2024年5月16日发(作者：安全)
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选择性去除表达Ｃ Ｄ ２ ５＋、Ｃ Ｄ ６ ９＋的同种异体反应Ｔ细胞
的实验研究
柴忆欢邱慧英徐杰
苏州２１ ５００３） （苏州大学附属儿童医院血液病科
【摘要】目的 探讨体外选择性去除表达ＣＤ２５ ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞协调移植物抗宿主病和移植物抗肿瘤的可能性。方
法流式细胞仪检测初次单向混合淋巴细胞反应ＣＤ２５ ，ＣＤ６９ 表述情况，磁性细胞分离系统在细胞表达高峰去除ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋同
种异体反应Ｔ细胞。Ｍ１Ｔ法在各时同点检测不同抗原组再次混合淋巴细胞反应的细胞增殖情况。结果再次单向混合淋巴细胞反应显
示明显降低了对橱同刺激原的反应性（４８．８２±１３．７Ｄ％，保留大部分对无关刺激原的反应性（６５．４７±９．８４ 和肿瘤刺激原的反应性（６４．
８３±３．６５）％。结论体外选择性去除表达ＣＤ２５ ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞可以协调移植物抗宿主病和移植物抗肿瘤。
【关键词ｌ移植物抗宿主病 ＣＤ２５ ＣＤ６９ Ｔ细胞去除
【中图分类号】Ｒ ３ ９ ２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７４－０７４２（２００８）０Ｉ（ｃ）－００６７－０２
Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｉｌｓ ｂａｓｅｄ ０ｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ＣＤ２５＋ａｎｄ ＣＤ６９＋
ＣＨＡＩ Ｙｉｈｕｍ ＱＩＵ Ｈｕｉｙｉｎｇ ＸＵ Ｊｉｅ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨｅｍａｔｏｌｏｇｙＡｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
Ｓｏｏｃｈｏｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｓｕｚｈｏｕ２１５００３．ＣＨＩＮＡ
．
。
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｈｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２５＋ａｎｄ
ＣＤ６９＋ｔｏ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｇｒａｆｔ—ｖｅｒｓｕｓ—ｈ０ｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ（ＧＶＨＤ）ａｎｄ ｇｒａｆｔ—ｖｅｒｓｕｓ—ｔｕｍ０ｒ（ＧＶＴ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ＣＤ２５＋ａｎｄ
ＣＤ６９＋ｉｎ ｆｉｒｓｔ ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ（ＭＬＣ）ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＡＩＩｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｙｍｐｈｅｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｄ ｂｙ ｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ＣＤ２５＋ａｎｄ ＣＤ６９＋，ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｍｏｖｅｄ ｂｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）．Ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＭＬＣ
Ｓａｍｐｌｅｓ ｗａ￥ａｓｓａｙｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ｂｙ Ｍ１Ｔ．Ｒｅｓｕｌｓ Ｍｉｘｅｄ ｌｔｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｓｓａｙｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｌｅｄ ｔｏ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｌｌｏ－－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌｓ ４８‘８２±ｌ３・７１％．ｗｈｉｃｈ ａｔ ｔｈｅ Ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ
ｔｈｉｒｄｐａｒｔｙ ｃｅｌｌｓ ６５．４７±９．８４％ａｎｄ ａｎｔｉ－－ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ６４．８３±３．６５％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｓｏｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｌＩｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ＣＤ２５＋ａｎｄ ＣＤ６９＋ｃａｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ＧＶＨＤ ａｎｄ ＧＶＴ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｇｒａｆｔ－－ｖｅｒｓｕｓ－－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ＣＤ２５ ＣＤ６９ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ
同种异体造血千细胞移植（ 山０侧后受者体内可发生一系列免
（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）、流式细胞仪（ＦＡＣＳＣａｎ）。
疫反应，移植排斥、移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）和移植物抗白血病
（ＧＶＬ）。ＧＶＨＤ是主要并发症，而ＧＶＬ却是需要的。目前人们已经意
２实验方法
２．１初次单向混合淋巴细胞反应
识到某些Ｔ细胞亚群可以识别白血病细胞和正常细胞，在同种异体造
血干细胞移植和供者淋巴细胞输注后可以不发生ＧＶＨＤ而保留ＧＶＬ
的作用。我们以表达ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞为靶细
胞，探讨体外选择性去除同种异体反应Ｔ细胞协调移植物抗宿主病和
移植物抗肿瘤的可能性。
１材料与方法
１．２实验材料
取Ｃ５７ＢＬ／６Ｈ＋２ｂ小鼠脾脏，无菌制备脾细胞悬液。常规分离单
个核淋巴细胞，调整细胞数为５．０×１０６个／ｍｌ，台盼蓝染色计算细胞
活性＞９５％，作为反应细胞备用。同样方法收集ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾单个
核淋巴细胞，按终浓度２５ ｕ ｇ／ｔａｌＯｎ入丝裂霉素Ｃ，３７＂Ｃ、５％Ｃ０，，培
养４５ｒａｉｎ，作为刺激细胞。实验分组：（１）反应细胞组ｌ（２）刺激细胞组；
（３）反应细胞＋刺激细胞组。３７＂Ｃ、５％ＣＯ，，２４孔板ＲＰＭＬ一１６４０完
全培养液培养５ｄ。每孔加入刺激细胞和／或反应细胞各２．０×１０５个，
培养终体积为１０００ ｕ Ｉｏ不同时间点取培养细胞，采用直接免疫荧光标
清洁级Ｃ５７ＢＬ／６Ｈ－２ｂ（６～ｌ０周，雄性）小鼠、
记法，通过流式细胞仪检测样本中ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 阳性的表达率。
以０ｈＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的表达为正常值。
２．２再次单向混合淋巴细胞反应
１．１．１实验动物
ＢＡＬＢ／ｃＨ一２ｄ（６－１０周，雌性）小鼠、ＤＢＡＨ一２ｋ（６－１０周，雌性）小鼠
（由上海实验动物中心提供）。
１．１．２ ＳＰ２／Ｏ细胞株ＢＡＬＢ／ｃＨ一２ｄ来源骨髓瘤细胞，购于美国
应用抗ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 单克隆抗体联合免疫磁珠在磁场细胞分
离系统选择性去除表达ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞获得
阴性表达细胞作为反应细胞。细胞收集时间根据ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 表
ＡＴＣＣ公司，由苏州大学免疫实验室常规传代培养。
１．１．３主要试剂及仪器Ｍ ｒ（ＳＩＧＭＡ公司）ｌ抗ＦＩＴＣ磁珠、ＦＩＴＣ—
达率情况决定。分离步骤参照说明书进行。刺激细胞包括相同抗原、无
关抗原、肿瘤抗原刺激组刺激细胞。采用丝裂霉素Ｃ制备刺激细胞的
方法同上。实验分组：（１）阴性细胞＋相同抗原刺激组；（２）阴性细胞＋
ａｎｔｉ～ＣＤ６９、ＦＩＴＣ—ａｎｔｉ—ＣＤ２５及相应同型免疫球蛋白阴性对照单克
隆抗体（美国ｅＢｉｏ—ｓｃｉ ｅｎｃｅ公司产品）ｌ磁场细胞分离系统
ＣＨＩＮＡ ＦＯＲＥＩＧＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ中外医疗 ６７
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无关抗原刺激组；（３）阴性细胞＋肿瘤抗原刺激组；（４）混合淋巴细胞＋
效应Ｉ Ｉ。这些实验结果提示根据活化细胞特异性抗原去除活化Ｔ细胞
相同抗原刺激组；（５）混合淋巴细胞＋无关抗原刺激组；（６）混合淋巴细 是目前较为成功的减轻ＧＶＨＤ保留ＧＶＬ途径。
胞＋肿瘤抗原刺激组。（１）～（３）组为处理组，阴性细胞为反应细胞；（４）～
（６）组为对照组，相同条件下初次单向混合淋巴细胞反应的细胞为反应
面活化抗原ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋的表达情况，以了解Ｔ细胞识同种异基因
细胞。３７℃、５％ＣＯ２条件，９６孔板ＲＰＭＬ—ｌ６４０完全培养液培养
抗原的一般活化规律；通过磁场细胞分离系统去除表达ＣＤ２５ 、ＣＤ６９
５ｄ。每孔中刺激细胞和反应细胞各２．０×１０４个，培养终体积为１５０
的同种异体反应Ｔ细胞以获得阴性细胞；通过ＭＴＴ法在不同时间点检测
ｌ，均设三个平行孔。 再次单向混合淋巴细胞反应的细胞增殖情况以了解阴性细胞对相同抗原
２．３ ＭＴＴ法检测
刺激组，无关抗原刺激组，肿瘤抗原刺激组的反应性。Ｍｎ检测值显示，
在培养的第ｌ、２、３、４、５天收获细胞行ＭＴＴ法检测。每 阴性细胞在再次单向混合淋巴细胞反应体系里明显降低了对相同抗原刺
孔加入ＭＴＴ ｌ０ ｌ，在３７℃，５％ＣＯ２培养箱培养４～６ ｈ；每孔加入 激组反应性（４８．８２±１３．７１ ，保留了大部分对无关抗原刺激组反应性
１５０ ｌ的ＤＭＳＯ，酶联免疫检测仪波长５７０ ＤｉＴＩ上检测ＯＤ值。 （６５．４７±９．８４）％和肿瘤刺激原的反应性（６４．８３±３．６５）％。实验结果
３统计学处理
与相关文献报道结果相似１４ｌ。考虑到某一特定的活化抗原并非表达于
计量数据以均数±标准差（又±ｓ）表示，ＣＳ２０００软件统计包处理，
所有的同种异体反应Ｔ细胞，而且不同的活化抗原并非同时表达于所
Ｐ＜０．０５为差异有显著意义。
有的同种异体反应Ｔ细胞［４１，本实验以二种活化抗原ＣＤ２５ 、ＣＤ６９
４结果
为靶抗原，提高细胞的清除率。ＣＤ２５ 是ＩＬ一２受体的ａ链，在活化Ｔ
４．１ 初次单向混合淋巴细胞反应ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 表达正常情况下也 细胞上表达上调，是活化Ｔ淋巴细胞的标志。ＣＤ６９ 是Ｔ淋巴细胞激
存在ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的表达，分别为（５．９±２．１）％，（２．４±０．２ ；
活后最早表达的表面抗原，当其表达后，可作为共刺激信号促进Ｔ细胞
ＣＤ６９ 在第４８小时达到峰值（２１．５±１．１ ，第７２小时下降至（１１．９±
进一步活化和增殖。同时考虑到某些同种异体反应Ｔ细胞在刺激抗原
０ ９）％；ＣＤ２５ 在第７２小时达到峰值（５６．４±３．４）％；在第１２０小时，
持续存在的情况下可以 对抗原刺激组的无反应转变为有反应 ，故本
ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的表达率分别下降为（４４．４±５．４）％、（６．６±１．２）％。 实验采用在不同时间点检测各反应组的Ｍ１ｖｒ值，更全面更完整地评估
４．２再次单向混合淋巴细胞反应的细胞增殖见表ｌ 细胞间的相互反应情况，这是与以往实验的不同之处。结果提示，体外
ＭＴＴ法检测相同抗原刺激的反应性为（４８．８２±１３．７１）％，按时 选择性去除表达ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞可以减少对
间顺序分别为２９．０２％、６４．１７％、５８．３４％、４９．４６％、４３．１１％ｌ无关
相同抗原刺激组的反应性，保留大部分对无关抗原刺激组和特异肿瘤
抗原刺激组的反应性为（６５．４７±９．８４）０／ｏ，按时间顺序分别为６６．５６％、 抗原刺激组的反应性，这一方法为临床上协调ＧＶＨＤ和ＧＶＬ提供了
７５．６９％、４９．６１％、７０．９２％、６４．５９％ｌ肿瘤抗原刺激组反应性为（６４．
一
定的实验基础。
８３±３．６５）％，按时间顺序分别为６１．５０％、６１．１４％、６４．３３％、６８． 参考文献
６２％、６８．５５％。（Ｄｌ～Ｄ５为反应第ｌ～５天）。
【ｌ１ Ｋｏｈ ＭＢ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ ＨＧ，Ｃｏｒｂｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ
５讨论
Ｔ－ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｕｌｌｙ
采用全Ｔ细胞去除基本能阻止ＧＶＨＤ发生；但为了保留ＧＶＬ与抗
ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｇｒａｆｔ—ｖｅｒｓｕｓ～
病毒效应，学者们选择性去除同种异体反应Ｔ细胞、诱导同种异体反
ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｐｈｙ——ｌａｘｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐ［ｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ
应Ｔ细胞无能等方法１ Ｉ。活化Ｔ细胞可表达特异性抗原，抗原的表
ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｂｒ Ｊ＝Ｈａｅｍａｔｏｌ，２００２，ｌ１８：１０８～ｌｌ６．
达上调引发Ｔ细胞增殖，并导致ＩＬ一２、ＩＦＮ—ｖ等细胞因子分泌增
【２】Ｈａｒｔｗｉｇ Ｕ，Ｒｏｂｂｅｒｓ Ｍ，Ｗｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ，Ｍｕｒｉｎｅ
多，与ＧＶＨＤ病理生理密切相关。通过在体外将患者细胞和供者细胞
ａｃｕｔｅ ｇｒａＲ－ｖｅｒｓｕｓ—ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｎ ｂｅ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｄｅｐｌｅ—
混合培养，以激活供者同种反应细胞，根据活化Ｔ细胞表达的特异性标
ｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌＯ—ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎ－
志分子，用这些分子的特异性抗体来选择性去除同种反应细胞，这种方
ｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ［Ｊ】．Ｂｌｏｏｄ，２００２，１００：３７５～３８２．
法似乎可以选择性地去除同种反应Ｔ细胞，而不影响ＧＶＬ和抗病毒的
【３】Ｋｏｈ ＭＢ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ ＨＧ，Ｌｏｗｄｅｌｌ ＭＷ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ
表１ 再次单向混合淋巴细胞反应的细胞增殖（又±ｓ．ｎ＝４．ＯＤ值）
ａｌｌｏ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｒａｆｔｓ：
ｇｒａｆｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒ——ｉｎｇ ｆｏｒ ＧＶＨＤ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ［Ｊ］．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９９９，２３：１０７ｌ～１０７９．
【４】Ｓｚａｂｏｌｃｓ Ｐ，Ｐａｒｋ ＫＤ，Ｍａｒｔｉ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ
ａｌｌｏ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｄ
ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄｂｌｏｏｄ ｇｒａｆｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ
ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一２ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ［Ｊ】．Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００４，１０：７７２～７８３．
【５】Ｎｅｗ ＪＹ，Ｃｈａｎ ＳＨ，Ｙａｐ ＥＨ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｇｒａｆｔ—
ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ Ｔ ｃｅｉｌｓ ｔｈａｔ ｄｏ ｎｏｔ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ［ＪＪ，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，２００４，１２６：８２８～
８３６．
６８ 中外医疗ＣＨＩＮＡ ＦＯＲＥＩＧＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ
2024年5月16日发(作者：安全)
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选择性去除表达Ｃ Ｄ ２ ５＋、Ｃ Ｄ ６ ９＋的同种异体反应Ｔ细胞
的实验研究
柴忆欢邱慧英徐杰
苏州２１ ５００３） （苏州大学附属儿童医院血液病科
【摘要】目的 探讨体外选择性去除表达ＣＤ２５ ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞协调移植物抗宿主病和移植物抗肿瘤的可能性。方
法流式细胞仪检测初次单向混合淋巴细胞反应ＣＤ２５ ，ＣＤ６９ 表述情况，磁性细胞分离系统在细胞表达高峰去除ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋同
种异体反应Ｔ细胞。Ｍ１Ｔ法在各时同点检测不同抗原组再次混合淋巴细胞反应的细胞增殖情况。结果再次单向混合淋巴细胞反应显
示明显降低了对橱同刺激原的反应性（４８．８２±１３．７Ｄ％，保留大部分对无关刺激原的反应性（６５．４７±９．８４ 和肿瘤刺激原的反应性（６４．
８３±３．６５）％。结论体外选择性去除表达ＣＤ２５ ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞可以协调移植物抗宿主病和移植物抗肿瘤。
【关键词ｌ移植物抗宿主病 ＣＤ２５ ＣＤ６９ Ｔ细胞去除
【中图分类号】Ｒ ３ ９ ２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７４－０７４２（２００８）０Ｉ（ｃ）－００６７－０２
Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｉｌｓ ｂａｓｅｄ ０ｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ＣＤ２５＋ａｎｄ ＣＤ６９＋
ＣＨＡＩ Ｙｉｈｕｍ ＱＩＵ Ｈｕｉｙｉｎｇ ＸＵ Ｊｉｅ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨｅｍａｔｏｌｏｇｙＡｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
Ｓｏｏｃｈｏｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｓｕｚｈｏｕ２１５００３．ＣＨＩＮＡ
．
。
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｈｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２５＋ａｎｄ
ＣＤ６９＋ｔｏ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｇｒａｆｔ—ｖｅｒｓｕｓ—ｈ０ｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ（ＧＶＨＤ）ａｎｄ ｇｒａｆｔ—ｖｅｒｓｕｓ—ｔｕｍ０ｒ（ＧＶＴ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ＣＤ２５＋ａｎｄ
ＣＤ６９＋ｉｎ ｆｉｒｓｔ ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ（ＭＬＣ）ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＡＩＩｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｙｍｐｈｅｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｄ ｂｙ ｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ＣＤ２５＋ａｎｄ ＣＤ６９＋，ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｍｏｖｅｄ ｂｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）．Ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＭＬＣ
Ｓａｍｐｌｅｓ ｗａ￥ａｓｓａｙｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ｂｙ Ｍ１Ｔ．Ｒｅｓｕｌｓ Ｍｉｘｅｄ ｌｔｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｓｓａｙｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｌｅｄ ｔｏ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｌｌｏ－－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌｓ ４８‘８２±ｌ３・７１％．ｗｈｉｃｈ ａｔ ｔｈｅ Ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ
ｔｈｉｒｄｐａｒｔｙ ｃｅｌｌｓ ６５．４７±９．８４％ａｎｄ ａｎｔｉ－－ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ６４．８３±３．６５％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｓｏｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｌＩｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ＣＤ２５＋ａｎｄ ＣＤ６９＋ｃａｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ＧＶＨＤ ａｎｄ ＧＶＴ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｇｒａｆｔ－－ｖｅｒｓｕｓ－－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ＣＤ２５ ＣＤ６９ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ
同种异体造血千细胞移植（ 山０侧后受者体内可发生一系列免
（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）、流式细胞仪（ＦＡＣＳＣａｎ）。
疫反应，移植排斥、移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）和移植物抗白血病
（ＧＶＬ）。ＧＶＨＤ是主要并发症，而ＧＶＬ却是需要的。目前人们已经意
２实验方法
２．１初次单向混合淋巴细胞反应
识到某些Ｔ细胞亚群可以识别白血病细胞和正常细胞，在同种异体造
血干细胞移植和供者淋巴细胞输注后可以不发生ＧＶＨＤ而保留ＧＶＬ
的作用。我们以表达ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞为靶细
胞，探讨体外选择性去除同种异体反应Ｔ细胞协调移植物抗宿主病和
移植物抗肿瘤的可能性。
１材料与方法
１．２实验材料
取Ｃ５７ＢＬ／６Ｈ＋２ｂ小鼠脾脏，无菌制备脾细胞悬液。常规分离单
个核淋巴细胞，调整细胞数为５．０×１０６个／ｍｌ，台盼蓝染色计算细胞
活性＞９５％，作为反应细胞备用。同样方法收集ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾单个
核淋巴细胞，按终浓度２５ ｕ ｇ／ｔａｌＯｎ入丝裂霉素Ｃ，３７＂Ｃ、５％Ｃ０，，培
养４５ｒａｉｎ，作为刺激细胞。实验分组：（１）反应细胞组ｌ（２）刺激细胞组；
（３）反应细胞＋刺激细胞组。３７＂Ｃ、５％ＣＯ，，２４孔板ＲＰＭＬ一１６４０完
全培养液培养５ｄ。每孔加入刺激细胞和／或反应细胞各２．０×１０５个，
培养终体积为１０００ ｕ Ｉｏ不同时间点取培养细胞，采用直接免疫荧光标
清洁级Ｃ５７ＢＬ／６Ｈ－２ｂ（６～ｌ０周，雄性）小鼠、
记法，通过流式细胞仪检测样本中ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 阳性的表达率。
以０ｈＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的表达为正常值。
２．２再次单向混合淋巴细胞反应
１．１．１实验动物
ＢＡＬＢ／ｃＨ一２ｄ（６－１０周，雌性）小鼠、ＤＢＡＨ一２ｋ（６－１０周，雌性）小鼠
（由上海实验动物中心提供）。
１．１．２ ＳＰ２／Ｏ细胞株ＢＡＬＢ／ｃＨ一２ｄ来源骨髓瘤细胞，购于美国
应用抗ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 单克隆抗体联合免疫磁珠在磁场细胞分
离系统选择性去除表达ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞获得
阴性表达细胞作为反应细胞。细胞收集时间根据ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 表
ＡＴＣＣ公司，由苏州大学免疫实验室常规传代培养。
１．１．３主要试剂及仪器Ｍ ｒ（ＳＩＧＭＡ公司）ｌ抗ＦＩＴＣ磁珠、ＦＩＴＣ—
达率情况决定。分离步骤参照说明书进行。刺激细胞包括相同抗原、无
关抗原、肿瘤抗原刺激组刺激细胞。采用丝裂霉素Ｃ制备刺激细胞的
方法同上。实验分组：（１）阴性细胞＋相同抗原刺激组；（２）阴性细胞＋
ａｎｔｉ～ＣＤ６９、ＦＩＴＣ—ａｎｔｉ—ＣＤ２５及相应同型免疫球蛋白阴性对照单克
隆抗体（美国ｅＢｉｏ—ｓｃｉ ｅｎｃｅ公司产品）ｌ磁场细胞分离系统
ＣＨＩＮＡ ＦＯＲＥＩＧＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ中外医疗 ６７
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无关抗原刺激组；（３）阴性细胞＋肿瘤抗原刺激组；（４）混合淋巴细胞＋
效应Ｉ Ｉ。这些实验结果提示根据活化细胞特异性抗原去除活化Ｔ细胞
相同抗原刺激组；（５）混合淋巴细胞＋无关抗原刺激组；（６）混合淋巴细 是目前较为成功的减轻ＧＶＨＤ保留ＧＶＬ途径。
胞＋肿瘤抗原刺激组。（１）～（３）组为处理组，阴性细胞为反应细胞；（４）～
（６）组为对照组，相同条件下初次单向混合淋巴细胞反应的细胞为反应
面活化抗原ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋的表达情况，以了解Ｔ细胞识同种异基因
细胞。３７℃、５％ＣＯ２条件，９６孔板ＲＰＭＬ—ｌ６４０完全培养液培养
抗原的一般活化规律；通过磁场细胞分离系统去除表达ＣＤ２５ 、ＣＤ６９
５ｄ。每孔中刺激细胞和反应细胞各２．０×１０４个，培养终体积为１５０
的同种异体反应Ｔ细胞以获得阴性细胞；通过ＭＴＴ法在不同时间点检测
ｌ，均设三个平行孔。 再次单向混合淋巴细胞反应的细胞增殖情况以了解阴性细胞对相同抗原
２．３ ＭＴＴ法检测
刺激组，无关抗原刺激组，肿瘤抗原刺激组的反应性。Ｍｎ检测值显示，
在培养的第ｌ、２、３、４、５天收获细胞行ＭＴＴ法检测。每 阴性细胞在再次单向混合淋巴细胞反应体系里明显降低了对相同抗原刺
孔加入ＭＴＴ ｌ０ ｌ，在３７℃，５％ＣＯ２培养箱培养４～６ ｈ；每孔加入 激组反应性（４８．８２±１３．７１ ，保留了大部分对无关抗原刺激组反应性
１５０ ｌ的ＤＭＳＯ，酶联免疫检测仪波长５７０ ＤｉＴＩ上检测ＯＤ值。 （６５．４７±９．８４）％和肿瘤刺激原的反应性（６４．８３±３．６５）％。实验结果
３统计学处理
与相关文献报道结果相似１４ｌ。考虑到某一特定的活化抗原并非表达于
计量数据以均数±标准差（又±ｓ）表示，ＣＳ２０００软件统计包处理，
所有的同种异体反应Ｔ细胞，而且不同的活化抗原并非同时表达于所
Ｐ＜０．０５为差异有显著意义。
有的同种异体反应Ｔ细胞［４１，本实验以二种活化抗原ＣＤ２５ 、ＣＤ６９
４结果
为靶抗原，提高细胞的清除率。ＣＤ２５ 是ＩＬ一２受体的ａ链，在活化Ｔ
４．１ 初次单向混合淋巴细胞反应ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 表达正常情况下也 细胞上表达上调，是活化Ｔ淋巴细胞的标志。ＣＤ６９ 是Ｔ淋巴细胞激
存在ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的表达，分别为（５．９±２．１）％，（２．４±０．２ ；
活后最早表达的表面抗原，当其表达后，可作为共刺激信号促进Ｔ细胞
ＣＤ６９ 在第４８小时达到峰值（２１．５±１．１ ，第７２小时下降至（１１．９±
进一步活化和增殖。同时考虑到某些同种异体反应Ｔ细胞在刺激抗原
０ ９）％；ＣＤ２５ 在第７２小时达到峰值（５６．４±３．４）％；在第１２０小时，
持续存在的情况下可以 对抗原刺激组的无反应转变为有反应 ，故本
ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的表达率分别下降为（４４．４±５．４）％、（６．６±１．２）％。 实验采用在不同时间点检测各反应组的Ｍ１ｖｒ值，更全面更完整地评估
４．２再次单向混合淋巴细胞反应的细胞增殖见表ｌ 细胞间的相互反应情况，这是与以往实验的不同之处。结果提示，体外
ＭＴＴ法检测相同抗原刺激的反应性为（４８．８２±１３．７１）％，按时 选择性去除表达ＣＤ２５ 、ＣＤ６９ 的同种异体反应Ｔ细胞可以减少对
间顺序分别为２９．０２％、６４．１７％、５８．３４％、４９．４６％、４３．１１％ｌ无关
相同抗原刺激组的反应性，保留大部分对无关抗原刺激组和特异肿瘤
抗原刺激组的反应性为（６５．４７±９．８４）０／ｏ，按时间顺序分别为６６．５６％、 抗原刺激组的反应性，这一方法为临床上协调ＧＶＨＤ和ＧＶＬ提供了
７５．６９％、４９．６１％、７０．９２％、６４．５９％ｌ肿瘤抗原刺激组反应性为（６４．
一
定的实验基础。
８３±３．６５）％，按时间顺序分别为６１．５０％、６１．１４％、６４．３３％、６８． 参考文献
６２％、６８．５５％。（Ｄｌ～Ｄ５为反应第ｌ～５天）。
【ｌ１ Ｋｏｈ ＭＢ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ ＨＧ，Ｃｏｒｂｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ
５讨论
Ｔ－ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｕｌｌｙ
采用全Ｔ细胞去除基本能阻止ＧＶＨＤ发生；但为了保留ＧＶＬ与抗
ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｇｒａｆｔ—ｖｅｒｓｕｓ～
病毒效应，学者们选择性去除同种异体反应Ｔ细胞、诱导同种异体反
ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｐｈｙ——ｌａｘｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐ［ｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ
应Ｔ细胞无能等方法１ Ｉ。活化Ｔ细胞可表达特异性抗原，抗原的表
ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｂｒ Ｊ＝Ｈａｅｍａｔｏｌ，２００２，ｌ１８：１０８～ｌｌ６．
达上调引发Ｔ细胞增殖，并导致ＩＬ一２、ＩＦＮ—ｖ等细胞因子分泌增
【２】Ｈａｒｔｗｉｇ Ｕ，Ｒｏｂｂｅｒｓ Ｍ，Ｗｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ，Ｍｕｒｉｎｅ
多，与ＧＶＨＤ病理生理密切相关。通过在体外将患者细胞和供者细胞
ａｃｕｔｅ ｇｒａＲ－ｖｅｒｓｕｓ—ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｎ ｂｅ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｄｅｐｌｅ—
混合培养，以激活供者同种反应细胞，根据活化Ｔ细胞表达的特异性标
ｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌＯ—ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎ－
志分子，用这些分子的特异性抗体来选择性去除同种反应细胞，这种方
ｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ［Ｊ】．Ｂｌｏｏｄ，２００２，１００：３７５～３８２．
法似乎可以选择性地去除同种反应Ｔ细胞，而不影响ＧＶＬ和抗病毒的
【３】Ｋｏｈ ＭＢ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ ＨＧ，Ｌｏｗｄｅｌｌ ＭＷ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ
表１ 再次单向混合淋巴细胞反应的细胞增殖（又±ｓ．ｎ＝４．ＯＤ值）
ａｌｌｏ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｒａｆｔｓ：
ｇｒａｆｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒ——ｉｎｇ ｆｏｒ ＧＶＨＤ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ［Ｊ］．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９９９，２３：１０７ｌ～１０７９．
【４】Ｓｚａｂｏｌｃｓ Ｐ，Ｐａｒｋ ＫＤ，Ｍａｒｔｉ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ
ａｌｌｏ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｄ
ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄｂｌｏｏｄ ｇｒａｆｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ
ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一２ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ［Ｊ】．Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００４，１０：７７２～７８３．
【５】Ｎｅｗ ＪＹ，Ｃｈａｎ ＳＨ，Ｙａｐ ＥＨ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｇｒａｆｔ—
ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ Ｔ ｃｅｉｌｓ ｔｈａｔ ｄｏ ｎｏｔ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ［ＪＪ，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，２００４，１２６：８２８～
８３６．
６８ 中外医疗ＣＨＩＮＡ ＦＯＲＥＩＧＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ