Sequencing revealed that the 351th base G on the 2nd exon of Zm00001d019294 gene changed

into A, which led to the premature termination of the protein translation. Zm00001d019294 gene was specifically expressed in

immature maize kernel, and has the highest expression in 12 DAP (days after pollination) immature kernel. Targeted mutation was

performed using CRISPR/Cas9 system to identify that mutant phenotype was caused by candidate gene Zm00001d019294. Dek54

本研究由国家自然科学基金项目(31601312)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31601312).

通信作者(Corresponding author): 蔡一林, E-mail: caiyilin1789@

第一作者联系方式: E-mail: zhoulianjojo@

Received (收稿日期): 2020-10-15; Accepted (接受日期): 2021-01-13; Published online (网络出版日期): 2021-03-02.

URL: /kcms/detail/

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作物学报

第47卷

encoded an MFS (major facilitator superfamily) protein and had high homology with ZmNRT1.5 (nitrate transporter). Besides,

Dek54 protein was localized in the plasma membrane of maize protoplasts. The study of dek54 laid the foundation for the mo-

lecular mechanism analysis of maize kernel development.

Keywords: maize (Zea mays L.); defective kernel 54; kernel development; fine mapping

玉米(Zea mays L.)作为一年生禾本科植物, 是

我国重要的粮食作物。玉米生产对保障我国粮食安

全有着重要的战略意义。随着世界人口和经济水平

的不断增长, 对玉米产量和营养品质的要求日益增

长。玉米的胚和胚乳作为籽粒的主要组成部分, 来

自植物双受精作用, 与玉米产量和营养品质密切相

关。玉米籽粒主要是由淀粉、蛋白质和油脂组成。

其中淀粉和蛋白质主要储存在胚乳中, 油脂主要存

在胚中。玉米胚乳由4种不同类型的细胞组成, 包

括淀粉胚乳细胞、基部胚乳转移层细胞、糊粉层细

胞和胚包围层细胞

[1-2]

。8~14 DAP胚乳细胞具有很

强的有丝分裂活性, 到20~25 DAP时有丝分裂细胞

只在包含糊粉层和亚糊粉层的外周细胞层增殖。淀

粉胚乳细胞在胚乳的中央区域, 10 DAP淀粉胚乳细

胞从有丝分裂转变为核内复制

[1]

。淀粉胚乳细胞储

存籽粒中大部分的淀粉和蛋白质, 有效地决定籽粒

质地和营养品质。玉米籽粒胚乳的外侧是蛋白体含

量较多的透明区域, 而中心则是由较多淀粉粒和少

量蛋白体组成的不透明区域。淀粉粒和蛋白体之间

的比例决定着玉米籽粒的硬度, 也是玉米品质的重

要影响因素。玉米胚乳蛋白的质量也会影响玉米营

养品质和病虫害抗性。胚乳蛋白中醇溶蛋白(zein)的

含量占籽粒总蛋白量的70%左右, 但醇溶蛋白中人

体必需的赖氨酸含量低, 极大的降低了玉米的营养

价值。因此, 醇溶蛋白和非醇溶蛋白的比例也是决

定玉米籽粒品质的重要因素之一。

随着玉米全基因组测序的完成, 玉米籽粒发育

及产量相关的基因功能研究逐渐成为热点。玉米具

有大量的籽粒突变体, 这些突变体籽粒表型表现异

常。根据遗传学分析, 可以分为3种不同的类型, 包

括: (1) 单基因隐性突变体: defective kernel突变体

dek1

[3-6]

、dek2

[7]

、dek15

[8]

、dek36

[9]

、dek37

[10]

、dek39

[11]

和dek44

[12]

等, dek突变体影响籽粒胚和胚乳的发育,

使籽粒产生严重缺陷。例如dek44突变体产生小粒

的胚致死表型, Dek44基因编码一种线粒体核糖体蛋

白L9, 调节细胞生长和籽粒发育

[12]

。opaque突变体

[13]

、o2

[14-15]

、o5

[16]

、o7

[17]

、o9-11

[18]

和o13-17

[19]

等, opaque突变体籽粒粉质化, 通过改变醇溶蛋白

含量从而影响胚乳质地和蛋白品质。例如o7突变体

基因编码蛋白影响19-kD和22-kD α-zein以及16-kD

γ-zein的合成, 从而引起蛋白体数量减少和变小, 出

现粉质胚乳表型

[17]

。(2) 显性突变体Mucuronate

(Mc)

[20]

和Defective endosperm (De-B30)

[21]

, DeB30

突变体籽粒的非醇溶蛋白比正常籽粒增加了约

70%。(3) 半显性floury突变体f1

[22]

和f2

[23]

, floury

突变体也会引起胚乳粉质化。例如fl2由于单个氨基

酸的突变使得22 kD α-zein的信号肽不能正常剪切

从而导致蛋白体异常

[23]

。由于玉米基因组大, 且转

座子元件较多, 相比水稻等主要粮食作物, 仍有大

量籽粒突变基因的功能及分子机制仍然不清楚。

本研究利用EMS处理玉米自交系B73花粉得到

一个籽粒缺陷突变体dek54 (根据已发表的dek突变

体顺序命名)。本研究观察了dek54籽粒形态学和组

织学结构, 分析了dek54籽粒相关生化成分; 通过与

Mo17构建的F

分离群体对dek54进行了基因定位,

并通过CRISPR/Cas9系统靶向突变确定了候选基因

Dek54; 分析了Dek54基因在不同组织的时空表达

情况及其编码蛋白结构和同源性比对, 明确了

Dek54蛋白的细胞质膜定位结果。该研究解析Dek54

在玉米籽粒发育中的分子机制奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 dek54突变体获得和分离群体构建

2015年春, 于重庆北碚田间种植玉米自交系

B73和Mo17, 收集B73花粉进行EMS (终浓度0.67

mL L

–1

)诱变处理; 将诱变处理后的花粉与Mo17植

株进行杂交。同年下半年, 把获得的M

代籽粒种植

于云南元江, 自交后收获果穗, 观察表型, 筛选出

了籽粒皱缩突变体dek54。继续用dek54为母本与

Mo17杂交, 构建F

分离群体。提取1566个dek54

植株DNA, 鉴定其基因型, 筛选重组单株, 对dek54

进行精细定位。

1.2 石蜡切片和扫描电镜观察

分别取16 DAP果穗上的野生型和dek54未成熟

籽粒, 在福尔马林-乙酸-乙醇固定液(FAA, 50%乙醇,

0.9 mmol L

–1

冰醋酸, 3.7%甲醛)中4℃固定过夜。将

样品放置在一系列乙醇和二甲苯梯度溶液中脱水,

在石蜡中进行包埋。将石蜡样本切成10 μm的厚度,

第

期

周练等: 玉米籽粒缺陷突变基因dek54的精细定位及候选基因分析

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经烤片并脱水后, 用1%番红和固绿(Amresco)染色。

荧光显微镜下(Leica, D3000)进行观察。分别取F

果

穗上野生型和dek54的成熟籽粒, 经临界干燥、断面

喷金后, 在扫描电镜下(Hitachi, SU3500)观察dek54

与野生型的籽粒相同部位胚乳形态结构差异。

1.3 籽粒蛋白、淀粉、氨基酸和全氮含量测定

分别取F

群体中同一个果穗上野生型和dek54

的成熟籽粒, 用水浸泡5 min, 并去除种皮和胚。将

剩余胚乳部分在液氮中研磨成细粉。将真空抽干粉

末各称取50 mg两份, 加入1 mL石油醚, 置于37℃

摇床1 h; 去除石油醚, 加入硼酸钠蛋白提取液和巯

基乙醇, 37℃摇床过夜。分别提取每个样品的总蛋白、

醇溶蛋白和非醇溶蛋白, 并进行蛋白含量测定

[17]

。总淀

粉含量的测量按照总淀粉测定试剂盒(Megazyme,

K-TSTA-100A)使用说明进行。将样品进行蛋白质水

解, 去除脂质、色素等, 使用全自动氨基酸分析仪

(Hitachi, L-8900)测定氨基酸含量, 每个样品3次重

复。将样品用浓硫酸/双氧水进行消煮, 使用凯氏定

氮仪(Alva, KN580)测定全氮含量。

1.4 dek54连锁标记筛选及精细定位

在F

群体中分别选择10株野生型和10株突变

体, 提取基因组DNA, 并等量混合, 构建突变体

DNA池(mutant DNA pool, MP)和野生型DNA池

(wild-type DNA pool, WP)。利用实验室已有的覆盖

玉米全基因组, 在B73和Mo17之间有多态性的432

个SSR标记对这2个DNA进行扩增。筛选在2个

DNA池之间具有多态性的分子标记。通过Gramene

网站(/)下载玉米基因组DNA

序列, 并通过SSRHunter

[24]

开发SSR标记; 验证在B73

和Mo17之间具有多态性后用于dek54的精细定位。

1.5 qRT-PCR

取B73根、茎、叶、未成熟雌穗(1~2 cm)和雄穗

(1~2 cm)及12、14、16、18、20 DAP的未成熟籽粒和

成熟籽粒, 迅速冻于液氮。提取总RNA, 进行反转录生

成cDNA

[25]

。qRT-PCR (quantitative reverse transcription-

PCR)中利用玉米ZmACTIN1基因作为内参, 样品间

同一基因的相对表达量通过下例公式计算: 2

Ct

。

1.6 载体构建及玉米遗传转化

通过对候选基因Zm00001d019294 gDNA序列

进行分析, 选择第2个外显子的19 bp (5'-GCCGAG

CTACCTCTGCGAC-3')的靶向序列。合成包括靶向

序列和sgRNA在内的寡核苷酸引物, 采用单编辑策

略将该序列克隆到pCAMBIA3301-Cas9载体, 并将

构建好的载体转入农杆菌EHA105菌株。通过农杆

菌介导的玉米未成熟胚遗传转化, 获得玉米转基因

植株。通过测序来确定CRISPR/Cas9编辑玉米植株

目标位置附近的编辑位点, 获得5个独立的CRISPR/

Cas9基因敲除转基因株系, 选择2个转基因株系进

行后续实验。

1.7 基因注释及系统进化分析

通过NCBI (/)和

MaizeGDB (/)等数据库网站, 搜

索下载相关基因的基因组、cDNA和蛋白序列。通过

BLAST CD-Search (basic local alignment search

toolconserved domain search, .

/Structure/cdd/)比对分析目标蛋白

的保守序列。将所有进行比对的氨基酸序列转换成

FASTA格式合并导出, 通过CLUSTALW进行多序列

比分析, 在使用MEGA6进行N-J (neighbor-joining)

进化树构建。

1.8 亚细胞定位

以玉米B73的12 DAP未成熟籽粒cDNA为模

板, 通过PCR扩增Dek54的全长CDS序列(除去终

止密码子)连接到pAN580载体, 构建Dek54-GFP融

合表达载体。将含有正确插入片段的载体和质膜定

位标记载体PM107 (AtPIP1; 2-mCherry)分别通过

PEG介导共转化玉米原生质体。在激光共聚焦显微

镜(LSM800, Carl Zeiss)下观察荧光。

2 结果与分析

2.1 dek54表型鉴定与遗传分析

利用EMS化学诱变技术获得了玉米籽粒缺陷

突变体dek54。该突变体与Mo17杂交, F

群体表型

表现正常, 自交后F

果穗上产生分离(图1-A)。统计

5个F

果穗, 野生型(+/+和dek54/+)与突变型(dek54/

dek54)籽粒分别有1549粒和499粒, 适合度测验结

果显示, 野生型和突变体籽粒的分离比接近3∶1

(χ

= 0.16 < χ

0.05

= 3.84), 说明dek54是一个单基因

控制的隐性突变体。

dek54与野生型相比表现为, 成熟籽粒变小, 皱

缩干瘪, 且颜色发白(图1-A, B)。对野生型和dek54

成熟籽粒进行徒手切片并在体式显微镜下观察籽粒

胚和胚乳的形态。籽粒纵切面显示, 突变体胚的形

状正常, 但显著小于野生型(图1-C), 突变体籽粒较

野生型萌发延迟但后续生长正常(附图1)。籽粒横切

面显示, 突变体籽粒胚乳中间不透明的淀粉胚乳面

积缩小, 分布在粉质胚乳周围的透明玻璃质胚乳面

积显著增大(图1-D)。野生型和dek54的百粒重分别

1906 作物学报

第47卷

为31.2 g和10.0 g, dek54仅为野生型的32.0%; dek54

十粒长和十粒宽分别为野生型的79.0%和66.7%, 均

显著低于野生型(图1-E)。由此可见, dek54突变显著

影响了籽粒胚和胚乳的发育。

2.2 dek54籽粒组织学观察

取16 DAP的野生型和突变体籽粒进行石蜡切

片观察。结果显示, dek54的种皮与胚乳脱离, 胚乳

细胞相比野生型发生了明显变化, 表现在糊粉层细

胞相比野生型层数增加, 并且淀粉胚乳细胞组织形

态不规则并且相比野生型排列较密且较小(图2-A)。

图1 dek54突变体表型鉴定

Fig. 1 Phenotypic characterization of dek54 mutant

A: 成熟果穗F

分离群体; B: 籽粒表型; C: 籽粒纵切; D: 籽粒

横切; E: F

分离群体上野生型和dek54突变体籽粒的百粒重、十

粒长和十粒宽。标尺为0.5 cm。Em: 胚; En: 胚乳; SE: 粉质胚

乳; VE: 玻璃质胚乳。

A: F

segregating population of mature ear; B: phenotypes of ker-

nels; C: cross section of kernels; D: longitudinally section of ker-

nels; E: 100-kernel weight, ten-kernel length, and ten-kernel width

of WT and dek54 mutant kernels from F

segregating population.

Bar: 0.5 cm. Em: embryo; En: endosperm; SE: starchy endosperm;

VE: vitreous endosperm.

说明dek54突变显著地影响胚乳细胞的发育。推测

由于胚乳细胞发育的不完全使得dek54突变体籽粒

表现出皱缩的表型。对成熟籽粒横截面的扫描电镜

观察显示, 相同位置的野生型胚乳中淀粉粒周围有

密集的蛋白体包围, 而dek54突变体的淀粉周围蛋

白体数量较少, 且排列较疏松(图2-B)。

图2 dek54突变体的组织学观察

Fig. 2 Histological observatin of dek54 mutant

A: 16 DAP野生型和dek54突变体籽粒的石蜡切片纵切观察。标

尺为100 µm。AL: 糊粉层; SE: 淀粉胚乳。B: 野生型和dek54

突变体成熟籽粒胚乳中心区域扫描电镜观察。标尺为50 µm。SG:

淀粉粒; PB: 蛋白体。

A: longitudinal paraffin sections observation of developing WT and

dek54 mutant kernels at 16 DAP. Bar: 100 µm. AL: aleurone layer;

SG: starch endosperm. B: scanning electron microscopy observa-

tion of the central regions of WT and dek54 mutant mature kernel

endosperm. Bar: 50 µm. SG: starch granule; PB: protein body.

2.3 dek54相关生化成分检测

分别提取野生型和dek54成熟籽粒胚乳中的总

蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白。结果显示, 突变体

的总蛋白和醇溶蛋白含量相比野生型分别降低了

29.2%和27.6%, 而非醇溶蛋白没有显著差异(图

3-A)。成熟籽粒胚乳中的淀粉含量测定发现, 突变体

的胚乳淀粉含量与野生型没有显著差异(图3-B)。总

氨基酸含量测定显示, 突变体籽粒胚乳中各类氨基

酸含量相比野生型均显著降低, 其中赖氨酸含量仅

为野生型的63.0% (图3-C)。进一步全氮含量测定结

果表明, dek54突变体的成熟籽粒中全氮含量显著低

于野生型, 降低了16.5% (图3-D)。

2.4 dek54突变体的精细定位

利用432个在B73和Mo17基因组间有多态性

的SSR标记对突变体DNA池和野生型DNA池进行

筛选。发现SSR标记umc2160在2个DNA池中检

第

期

周练等: 玉米籽粒缺陷突变基因dek54的精细定位及候选基因分析

1907

图3 dek54突变体的生化成分分析

Fig. 3 Biochemical component analysis of dek54 mutant

野生型和dek54突变体成熟籽粒的蛋白(A)、淀粉(B)、各氨基酸组分(C)和全氮含量(D)。

Protein (A), starch (B), amino acid components (C), and total nitrogen contents (D) of WT and dek54 mutant kernels.

图4 dek54的连锁SSR标记筛选和精细定位

Fig. 4 Linkage SSR marker screening and fine mapping of dek54

A: umc2160的PCR扩增产物在WP和MP之间具有多态性; B: 通过33个dek54单株的基因分型确定SSR连锁标记umc2160; C: 通

过F

群体1566个单株对dek54进行精细定位。dek54定位标记SSR6和SSR7之间物理距离约为290 kb的区间内。黑色垂直实线上方为

分子标记名称, 下方数字为该标记鉴定的交换单株数量。

A: the polymorphic PCR products amplified by umc2160 between WP and MP; B: confirmation of linkage SSR marker umc2160 by geno-

typing 33 dek54 mutant plants; C: fine mapping of dek54 using F

population including 1566 individuals. dek54 was mapped to an interval

about 290 kb flanked by SSR6 and SSR7. The symbols above and below the black vertical solid lines represent the molecular marker and the

number of recombinants, respectively.

1908

作物学报

第47卷

表1 dek54定位SSR标记引物序列

Table 1 Sequences of SSR markers for dek54 mapping

标记类型

Type

标记名称

Name

正向引物序列

Forward sequence (5′–3′)

CCCTGACGAAAGCATGAATGAG

TGCCCATAAGAGCTTCGAGGATA

CCATCTGTACTAATGGCACCTGA

GGCTACATAAGATGCAAAGCGG

GGTGCCAAAAACATCTCCCAAC

CATGGCCAAAATATCGCACGAG

GCTAGGTGCAGTGTCTCTGCTT

反向引物序列

Reverse sequence (5′–3′)

ACAGATGACTCTGCACCTCAAG

AGCCTTAGTTGTCAGTCCATCG

GCCAGCAAAGCTTTTCAAGAGT

TACCCTTTGACAGAGCCTACCT

TAGCGTGGGGTCATAGCAACA

TGACGTACATGAACACCTCGG

CCTTGAACGTGGGGTAGGCT

GCCCCACAAGAACTCCATCTAT

SSR SSR23403 ACTAGTATGTGGATTGCTCGTCG GCTGCTGAGCTGTATGTACCA

SSR SSR1

SSR SSR2

SSR SSR3

SSR SSR4

SSR SSR5

SSR SSR6

SSR SSR7

SSR SSR8

SSR SSR10308 GCAAATGTTCTGTGCAAGGCTA

表2 dek54定位区间基因注释

Table 2 Gene annotation in the mapping region of dek54

编号

No.

基因ID

Gene ID

Zm00001d019292

Zm00001d019293

Zm00001d019294

无注释 No annotation

功能注释

Function annotation

异柠檬酸/异丙基苹果酸脱氢酶 Isocitric acid/isopropyl malate dehydrogenase

MFS家族 Major facilitator superfamily

测出多态性(图4-A), 该标记位于第7号染色体的

7.01 bin。使用umc2160检测33株dek54的基因型,

结果显示30株dek54的基因型与表型相一致, 3株

(17、25和27) dek54因为染色体重组表现为杂合基

因型(图4-B), 由此证实了该标记与dek54基因连

锁。在umc2160标记邻近的区间开发新的SSR标记

(表1)用于dek54定位。利用F

群体中1566个单株

将dek54初步定位在与SSR标记SSR23403和

SSR0308相邻的8.52 Mb的物理区间内(图4-C)。进

一步通过重组植株的筛选, 开发并筛选到8个具有

多态性的SSR标记。在SSR1~8标记位置各筛选到

交换单株20、11、11、3、2、2、2和11株。最终, dek54

定位在玉米7号染色体标记SSR6和SSR7之间物理

距离约为290 kb的区间内(图4-C)。

导致dek54表型产生的原因。

通过qRT-PCR的方法, 检测Zm00001d019294

基因在玉米自交系B73的不同组织的表达情况, 包

括根、茎、叶、雄穗、花丝、12、14、16、18、20 DAP

的未成熟籽粒和成熟籽粒。检测表明,

Zm00001d019294基因在未成熟籽粒(12~20 DAP)中

特异性表达; 且在12 DAP未成熟籽粒中表达量最

高, 并随着籽粒发育表达量逐渐下降, 在其他组织

和成熟籽粒中均不能检测到其表达(图5-B)。

Zm00001d019294

基因在未成熟籽粒中的特异性表

达说明其在籽粒发育过程中发挥作用。

2.5 候选基因序列及表达分析

Gramene玉米数据库显示SSR6和SSR7之间物

理距离约为290 kb, 定位区间内仅包括3个基因(表

2), 通过扩增并测序, 比较这3个基因在dek54与对

照B73的DNA序列, 发现Zm00001d019294基因第

2个外显子上第351个碱基位点由G突变转换为A,

导致密码子由TGG变为TAG, 从而造成蛋白翻译的

提前终止(图5-A); 而其他2个基因的DNA序列没

有差异。因此推测Zm00001d019294基因的突变是

2.6 CRISPR/Cas9靶向突变Zm00001d019294基

因表型鉴定

利用CRISPR/Cas9系统对Zm00001d019294

基因进行靶向突变。以Zm00001d019294的第2

个外显子为靶标设计sgRNA间隔序列。获得了5

个独立的CRISPR/Cas9转基因株系, 通过测序确

定其中2个(dek-cas9-1和dek-cas9-2)含有由目标

序列插入或缺失引起的密码子移位突变(图6-A)。

CRISPR/Cas9转基因株系的成熟籽粒与dek54表

现出相似的缺陷表型(图6-B~D)。该结果表明

Zm00001d019294基因是引起该籽粒突变表型的

目标基因。

第

期

周练等: 玉米籽粒缺陷突变基因dek54的精细定位及候选基因分析

1909

图5 Zm00001d019294基因突变位点及时空表达分析

Fig. 5 Mutation site and spatio-temporal expression analysis

of Zm00001d019294

A: Zm00001d019294基因结构图, 红色箭头所示为突变位点; B:

Zm00001d019294基因在不同组织及发育中的未成熟籽粒中的表

达分析。

A: gene structure diagram of Zm00001d019294. The red arrow indicates

mutation sites. B: the relative expression level of Zm00001d019294 in

different tissues and developing immature kernel.

图6 Zm00001d019294 CRISPR/Cas9靶向突变表型鉴定

Fig. 6 Phenotypic characterization of CRISPR/Cas9 targeted

mutation of Zm00001d019294

A: Zm00001d019294的CRISPR/Cas9靶位点序列。sgRNA靶序

列为绿色, PAM (protospacer-adjacent motif)序列为橙色, 红色字

母和短线分别代表插入和缺失; B: dek54-cas9-1xMo17的F

成熟

果穗; C: 成熟的WT和dek54-cas9-1籽粒; D: 成熟的WT和

dek54-cas9-1籽粒的纵切。Em: 胚; En: 胚乳。标尺为0.5 cm。

A: the sequence in the Zm00001d019294 locus targeted using

CRISPR/Cas9. The sgRNA target sequence is green. Proto-

spacer-adjacent motif (PAM) is blue. Red letters and dashes repre-

sent insertions and deletions, respectively. B: mature F

ear of

dek54-cas9-1xMo17. C: mature WT and dek54-cas9-1 kernels. D:

longitudinal paraffin sections of mature WT and dek54-cas9-1

kernels. Em: embryo; En: endosperm. Bars: 0.5 cm.

2.7 Dek54蛋白预测及亚细胞定位

Dek54 (Zm00001d019294)由5个外显子和4个内

含子组成。Dek54的成熟转录本编码序列长1923 bp,

编码一个由640个氨基酸组成的蛋白。通过BLAST

CD-Search比对分析该蛋白的保守序列, 结果表明,

Dek54蛋白序列中包含MFS保守结构域(图7-A)。蛋

白序列比对及系统进化分析发现, Dek54蛋白与玉米

和拟南芥硝酸盐转运体NRT1类蛋白具有较高的同

源性, 且与ZmNRT1.5B和ZmNRT1.5A蛋白序列同

源性最高(图7-B)。通过PEG介导的玉米原生质体共

转化及荧光显微镜观察显示, Dek54蛋白的绿色荧光

与质膜标记蛋白红色荧光完全重合(图8), 表明

Dek54定位在细胞质膜上。推测Dek54可能是一个位

于细胞质膜的硝酸盐转运体。

图7 Dek54蛋白保守结构域(A)及进化(B)分析

Fig. 7 Conserved domain (A) and phylogenetic (B) analysis of

Dek54 protein

图8 玉米原生质体中Dek54的亚细胞定位观察

Fig. 8 Observation of subcellular localization of Dek54 in

maize protoplasts

Dek54-GFP载体与mCherry标记的质膜标记(mCherry-PM;

CD3-1007)共定位。标尺为20 μm。

Dek54-GFP was co-localized with a mCherry-labeled plasma

membrane marker (mCherry-PM; CD3-1007). Bar: 20 μm.

1910 作物学报

第47卷

3 讨论

籽粒缺陷(defective kernel, dek)突变体是一类主

要的玉米籽粒突变体。dek突变体表型变化极为显著,

主要表现为, 胚乳发育缺陷、籽粒较小、种皮与胚

乳分离、种皮颜色较浅, 且表面皱缩等特征

[26]

。本

研究中, dek54突变体具有dek突变体的典型表型特

征, 其胚发育延迟, 胚乳发育不良; 相比野生型,

dek54籽粒的长、宽和粒重都显著降低。dek54是一

个单基因控制的隐性突变体, 显示为功能缺失突

变。对玉米籽粒缺陷突变体dek54进行精细定位, 并

通过CRISPR/Cas9系统靶向突变实验确定导致突变

表型的基因Zm00001d019294。测序结果显示, dek54

突变体在Zm00001d019294基因的第2个外显子上有

一个碱基突变导致该密码子突变为终止子, 提前终

止了蛋白序列。qRT-PCR结果表明, Zm00001d019294

基因在未成熟籽粒中特异性表达, 并随着籽粒的发

育表达降低, 且在成熟籽粒中不表达。说明Dek54基

因在玉米籽粒发育过程中起着重要作用。

玉米中dek突变体种类多, 涉及的机制非常复

杂。至今, 超过20个dek突变体已被鉴定。大部分dek

突变体都是由PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白突

变所引起

[7,9-11,27-29]

。PPR蛋白在线粒体和质体中特异

性作用于RNA编辑、剪辑、稳定性和转录后调控等

重要进程

[30]

, 但也有部分dek突变体不是PPR蛋白突

变引起。例如Dek1编码一个钙蛋白酶家族蛋白, 影

响籽粒胚和胚乳的糊粉层发育

[3]

, 可能在陆地植物表

面细胞位置传感和信号传递过程中发挥重要作用

[31]

;

Dek15编码一个黏连蛋白装载复合体亚基, 决定染

色体分离和籽粒发育

[8]

。本研究中, Dek54基因编码

一个含有MFS保守结构域的蛋白。MFS是一类广泛

存在细胞膜上的转运蛋白家族, 由协同转运体、共

转运体和反向转运体共同组成, 能够转运多种底物

包括无机和有机离子、核酸、氨基酸、短肽和脂类

物质

[32]

, 在多种生理生化途径中起着重要作用。所

有的MFS转运体都具有一个典型的MFS折叠。这个

折叠包含了2个结构域, 每个结构域都由6个连续的

跨膜基序组成, 分别称为N端和C端结构域

[33]

。Dek1

蛋白由一个多跨膜结构域(mutispanning tranmem-

brane domain, MEM)组成

[3]

。序列分析发现, MFS和

DEK1-MEM的第16到22个跨膜基序具有相似性, 推

测MFS蛋白在响应化学渗透梯度促进各种溶质跨膜

运输的功能, 与MEM感知相邻细胞表面膜和外部环

境差异方面功能的作用是相容的

[4]

。硝酸盐转运体

NRT1是在高等植物中唯一具有典型的MFS结构的

蛋白

[34]

。由于对氨基酸残基T101的磷酸化

[35]

, 使得

NRT1蛋白对硝酸根离子NO

3

具有双亲和力, 即高

亲和力和低亲和力

[36]

。其中, AtNRT1.5介导NO

3

的

外排, 并在将NO

装载进入木质部, 并转运到地上

部分起着重要作用

[37]

。AtNRT1.8负责从根和木质部

中提取NO

3

, 并与AtNRT1.5协同调控NO

3

的远距离

运输

[38]

。将拟南芥和玉米的NRT1家族的蛋白以及

Dek54蛋白进行比对及系统分析, Dek54与

ZmNRT1.5B、ZmNRT1.5A、AtNRT1.5和AtNRT1.8

分在一个组, 且具有最大的序列相似性。进一步研

究表明, Dek54蛋白定位在玉米原生质体的细胞质膜

上。组织学观察显示, dek54突变体籽粒淀粉胚乳细

胞组织形态不规则, 并且相比野生型排列较密且较

小, 胚乳中心区域的淀粉粒周围的蛋白体相比野生

型较小, 且数量较少。dek54突变成熟体籽粒的总蛋

白、醇溶蛋白、各类氨基酸及全氮含量均显著低于

野生型。推测dek54突变体可能由于硝酸盐转运体的

缺失, 导致在玉米籽粒发育过程中不能有效的转运

氮, 从而造成胚乳和胚的发育缺陷。但Dek54如何在

玉米籽粒发育中发挥功能的具体作用机制仍然不明

确。我们发现新的籽粒突变体丰富了玉米籽粒发育

的研究材料, 为进一步解析该基因在玉米籽粒发育

过程的分子机制奠定了基础。

4 结论

通过EMS化学诱变, 鉴定了一个新的玉米籽粒

缺陷突变体dek54。dek54被定位在玉米7号染色体

标记SSR6和SSR7之间物理距离约为290 kb的区

间内。测序发现Dek54基因的第2个外显子上第351

个碱基由G突变转换为A, 从而引起蛋白翻译的提

前终止, 并在玉米未成熟籽粒中特异性表达。

CRISPR/Cas9系统靶向突变实验确定与突变表型相

关的候选基因Dek54, 该基因编码一个MFS家族蛋

白并与ZmNRT1.5具有较高的同源性。此外, Dek54

蛋白定位在玉米原生质体的细胞质膜上。dek54突变

体为解析玉米籽粒发育的分子机制提供了新的研究

材料和理论依据。

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附图1 野生型和dek54 成熟籽粒的发芽测试(发芽后5 d)

Fig. S1 Germination test of wildtype and dek54 mature kernels (5 days after germination)

标尺为1 cm。Bar: 1 cm.